ChIRP 是一种新颖且快速的技术，用于绘制长链非编码 RNA（lncRNA）的基因组结合位点。该方法利用反义拼接寡核苷酸的特异性，实现对 lncRNA 结合基因组位点的鉴定与分析。
本文内容
摘要
摘要
长链非编码RNA是剂量补偿、基因印记和发育相关基因表达等重要生物学过程中染色质状态的关键调控因子1,2,3,4,5,6,7。最近研究发现，数千种长链非编码RNA与特定的染色质修饰复合物相关联，例如介导组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）的多梳抑制复合物2（PRC2），这提示大量长链非编码RNA在基因特异性地调控染色质状态方面具有广泛作用8,9。某些长链非编码RNA被认为以顺式作用方式调控邻近基因，而另一些则以反式作用方式调控远端基因。例如，Drosophila中的长链非编码RNA roX1和roX2可结合雄性细胞X染色体上的多个区域，在剂量补偿过程中发挥关键作用10,11。然而，它们的结合位点尚缺乏高分辨率的精确定位。类似地，人类长链非编码RNA HOTAIR可在全基因组范围内影响数百个基因上PRC2的占据，但其特异性调控机制仍不清楚3,12,13。长链非编码RNA还可作为模块化支架，招募多种蛋白质复合物的组装。经典的反式作用RNA支架是TERC RNA，它作为端粒酶复合物的模板和结构支架14；HOTAIR也可作为PRC2和H3K4去甲基化酶复合物的支架分子13。
以往针对染色质上RNA占据位点的研究已提供了大量重要信息15,16，但这些研究仅限于单个基因位点。大多数长链非编码RNA（lncRNA）的占据位点尚不清楚，而lncRNA在染色质调控中的作用也主要基于lncRNA扰动后的间接效应推断而来。正如染色质免疫沉淀联合微阵列或深度测序技术（分别称为ChIP-chip或ChIP-seq）极大地促进了我们对基因组尺度上蛋白质-DNA相互作用的理解，本文介绍了一种近期发表的高分辨率全基因组长链RNA占据位点作图策略17。该方法名为RNA纯化介导的染色质分离（Chromatin Isolation by RNA Purification, ChIRP）（图1），其原理是利用覆盖式设计的反义寡核苷酸探针，亲和捕获目标lncRNA及其结合的染色质复合物，从而以数百个碱基的分辨率、高灵敏度和低背景信号生成基因组结合位点图谱。由于该方法仅需已知RNA序列即可设计亲和探针，无需了解RNA的结构或功能结构域，因此适用于多种lncRNA。
方案
1. 探针设计
设计反义DNA平铺探针，通过ChIRP选择性富集RNA靶标。
- 使用 singlemoleculefish.com 上的在线探针设计工具设计反义寡核苷酸探针18。
- 采用以下参数：探针数量 = 每 100 bp RNA 长度使用 1 个探针；2) 目标 GC% = 45；3) 寡核苷酸长度 = 20；4) 间隔长度 = 60–80。若 RNA 过长无法由设计工具处理，可将其分割为多个片段。排除重复区域或高度同源的区域。
- 订购在 3' 端标记 BiotinTEG 的反义 DNA 探针。
- 根据探针在 RNA 上的位置对其进行标记，并将其分为两个探针池：“偶数”池包含编号为 2、4、6 等的所有探针，“奇数”池包含编号为 1、3、5 等的所有探针。将探针池稀释至 100 μM 浓度，并于 -20 °C 保存。
- 所有实验均需同时使用这两个探针池，二者互为内部对照。真实的依赖于 RNA 的信号应在这两个池中均存在，而探针特异性的背景噪声则仅存在于各自的探针池中。此原则适用于 ChIRP-qPCR 和 ChIRP-seq 两种实验。
2. 收获细胞
收集将用于ChIRP实验的细胞。
- 在组织培养板或培养瓶中将细胞培养至汇合。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，进行胰蛋白酶消化。用含血清的培养基终止胰蛋白酶反应。 >加入两倍体积的培养基，用移液器反复吹打以脱离细胞并重悬为单细胞悬液。将全部培养基和重悬的细胞转移至50 ml Falcon离心管中。通常每份ChIRP样品需要2000万个细胞。
- 以800RCF离心细胞4分钟。吸除上清液，并将4000万个细胞重悬于40 ml PBS中，必要时合并离心管。以800RCF离心细胞4分钟。弃去PBS，小心倾斜离心管以吸除残留液体。
3. 交联细胞并收集细胞沉淀
使用戊二醛交联收集的细胞，以保存RNA-染色质相互作用，并制备细胞沉淀。
- 所有步骤均在室温下进行。
- 用室温 PBS 配制 1% 戊二醛溶液，每 1000 万细胞准备 10 ml（0.4 ml 25% 戊二醛原液 + 9.6 ml PBS）。戊二醛必须现配现用。
- 轻敲 Falcon 管底部以松动细胞沉淀。先加入少量 1% 戊二醛重悬细胞沉淀，避免结块，再补足至最终体积。颠倒混匀。在室温下，于端对端摇床或旋转仪上交联 10 分钟。
- 加入终体积 1/10 的 1.25 M 甘氨酸，在室温下淬灭交联反应 5 分钟。
- 以 2000RCF 离心 5 分钟。吸除上清液，并用 20 ml 冷却的 PBS 洗涤沉淀一次，于 2000RCF 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，按每 2000 万细胞加入 1 ml 冷却的 PBS 重悬洗涤后的交联沉淀。每毫升转移至一个 Eppendorf 管中，于 4 °C 以 2000RCF 离心 3 分钟。用移液器吸头小心尽可能去除 PBS。
- 用液氮速冻细胞沉淀，并于 -80 °C 长期保存。
4. 细胞裂解
裂解交联的细胞以制备细胞裂解液。
- 室温下解冻冷冻的细胞沉淀。用力轻敲以松动并混匀细胞沉淀。在2000RCF下离心3分钟，使细胞沉淀沉降 4 °C. 使用锋利的 10 μl 移除残留的 PBS。
- 在电子天平（精确至1 mg）上，去皮空离心管的质量（我们的离心管质量非常稳定，约为1.060克）。称量每个沉淀物并记录其重量。一个15 cm培养皿的交联HeLa细胞沉淀通常重约100 mg。
- 补充裂解缓冲液（缓冲液体积为沉淀物质量的10倍，例如100 mg沉淀物加入1 ml缓冲液），并加入新鲜的蛋白酶抑制剂、PMSF和Superase-in（参见附带的缓冲液列表）。充分混匀。
- 加入10倍体积的含添加剂的裂解缓冲液至各管中，重悬沉淀。对于较小的沉淀 <25 mg，重悬于 250 μl 补充裂解缓冲液。悬浮液应均匀。若不均匀，将悬浮液分装至 500 μl 分装后立即使用电动研磨仪破碎团块，并立即进行超声处理。
5. 超声处理
通过超声处理交联的细胞裂解液来剪切DNA。
- 在15 ml Falcon管中使用Bioruptor超声破碎细胞裂解液。使用 <每管加入1.5 ml裂解液，为加快超声处理速度，每次超声处理不超过两管。
- 在超声波破碎仪中进行超声处理 4 °C 水浴设置为最高功率，采用开启30秒、关闭45秒的脉冲间隔。每30分钟检查一次裂解液。持续超声处理，直至细胞裂解液不再浑浊。该过程可能短至30分钟，也可能长达4小时。试管数量、样品体积、水浴温度以及超声时间均会影响处理所需时长。不同试管的超声效率可能存在差异，因此建议每30分钟将所有样品混合均匀后重新分装至原试管，以确保均一性。注意：与甲醛交联的细胞相比，经戊二醛交联的细胞需要更长的超声时间。
- 当裂解液变澄清时，转移 5 μL 将裂解液转移至新的离心管中。加入 90 μL DNA 蛋白酶K（PK）缓冲液（参见缓冲液列表）和 5 μL PK。涡旋混匀，短暂离心。37 °C 下孵育 45 分钟 50 °C.
- 使用Qiagen PCR纯化试剂盒提取DNA。用洗脱液洗脱DNA 30 μL 使用Qiagen洗脱缓冲液（EB）洗脱DNA，并在1%琼脂糖凝胶上检测DNA片段大小。若DNA弥散条带主要集中于100–500 bp，则表明超声破碎已完成；否则需继续进行超声处理。
- 将超声处理后的样品在16100RCF下离心10分钟 4 °C. 合并上清液，分装为每份1 mL，于液氮中速冻。储存于-80 °C.
6. ChIRP
将生物素标记的DNA探针与RNA杂交，并分离结合的染色质。
- 室温下解冻染色质管。
- 制备杂交缓冲液（参见缓冲液列表，每毫升染色质制备2 ml）。涡旋混匀。
- 对于使用1 ml裂解液的典型ChIRP样品，移除 10 μL 用于RNA输入和 10 μL 用于DNA上样，置于Eppendorf管中，冰上保存备用。
- 将1 mL染色质转移至15 mL Falcon管中。向每管中加入2 mL杂交缓冲液。总体积 <1.5 ml，使用 Eppendorf 管。
- 室温下解冻探针。若长时间未使用，可用Nanodrop检测探针用量（100 μM 探针应特异性结合约500-600 ngμl 使用单链DNA条件）。将适量探针加入特定离心管中（每1 mL染色质加入100 pmol探针， 1 μL 100 pmol/μL 每1 mL染色质加入探针。充分混匀。置于 37 °C 振荡孵育4小时。
- 杂交剩余20分钟时，准备C-1磁珠（储存于 4 °C）。使用 100 μL 每100 pmol探针，用1 mL未添加补充物的裂解缓冲液洗涤三次，使用DynaMag-2磁力架分离磁珠与缓冲液。
- 将珠子重悬于原始体积的裂解缓冲液中；补充新鲜的PMSF、蛋白酶抑制剂（P.I）和Superase-in。4小时杂交反应完成后，加入 100 μL 将珠子加入各管中。充分混匀。在指定温度下孵育 37 °C 振荡孵育30分钟。
- 配制洗涤缓冲液（每份样品5 mL）。涡旋混匀。预热至 37 °C使用前加入PMSF。
- 用洗涤缓冲液以1 mL体积洗涤磁珠，共洗涤五次。第一次洗涤时，使用DynaMag-15磁力架分离磁珠，倾去上清，再将磁珠重悬于1 mL洗涤缓冲液中。将液体转移至1.5 mL Eppendorf管中。孵育于 37 °C 振荡5分钟。
- 在后续的洗涤步骤中，将每管样品在小型离心机上离心，然后将样品置于 DynaMag-2 磁力架上静置 1 分钟。弃上清，用 Kimwipe 擦去残留液滴，加入 1 mL 洗涤缓冲液重悬。孵育于 37 °C 振荡5分钟。重复上述步骤，共洗涤5次。
- 最后一次洗涤后，充分重悬珠子。移除 100 μL 并留置用于RNA提取。保留 900 μL 用于DNA组分。将所有离心管置于DynaMag-2磁力架上，移除洗涤缓冲液。短暂离心所有离心管，然后放回磁力架。用尖头吸头彻底去除残留的少量洗涤缓冲液 10 μl 移液器吸头
7. RNA 提取
从 ChIRP 样品中提取 RNA 组分，通过 qRT-PCR 进行定量。
- 取 100 μL 珠子样品和 10 μL RNA 输入样品。添加 85 μL 将RNA PK缓冲液（pH 7.0）加入RNA INPUT中。重悬磁珠 95 μL RNA PK缓冲液 pH 7.0。添加 5 μL 蛋白酶K，孵育于 50 °C 以末端至末端振荡方式孵育45分钟。
- 短暂离心所有离心管，并将样品置于加热块上煮沸10分钟 95 °C.
- 将样品置于冰上冷却，加入 500 μL TRIzol，剧烈涡旋振荡10秒。室温孵育10分钟。储存于-80 °C 或进入步骤4。
- 添加 100 μL 氯仿加入经TRIzol处理的样品中。剧烈涡旋振荡10秒。在台式离心机中以16100RCF于4℃离心15分钟 4 °C.
- 移除 ~400 μL 水相上清液，避免有机相和界面层。
- 添加 600 μL (1.5 倍体积) 100% 乙醇，充分混匀。将样品通过 MIRNeasy mini 柱离心。按照生产商说明书，用 RWT（MIRNeasy mini 试剂盒）洗涤 1 次，再用 RPE 洗涤 2 次。用洗脱液洗脱 30 μL 无核酸酶 H2O (nfH2O)
- 用DNA酶处理RNA洗脱液自由 按照制造商方案进行。反应完成后，将样品在 65 °C 以完全灭活任何残留的DNase。
- 使用 1 μL 每孔提取RNA用于qRT-PCR分析，以确认lncRNA的回收效果。GAPDH常作为阴性对照。
8. DNA 提取
从ChIRP样品中提取DNA组分，用于测序鉴定或qPCR定量。
- 准备DNA洗脱缓冲液（见缓冲液列表），每个样品150 μl，包括DNA INPUT。
- 每毫升DNA洗脱缓冲液中加入10 μL RNase A（10 mg/mL）和10 μL RNase H（10 U/μL），涡旋混匀。
- 用含RNase的150 μL DNA洗脱缓冲液重悬各珠子样品（DNA INPUT用140 μL重悬）。在37 °C下振荡孵育30分钟。
- 将珠子和上清液在DynaMag-2磁力架上分离。收集上清液并转移至已标记的离心管中。
- 按照步骤8.2的方法，配制第二份含10 μL RNase A（10 mg/mL）和RNase H（10 U/μL）的DNA洗脱缓冲液。向每个样品（包括DNA INPUT）加入150 μL，孵育后收集上清液。合并所有上清液（总体积约为300 μL）。
- 向每个样品中加入15 μL蛋白酶K（PK）。在50 °C下振荡孵育45分钟。
- 预先对黄色相分离胶管（5PRIME）进行短暂离心。将DNA样品转移至相分离胶管中，每管加入300 μL酚:氯仿:异戊醇（PhOH:Chloroform:Isoamyl）。剧烈振荡10分钟，然后在台式离心机中以16100RCF于4 °C离心5分钟。吸取上层水相（约300 μL）。每管加入3 μL GlycoBlue、30 μL乙酸钠（NaOAc）和900 μL 100%乙醇（EtOH）。充分混匀后于-20 °C过夜沉淀。
- 在4 °C下以16100RCF离心30分钟。
- 小心弃去上清液。加入1 mL 70%乙醇（EtOH），涡旋混匀。以16100RCF离心5分钟。用移液器吸除上清液。室温空气干燥1分钟。用30 μL EB缓冲液重悬DNA沉淀。
- DNA样品可直接用于qPCR分析，或按照Illumina操作流程制备高通量测序文库。
10. 代表性结果
图1展示了ChIRP实验流程。一次成功的ChIRP实验通常能够显著富集目标RNA，而非特异性RNA则富集程度较低。图2显示了从HeLa细胞中富集人端粒酶RNA（TERC）的结果，以细胞中丰度较高的GAPDH RNA作为阴性对照。通过ChIRP实验，细胞中大部分TERC RNA（约88%）被拉下，而仅0.46%的GAPDH RNA被回收，表明富集倍数约为200倍。非特异性探针（如靶向在哺乳动物细胞中不表达的LacZ RNA的探针）（图2）可作为额外的阴性对照使用。
通过qPCR检测时，预期与目标lncRNA结合的DNA区域通常比阴性区域富集程度更高。图3展示了在原代人包皮成纤维细胞中通过ChIRP-seq鉴定出的四个HOTAIR结合位点的qPCR验证结果，这些位点在相同细胞系中被确定，而TERC和GAPDH的DNA位点作为阴性对照区域。“偶数”和“奇数”探针组均显示出预期的HOTAIR结合位点相对于阴性区域的相似富集程度，这是真正的lncRNA结合位点的典型特征。
通过高通量测序分析ChIRP富集的DNA，可获得lncRNA结合位点的全基因组图谱。Drosophila中的lncRNA roX2已知以剂量补偿所必需的方式与X染色体相互作用。图4展示了roX2在X染色体某区段上的结合图谱。已对“偶数”和“奇数”样本进行测序，并去除了各自的独特噪声，从而生成了重叠信号的轨迹。此处每个“峰”代表一个较强的roX2结合位点。完整的轨迹及roX2靶基因列表已在Chu et al. 2011 17中详细描述。
图1. ChIRP 实验流程图。染色质与长链非编码 RNA-蛋白质复合物发生交联 体内 生物素标记的平铺探针与靶向lncRNA杂交，使用磁性链霉亲和素珠纯化染色质复合物，并进行严格洗涤。通过Rnase A和H的混合酶解体系洗脱与lncRNA结合的DNA或蛋白质。推测的lncRNA结合序列以橙色示意图表示。先前发表于Chu 等 2011.17
图2。 ChIRP富集人TERC RNA。TERC-asDNA探针可回收约88%的细胞内TERC RNA，而GAPDH RNA则无法检测到。LacZ-asDNA探针作为阴性对照，对两种RNA均无回收。图中显示均值±标准差。此前发表于Chu et al. 201117。
图3. 人包皮成纤维细胞中 HOTAIR ChIRP-qPCR 实验 NFKBIA、HOXD3-4、SERINC5 和 ABCA2 是与HOTAIR相互作用的区域。 TERC 和 GAPDH 作为阴性对照。数据显示为均值 ± 标准差。先前发表于 Chu 等 2011.17
图4. Sl2细胞中roX2 RNA的ChIRP-seq数据 果蝇 细胞。“偶数”和“奇数”样本分别进行测序；其数据合并后仅显示两者共有的峰。图中展示的是合并后的轨迹。先前发表于 Chu 等 2011.17
讨论
本文介绍了ChIRP-seq技术，这是一种用于全基因组范围内绘制in vivo长链非编码RNA（lncRNA）结合位点的方法。成功的关键参数包括分池设计的覆盖式寡核苷酸探针以及戊二醛交联。只要已知RNA序列，亲和探针的设计就十分直接，无需预先了解该RNA的结构或功能结构域。我们在两种物种中的三种差异较大的RNA——roX2、TERC和HOTAIR上的成功应用表明，ChIRP-seq很可能适用于众多lncRNA。与所有实验一样，必须谨慎操作并设置适当的对照，才能正确解读实验结果。不同的lncRNA可能需要对实验条件进行滴定优化，合理调整条件（例如选择不同的亲和探针或交联剂）可能揭示RNA-染色质相互作用的不同层面。与ChIP-seq类似，并非所有的结合事件都必然具有功能意义，尚需进一步研究以明确RNA在染色质上占据的生物学后果。尽管如此，我们预计该技术将为目前已知数以千计的染色质相关lncRNA研究者带来许多有趣的应用前景8,9。正如ChIP-seq开启了全基因组水平上DNA-蛋白质相互作用研究的大门，ChIRP-seq对“RNA互作组”的研究或许将揭示出大量全新的生物学通路。
披露
C. Chu 和 H.Y. Chang 被列为基于该方法的专利申请的发明人。
致谢
感谢 T. Hung、MC. Tsai、O. Manor、E. Segal、M. Kuroda、T. Swigut 和 I. Shestopalov 的讨论与建议。本研究由新加坡科技研究局（C.C.）、美国国立卫生研究院 R01-CA118750 和 R01-HG004361 基金（H.Y.C.）以及加州再生医学研究所（H.Y.C.）资助。H.Y.C. 是霍华德·休斯医学研究所的早期职业科学家。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 缓冲液列表： | |||
| 将一管完全蛋白酶抑制剂溶于1 ml水中，配制成50倍浓缩液。用异丙醇配制100 mM PMSF溶液（100倍浓缩液）。Superase-in按200倍浓缩液使用。所有试剂均于-20℃保存。 °C. | |||
| 裂解缓冲液： | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 10 mM EDTA 1% SDS 使用前（洗涤磁珠时除外）务必新鲜添加PMSF、蛋白酶抑制剂（P.I.）和Superase-in | |||
| 蛋白酶K缓冲液（用于DNA） | |||
| 100 mM NaCl 10 mM TrisCl pH 8.0（用于RNA时使用pH 7.0） 1 mM EDTA 0.5% SDS 使用前新鲜加入体积分数为5%的蛋白酶K（Ambion AM2546，20 mg/ml） | |||
| 杂交缓冲液 | |||
| 750 mM NaCl 1% SDS 50 mM Tris-Cl pH 7.0 1 mM EDTA 15% 甲酰胺（避光保存于4℃） °C) 使用前务必新鲜添加 PMSF、P.I. 和 Superase-in | |||
| 洗涤缓冲液 | |||
| 2×氯化钠-柠檬酸钠溶液（SSC）（由20× SSC Invitrogen储备液稀释而成） 0.5% SDS 使用前务必新鲜添加 PMSF | |||
| DNA 洗脱缓冲液 | |||
| 50 mM NaHCO3 1% SDS | |||
| 特定试剂与设备表： | |||
| 戊二醛（电子显微镜级） | Sigma-Aldrich | G5882-10x10ml | |
| 电动离心管混匀器 | VWR 国际 | V8185-904 | |
| 蛋白酶抑制剂 | 罗氏集团 | 11873580001 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Superase-in | Ambion | AM2696 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Falcon管（用于超声处理） | 康宁 | 430790 | |
| 蛋白酶K | Ambion | AM2546 | |
| PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28106 | |
| C-1磁珠 | Invitrogen | 65002 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-25G | |
| DynaMag-15 磁力架 | Invitrogen | 123-01D | |
| DynaMag-2 磁力架 | Invitrogen | 123-21D | |
| MIRNeasy mini试剂盒 | Qiagen | 217004 | |
| RNase H | Epicentre Biotechnologies | R0601K | |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| 重相锁胶 | 5 端 | 2302810 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| 苯酚:氯仿:异戊醇 | Invitrogen | 15593-031 | |
| 氯仿 | Ricca | RSOC0020-1C | |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| 甘氨酸 | JT Baker | 4057-06 | |
| PBS，pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 | |
| 洗脱缓冲液（EB） | Qiagen | 19086 | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| 10% SDS | Invitrogen | 15553-027 | |
| DNA-免费 | Ambion | AM1906 | |
| 缓冲液试剂盒 | Ambion | AM9010 | |
| 甲酰胺 | Invitrogen | 15515-026 |
参考文献
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