CHIRP技术是一种新型快速映射约束力的长非编码RNA基因组网站(lncRNAs)。该方法采用特异性的反义平铺寡核苷酸允许枚举的lncRNA绑定基因组站点的优势。
长非编码RNA的染色质状态的关键调节剂量补偿,压印和发育的基因表达1,2,3,4,5,6,7,如重要的生物过程。最近发现的成千上万的在特定的染色质修饰复合物,如多梳镇压复杂2(PRC2),的关联lncRNAs与介导的组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3),建议在管理中的特定基因的染色质状态的众多lncRNAs广泛的角色时尚8,9。虽然一些lncRNAs被认为在邻近基因的顺,其他lncRNAs工作的反式调节基因的远亲位于。例如, 果蝇 lncRNAs roX1和roX2绑定的雄性细胞的X染色体上的许多地区,是至关重要的剂量补偿10,11。然而,他们的结合位点的确切位置,不知道在高分辨率。同样,人类的lncRNA热风可以影响对H PRC2占用基因的全基因组3,12,13,但特异性是如何实现的undreds目前还不清楚。 LncRNAs也可以作为模块化脚手架,聘请多蛋白质复合物的组装。经典反义RNA支架是TERC的RNA,由于复杂的14端粒酶模板和脚手架;热风也可以作为一个PRC2脚手架和H3K4的去甲基复杂的13。
此前的研究显示映射在染色的RNA占用大量的见解15,16,但只有一次一个单一的基因位点。占用网站的大多数lncRNAs的是不知道,和染色质调控lncRNAs的角色大多已推断的lncRNA扰动的间接影响。正如染色质免疫芯片或深度测序(芯片的芯片或芯片SEQ,分别)大大改善了我们的基因组规模的蛋白质-DNA相互作用的理解,在这里我们说明了recenTLY出版策略映射在高分辨率17长的RNA入住的全基因组。基于这种方法,通过RNA纯化(CHIRP)( 图1),染色质隔离亲和力捕捉目标lncRNA:染色质复杂,由平铺反义寡核苷酸,然后生成基因组结合位点的地图,在几百基地的决议高灵敏度和低背景。 CHIRP是适用于许多lncRNAs因为亲和探针的设计是简单的RNA序列,并要求没有RNA的结构或功能域的知识。
在这里,我们介绍了CHIRP-seq技术, 在体内 lncRNA的全基因组结合位点的映射方法。成功的关键参数是平铺的寡核苷酸探针和戊二醛交联的分裂池。亲和探针的设计是简单的RNA序列,无需事先的RNA的结构或功能域的知识。三个相当不同的两个物种的RNA – – 我们与roX2,TERC和热风的成功表明,啁啾seq是可能推广到许多lncRNAs。与所有的实验,护理和适当的控制是需要解释的结果。不同的的lncRNA可能需要滴定的条件,和明智变化的条件,如选择不同的亲和探针或交联剂,可突出RNA的染色质相互作用的不同方面。芯片-seq的一样,并不是所有的绑定事件是必然的功能,需要更多的研究来确定ØRNA的生物后果ccupancy的染色质。尽管如此,我们预计其他的染色相关lncRNAs的,目前在数以万计的数字8,9的研究人员的这项技术的许多有趣的应用程序。正如芯片SEQ打开门的全基因组DNA-蛋白质相互作用的探索,“RNA相互作用组”的CHIRP-SEQ研究的可能揭示生物的许多新的途径。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢T.红,三菱商事。蔡O.庄园,E.西格尔,M.黑田东彦,T. Swigut,一讨论Shestopalov。新加坡(CC),国立卫生研究院以R01 CA118750和以R01-HG004361(HYC),加州再生医学研究所(HYC)科学,技术和研究机构的支持。 HYC是霍华德·休斯医学研究所的早期职业科学家。
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma Aldrich | G5882-10x10ml |
Motorized pellet mixer | VWR | V8185-904 |
Protease inhibitor | Roche | 11873580001 |
PMSF | Sigma Aldrich | 78830 |
Superase-in | Ambion | AM2696 |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 |
Falcon tubes (for sonication) | Corning | 430790 |
Proteinase K | Ambion | AM2546 |
PCR purification kit | Qiagen | 28106 |
C-1 magnetic beads | Invitrogen | 65002 |
PMSF | Sigma Aldrich | P7626-25G |
DynaMag-15 magnet | Invitrogen | 123-01D |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
MIRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 |
Rnase H | Epicentre | R0601K |
Rnase A | Sigma Aldrich | R4875-100MG |
Phase Lock Gel Heavy | 5 PRIME | 2302810 |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Phenol:chloroform:Isoamyl | Invitrogen | 15593-031 |
Chloroform | Ricca | RSOC0020-1C |
GlycoBlue | Ambion | AM9515 |
Glycine | J.T. Baker | 4057-06 |
PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 |
Elution Buffer (EB) | Qiagen | 19086 |
20x SSC | Invitrogen | 15557-036 |
10% SDS | Invitrogen | 15553-027 |
DNA-free | Ambion | AM1906 |
Buffer kit | Ambion | AM9010 |
Formamide | Invitrogen | 15515-026 |