Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

1. Sonda de Diseño

Diseño anti-sentido ADN embaldosado sondas para la recuperación selectiva del ARN diana por Chirp.

1. Diseño anti-sentido sondas de oligonucleótidos mediante el diseñador de la sonda en línea en singlemoleculefish.com ^18.
2. Utilice los siguientes parámetros: número de sondas = 1 sonda / 100 pb de longitud ARN, 2) el objetivo% GC = 45, 3) longitud del oligonucleótido = 20, 4) de longitud Espacio = 60-80. Romper el ARN en segmentos, si es demasiado larga para el diseñador. Omitir las regiones de repeticiones o extensa homología.
3. Orden anti-sentido sondas de ADN con BiotinTEG a las 3 de alto riesgo extremo.
4. Sondas de etiqueta de acuerdo con sus posiciones a lo largo del ARN. Separarlos en dos grupos para que el "par" de piscina contiene todas las sondas de numeración 2, 4, 6, etc, y el "extraño" de piscina contiene sondas de numeración 1, 3, 5, etc Diluir grupo de sondas a la concentración mM 100 y almacenar a -20 ° C.
5. Todos los experimentos se realizaron utilizandoambos grupos, que sirven como controles internos para los demás. Real RNA-dependiente de la señal estará presente en las dos piscinas, mientras que la sonda específicos de ruidos será único para cada piscina. Esto se aplica tanto para CHIRP-qPCR y CHIRP ss.

2. Las células de la cosecha

Recoger las células que serán usadas en el experimento CHIRP.

1. Se cultivan las células en placas de cultivo de tejidos o frascos a la confluencia. Enjuague con tampón fosfato salino (PBS) de una vez trypsinize. Apaga la tripsina con un volumen de> 2 veces los medios de comunicación, la pipeta hacia arriba y abajo para separar las células y resuspender en suspensión de células individuales. Transfiera todos los medios de comunicación y las células resuspendidas en 50 ml tubos Falcon. 20 millones de células son normalmente suficientes para una muestra Chirp.
2. Derivado células en 800RCF durante 4 min. Aspirar y medios Resuspender las células en 40 millones de 40 ml de PBS, se combinan los tubos si es necesario. Derivado células en 800RCF durante 4 min. Decantar PBS, cuidadosamente aspirar en un ángulo del líquido restante.

Crosslink recogen las células con glutaraldehído para preservar la cromatina-ARN interacciones y preparar sedimento celular.

1. Siga todos los pasos a temperatura ambiente.
2. Preparar 1% de glutaraldehído en PBS temperatura ambiente. Preparar 10 ml por 10 millones de células (0,4 ml de 25% de valores glutaraldehído + 9,6 ml de PBS). El glutaraldehído debe ser utilizado fresco.
3. Toque en la parte inferior de los tubos Falcon para desalojar gránulos. Resuspender pellet de células en 1% de glutaraldehído, comenzando con un pequeño volumen para evitar trozos, luego arriba hasta el volumen completo. Invertir para mezclar. Crosslink durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador de extremo a extremo o rotador.
4. Sofocar la reacción de reticulación con el volumen 1/10o de 1,25 M de glicina a temperatura ambiente durante 5 min.
5. Girar a 2000RCF durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y el precipitado lavado con 20 ml de PBS enfriado una vez, girando a 2000RCF durante 5 min.
6. Aspirar y resuspender el wincinera, reticulado precipitado con 1 ml de PBS enfriado por 20 millones de células. Transfiera cada ml a un tubo Eppendorf y giran a 2000RCF durante 3 min a 4 ° C. Quite la mayor cantidad posible con PBS punta de la pipeta con cuidado.
7. Flash congelar los gránulos de las células en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C indefinidamente.

4. Lisis de la célula

Lisar células reticuladas para preparar lisado celular.

1. Descongele gránulos congelados de células a temperatura ambiente. Toque duro para desalojar y mezclar el sedimento celular. Girar por la pastilla en el 2000RCF durante 3 min a 4 ° C. Utiliza la esquina 10 l punta de la pipeta para eliminar cualquier resto de PBS.
2. En una balanza electrónica (precisión de 1 mg) de tara la masa de un vacío tubo Eppendorf (los tubos pesan 1.060 gramos forma muy consistente). Pese cada pastilla y registrar su peso. Un total de 15 cm plato de células HeLa reticulados normalmente pesa 100 mg.
3. Suplemento tampón de lisis (10 veces la masa de sedimento, por ejemplo, 1 ml de 100 mg) con Fresh inhibidor de la proteasa, PMSF y SUPERase en (véase la lista adjunta de búfer). Mezclar bien.
4. Añadir un volumen 10 veces complementado tampón de lisis a cada tubo y resuspender el precipitado. Para pequeños gránulos <25 mg, resuspender en 250 l de amortiguación complementado lisis. La suspensión debe ser lisa. Si no es así, dividir la suspensión en 500 ml de alícuotas y utilizar un motor mezclador de pellets para disgregar los grumos. Proceder de inmediato a tratamiento con ultrasonidos.

5. Sonicación

ADN cizallamiento por sonicación reticuladas lisados ​​celulares.

1. Someter a ultrasonidos lisado celular en Bioruptor en 15 ml tubos Falcon. Utilice <1,5 ml de lisado en cada tubo, y para acelerar la sonicación, sonicar no más de dos tubos a la vez.
2. Someter a ultrasonidos en un baño de agua a 4 ° C en la posición más alta con 30 segundos en ON, OFF 45 segundos intervalos de pulso. Compruebe lisado cada 30 minutos. Continuar sonicando hasta que el lisado de células ya no se turbia. Esto puede tomar tan poco como 30 minutos y horas hasta 4. El númerode los tubos, el volumen de la muestra, la temperatura del baño, y el período de tiempo de sonicación afectará cuánto tiempo toma el proceso. Tubos probablemente sonicar a un ritmo diferente, así que la piscina juntos cada 30 minutos y redistribuir en los tubos originales para asegurar la homogeneidad. Nota: glutaraldehído reticulado células toman mucho más tiempo para sonicar que los equivalentes de formaldehído.
3. Al lisado se vuelve clara, transferir 5 l lisado a un tubo Eppendorf. Añadir 90 l de ADN de la proteasa K (PK) Buffer (véase la lista de amortiguación) y 5 PK l. Vortex para mezclar y centrifugar brevemente. Incubar durante 45 min a 50 ° C.
4. Extraer el ADN con el kit de Qiagen purificación de PCR. ADN se eluye en 30 l del buffer de elución Qiagen (EB) y comprobar el tamaño del ADN, el 1% en gel de agarosa. Si el frotis grueso de ADN es 100-500 pb, sonicación es completa. Si no es así, continúe con ultrasonidos.
5. Centrifugar las muestras de ultrasonidos a 16100RCF durante 10 min a 4 ° C. Combine sobrenadantes, alícuotas en muestras de 1 ml y flash de congelación en nitroge líquidon. Conservar a -80 º C.

6. CHIRP

Hibridar sondas biotiniladas de ADN a ARN y aislar la cromatina enlazado.

1. Descongele los tubos de la cromatina a temperatura ambiente.
2. Prepare el tampón de hibridación (véase la lista de buffers, preparar 2 ml por cada ml de la cromatina). Vortex para mezclar.
3. Para una muestra típica CHIRP utilizando 1 ml de lisado, quitar 10 l para INPUT ARN y 10 l de entrada de ADN y el lugar en tubos Eppendorf. Mantener en hielo hasta su uso posterior.
4. Transferir 1 ml de la cromatina a 15 ml tubo Falcon. Añadir 2 ml tampón de hibridación a cada tubo. Por volumen total <1,5 ml, utilice tubos Eppendorf.
5. Descongele sondas a temperatura ambiente. NanoDrop sondas para comprobar la cantidad si no lo ha usado en mucho tiempo (100 uM sondas deberían especificaciones ~ 500-600 ng / l usando el ajuste de una sola cadena de ADN). Añadir un volumen adecuado de sondas específicas para tubos (100 pmol por sonda 1 ml de la cromatina, 1 l de 100 pmol / l sonda por 1 ml de la cromatina).Mezclar bien. Incubar a 37 ° C durante 4 horas con agitación.
6. Con 20 minutos restantes para la hibridación, preparar las perlas magnéticas C-1 (almacenado a 4 ° C). Utilizar 100 l por 100 pmol de las sondas. Lavar con 1 ml de tampón de lisis sin suplementos tres veces, usando la cinta magnética Dynamag-2 a cuentas separadas de búfer.
7. Resuspender las perlas en el volumen original de tampón de lisis, y Suplemento con fresco PMSF, PI y SUPERase en-. Después de 4 h reacción de hibridación es completa, añadir 100 l perlas a cada tubo. Mezclar bien. Incubar a 37 ° C durante 30 min con agitación.
8. Preparar el tampón de lavado (5 ml por muestra). Vortex para mezclar. Pre-caliente a 37 ° C. Añadir PMSF antes de su uso.
9. Lávese las cuentas con 1 ml de solución de lavado cinco veces. En el primer lavado, utilizar Dynamag-15 banda magnética a perlas separadas, decantación y se resuspenden en 1 ml de tampón de lavado. Transferir el volumen a 1,5 ml tubo Eppendorf. Incubar a 37 ° C con agitación durante 5 min.
10. En lavados posteriores, la desaceleración de cada tubo en un minicentrifuge, Ajuste de la muestra en Dynamag-2 banda magnética durante 1 min. Se decanta la muestra, limpie cualquier derrame con un Kimwipe, resuspender en 1 ml de solución de lavado. Incubar a 37 ° C con agitación durante 5 min. Repetir durante cinco lavados totales.
11. En el último lavado, resuspender las cuentas bien. Sacar 100 l, y reservado para el aislamiento de ARN. Reserva de 900 l para la fracción de ADN. Coloque todos los tubos de Dynamag-2 la banda magnética y quitar el tampón de lavado. Girar todos los tubos durante un breve instante, colocarlos en cinta magnética. Eliminar el último bit de buffer de lavado completamente con una fuerte punta de la pipeta 10 l.

7. Aislamiento del ARN

Extracto de la fracción de ARN de las muestras de un pitido para cuantificar de QRT-PCR.

1. Tomar muestras de 100 l de talón y 10 l de muestra ENTRADA ARN. Añadir 85 l de ARN PK buffer de pH 7,0 a ARN de entrada. Volver a suspender las bolas en 95 l de pH 7,0 ARN PK búfer. Añadir 5 K Proteinease l e incubar a 50 ° C durante 45 min con agitación de extremo a extremo.
2. En pocas palabras de girar todos los tubos yhervir las muestras durante 10 minutos en el bloque de calor a 95 ° C.
3. Enfriar en hielo, añadir 500 l TRIzol vórtice, vigorosamente durante 10 segundos. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Conservar a -80 ° C o vaya al paso 4.
4. Añadir 100 l de cloroformo TRIzol muestras tratadas. Vortex vigorosamente durante 10 segundos. Girar a 16100RCF en una centrífuga de mesa durante 15 min a 4 ° C.
5. Retire ~ 400 l sobrenadante acuoso, evitando orgánica y la interfaz.
6. Añadir 600 l (1,5 volúmenes) 100% de etanol y mezclar bien. Haga girar la muestra a través MIRNeasy mini columnas. Lavar 1x con TAR (MIRNeasy mini kit), 2x con RPE de acuerdo al protocolo del fabricante. Eluir con 30 l de nucleasa libre de H ₂ O (HNF ₂ O).
7. Tratar el eluato de ARN con ADN libre por el protocolo del fabricante. Después de la reacción es completa, calentar la muestra durante 15 minutos a 65 ° C para inactivar completamente cualquier resto de DNasa.
8. Utilice 1 l de ARN aislado por pocillo de QRT-PCR análisis para confirmar lncRNArecuperación. GAPDH se utiliza a menudo como un control negativo.

8. El aislamiento del ADN

Extracto de la fracción de ADN de muestras de un pitido para identificar o cuantificar mediante secuenciación por PCR cuantitativa.

1. Prepare el tampón de elución del ADN (ver lista de buffers), 150 l por ejemplo, incluyendo la entrada de ADN.
2. Añadir 1 0μL RNasa A (10 mg / ml) y 10 l RNasa H (10 U / l) por ml de tampón de elución del ADN, y vórtice para mezclar.
3. Resuspender cada muestra de las perlas en 150 l de tampón de elución con ADN RNasas. (ENTRADA Resuspender el ADN en 140 l) Se incuba a 37 ° C durante 30 min con agitación.
4. Cuentas separadas y el sobrenadante de Dynamag-2 la banda magnética. Eliminar el sobrenadante y añadir a los tubos etiquetados.
5. Preparar una segunda alícuota de tampón de elución de ADN con 10 l de ribonucleasa A (10 mg / ml) y RNasaH (10 U / l) exactamente como se hace en 8,2). Añadir 150 l de cada muestra (incluida la entrada de ADN), se incuba, y eliminar el sobrenadante. Recoge todas sobrenadante (hombrod es ~ 300 l).
6. Añadir 15 PK l de cada muestra. Incubar a 50 ° C durante 45 min con agitación.
7. Pre-spin hacia abajo de color amarillo fase de bloqueo de tubos de gel (5PRIME). Transferir las muestras de ADN a los tubos de gel de enganche de fase, y añadir 300 l PhOH: cloroformo: isoamílico por muestra. Agitar enérgicamente durante 10 minutos, y de girar en una centrífuga de mesa a 16100RCF durante 5 min a 4 ° C. Tome acuoso de la parte superior (~ 300 l). Añadir 3 GlycoBlue l, 30 l de NaOAc y 900 l de EtOH 100%. Mezclar bien y guardar a -20 ° C durante la noche.
8. Haga girar las muestras a 16100RCF durante 30 min a 4 ° C.
9. Decantar el sobrenadante con cuidado. Añadir 1 ml de EtOH 70% y agitar para mezclar. Girar a 16100RCF durante 5 min. Eliminar sobrenadante con una pipeta. Deje secar al aire durante 1 min. Resuspender en 30 l EB.
10. Las muestras de ADN están listos para el análisis de qPCR o la preparación de las bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento por el protocolo de Illumina.

10. Los resultados representativos

Figura 1 Figura 2 muestra el enriquecimiento de la telomerasa humana ARN (TERC) a partir de células HeLa por GAPDH, un ARN abundantes celulares que sirve como un control negativo. La mayoría de los ARNs TERC (~ 88%) presentes en la célula se empujado hacia abajo por la realización de chirrido, mientras que sólo el 0,46% de GAPDH RNA fue recuperada, demostrando un factor de enriquecimiento de ~ 200 veces. Las sondas no específicas, tales como sondas dirigidas LacZ ARN, que no se expresa en células de mamíferos (Figura 2), se puede utilizar como controles negativos adicionales.

Regiones de ADN esperados de obligar a la lncRNA objetivo son típicamente enriquecida sobre regiones negativos cuando se mide por qPCR. Figura 3 muestra la validación qPCR de cuatro AIRE CALIENTE enlazados a sitios en fibroblastos primarios de prepucio humano que determina realizando CHIRP-ss en la misma línea celular, mientras que TERC y GAPDH ADN sitios sírve como regiones de control negativo. Tanto el "par" y la sonda "raro", establece el enriquecimiento producido comparable de plazos previstos AIRE CALIENTE-sitios a través de las regiones negativas, un sello distintivo de los verdaderos lncRNA sitios de unión.

De alto rendimiento de secuenciación de ADN CHIRP enriquecido se obtiene un mapa global de los sitios de unión lncRNA. La Drosophila lncRNA roX2 se sabe que interactúan con el cromosoma X en una forma que se requiere para la compensación de la dosis. La Figura 4 muestra roX2 perfil de unión sobre una sección del cromosoma X. Tanto "incluso" y "extraño" las muestras han sido secuenciados y sus únicos ruidos han sido eliminados para producir un registro de las señales superpuestas. Cada "pico" aquí indica un sitio fuerte de roX2 vinculante. La pista completa y la lista de roX2 genes diana se han descrito en Chu et al. 2011 ^17.

Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento CHIRPDuré. La cromatina se entrecruza con lncRNA: aductos de proteínas in vivo Biotinylated sondas suelo de baldosas se hibridan para apuntar lncRNA, y los complejos de la cromatina se purifica mediante perlas magnéticas estreptavidina, seguido de lavados rigurosos.. Nos eluir el ADN o las proteínas lncRNA unido con un cóctel de RNasa A y H. se esquematiza una supuesta secuencia de lncRNA vinculante en color naranja. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. ¹⁷

Figura 2. CHIRP enriquece de ARN humano TERC. TERC-asDNA sondas recuperar ~ 88% de los celulares TERC RNA no detectable y GAPDH. LacZ asDNA sondas se utilizaron como controles negativos y recuperar ni ARN. La media ± desviación estándar se muestran. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. ¹⁷

Figura 3. AIRE CALIENTE CHIRP-qPCR en humanos primariafibroblastos Eskin. NFKBIA, HOXD3 4, SERINC5 y ABCA2 son las regiones que interactúan con AIRE CALIENTE. TERC y GAPDH sirvieron como controles negativos. La media ± desviación estándar se muestran. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. ¹⁷

Figura 4. CHIRP-ss datos de roX2 ARN en células de Drosophila SL2. "Aún" y "extraño" fueron secuenciados por separado, sus datos se unen para reflejar sólo los picos comunes en ambos. La pista fusionada se muestra. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. ¹⁷

C. Chu y Chang HY se nombran como inventores en una solicitud de patente basada en este método.