Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Summary

CHIRP è una tecnica innovativa e rapida mappa genomica siti di legame di RNA non codificanti lunghi (lncRNAs). Il metodo sfrutta la specificità di oligonucleotidi anti-senso di affiancamento per consentire l'enumerazione di lncRNA-bound siti genomici.

Abstract

RNA non codificanti lunghi sono regolatori chiave degli Stati cromatina per importanti processi biologici quali la compensazione del dosaggio, imprinting, e l'espressione genica di sviluppo ^{1,2,3,4,5,6,7.} La recente scoperta di migliaia di lncRNAs in associazione con specifici complessi di modifica della cromatina, come Polycomb Complex repressiva 2 (PRC2) che media l'istone H3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3), suggerisce i ruoli di massima per la gestione lncRNAs numerosi stati della cromatina in un gene specifico moda ^8,9. Mentre alcuni lncRNAs sono pensati per lavorare in cis sui geni vicini, lncRNAs altri lavorano in trans per regolare i geni si trovano lontano. Per esempio, Drosophila lncRNAs roX1 e roX2 legano numerose regioni del cromosoma X delle cellule maschili, e sono fondamentali per la compensazione del dosaggio ^10,11. Tuttavia, le posizioni esatte dei loro siti di legame non sono note ad alta risoluzione. Allo stesso modo, umano lncRNA Hotair può influire sulla occupazione PRC2 hundreds di geni genoma ^3,12,13, ma come specificità si ottiene non è chiaro. LncRNAs può anche servire come strutture modulari di assumere l'assemblaggio di complessi proteici multipli. Il classico trans-agente RNA scaffold è il TERC RNA che serve come modello e scaffold per la telomerasi complesso ^14; Hotair può anche servire come impalcatura per PRC2 e H3K4 demetilasi complesso ^13.

Precedenti studi di mappatura occupazione RNA a cromatina hanno rivelato notevoli intuizioni ^15,16, ma solo in un locus singolo gene alla volta. I siti di occupazione della maggior parte dei lncRNAs non sono noti, ei ruoli dei lncRNAs nella regolazione della cromatina sono stati in gran parte dedotta dagli effetti indiretti della perturbazione lncRNA. Proprio come immunoprecipitazione della cromatina seguita da microarray o sequenziamento profondo (ChIP-chip o ChIP-seq, rispettivamente) ha notevolmente migliorato la nostra comprensione di interazioni proteina-DNA su scala genomica, qui illustrare un RecenTLY pubblicato strategia per mappare lunga occupazione RNA genome-wide ad alta risoluzione ^17. Questo, Isolamento metodo cromatina di purificazione dell'RNA (CHIRP) (Figura 1), si basa sulla cattura affinità di bersaglio lncRNA: complesso cromatina allineando-oligo antisenso, che genera un mappa genomica di siti di legame ad una risoluzione di diverse centinaia di basi con alta sensibilità e basso background. CHIRP è applicabile a molti lncRNAs perché il progetto di affinità sonde è semplice data la sequenza di RNA e non richiede alcuna conoscenza della struttura del RNA o domini funzionali.

Protocol

1. Sonda di progettazione Design anti-senso DNA piastrellatura sonde per il recupero selettivo di RNA bersaglio CHIRP. Progettazione anti-senso sonde oligo con il progettista in linea sonda singlemoleculefish.com 18. Utilizzare questi parametri: numero di sonde sonda = 1/100 bp di lunghezza RNA, 2) sulla destinazione GC = 45; 3) la durata oligonucleotide = 20; 4) Lunghezza distanza = 60-80. Rompere RNA in segmenti, se troppo a lungo per il progettista. Omettere regioni di ripetizioni o di una ampia omologia. Ordina anti-senso sonde di DNA con BiotinTEG a 3-prime. Sonde etichetta secondo le loro posizioni lungo l'RNA. Separarli in due gruppi in modo che il pool di "anche" contiene tutte le sonde di numerazione 2, 4, 6, ecc e la piscina "dispari" contiene sonde di numerazione 1, 3, 5, ecc Diluire pool di sonde a 100 micrometri e la concentrazione conservare a -20 ° C. Tutti gli esperimenti devono essere eseguite usandoentrambe le piscine, che servono come controlli interni per l'altro. Reale RNA-dipendente segnale sarebbe presente da entrambe le piscine, mentre la sonda specifici rumori sarebbe unico per ogni pool. Questo vale sia per CHIRP-qPCR e CHIRP-seq. 2. Raccogliere cellule Raccogliere cellule che verranno utilizzati per l'esperimento CHIRP. Coltivare cellule in piastre di coltura di tessuto o di palloni confluenza. Risciacquo con tampone fosfato salino (PBS) e una volta Tripsinizzare. Quench tripsina con volume> 2x dei mezzi di comunicazione, pipetta su e giù per staccare le cellule e risospendere in sospensione singola cella. Trasferire tutti i media e le cellule risospese in 50 ml provette Falcon. 20 milioni di cellule sono in genere sufficienti per un campione CHIRP. Spin cellule a 800RCF per 4 min. Aspirare il terreno e risospendere 40 milioni di cellule in 40 ml di PBS, unire tubi se necessario. Spin cellule a 800RCF per 4 min. Decantare PBS, aspirare accuratamente in un angolo il liquido rimanente. </ol> 3. Cross-Link Cells e raccogliere pellet cellulare Crosslink raccolte le cellule con glutaraldeide per preservare le interazioni RNA-cromatina e preparare pellet di cellule. Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente. Preparare glutaraldeide 1% in PBS temperatura ambiente. Preparare 10 ml per 10 milioni di cellule (0,4 mL magazzino glutaraldeide 25% + 9,6 mL PBS). Glutaraldeide deve essere usato fresco. Toccare fondo di tubi Falcon per rimuovere pellets. Risospendere il pellet cellulare in 1% glutaraldeide, a partire da un piccolo volume per evitare blocchi, poi ricaricare fino a tutto volume. Capovolgere. Crosslink per 10 minuti a temperatura ambiente su un end-to-end shaker o dei rotatori. Raffreddare bruscamente la reazione di reticolazione con volume 1/10th di 1,25 M glicina a temperatura ambiente per 5 min. Spin a 2000RCF per 5 min. Aspirare il surnatante e pellet lavaggio con 20 mL PBS volta raffreddato, filatura a 2000RCF per 5 min. Aspirare e risospendere il wincenerito, cross-linked pellet con 1 ml di PBS refrigerata per 20 milioni di cellule. Trasferire ogni ml di una provetta Eppendorf e centrifugare a 2000RCF per 3 min a 4 ° C. Rimuovere il più possibile con PBS punta della pipetta accuratamente. Flash-congelare i pellet cellulari in azoto liquido e conservare a -80 ° C a tempo indeterminato. 4. Lisi cellulare Lisare cellule reticolati per preparare lisato cellulare. Scongelare pellet cellulari surgelati a temperatura ambiente. Toccare difficili da rimuovere e miscelare il pellet di cellule. Rallenta il pellet a 2000RCF per 3 min a 4 ° C. Utilizzare una forte punta di 10 microlitri pipetta per rimuovere ogni residuo PBS. Su una bilancia elettronica (precisione di 1mg) tarare la massa di un tubo vuoto Eppendorf (i nostri tubi pesano 1.060 grammi molto coerente). Pesare ciascuna pellet e registrare il suo peso. Un piatto completo di 15 cm di cellule HeLa reticolati pesa in genere 100 mg. Supplemento Lysis Buffer (10 volte la massa di pellet, ad esempio, 1 ml per 100 mg) con Fresh inibitore della proteasi, PMSF e Superase-in (vedi elenco allegato buffer). Mescolare bene. Aggiungi 10X tampone di lisi del volume integrata in ogni provetta e risospendere il pellet. Per le piccole palline <25 mg, risospendere in 250 microlitri di buffer lisi integrato. sospensione deve essere liscia. caso contrario, dividere la 500 pl aliquote e utilizzare un mixer motorizzato pellet per rompere grumi. procedere immediatamente a sonicazione. 5. sonicazione shear dna da lisati cellulari reticolati. sonicare lisato cellulare bioruptor 15 ml provette falcon. <1,5 ciascuna provetta, una più rapida sonicazione, non due tubi volta. sottoporre ad ultrasuoni bagno acqua 4 ° c alla massima impostazione con 30 secondi, 45 secondi off intervalli impulso. controllare ogni min. continuare finché il è torbida. questa operazione potrebbe richiedere minimo min fino ore. numerodi tubi, volume del campione, temperatura bagno, periodo tempo che influenzano durata processo richiede. probabilmente velocità differenti, modo mettere comune tra loro ridistribuire originali assicurare l'omogeneità. nota: glutaraldeide-reticolato cellule molto equivalenti formaldeide. quando diventa chiaro, cedere 5 ul nuova provetta eppendorf. aggiungere 90 proteasi k (pk) (vedi elenco buffer) pk ul. vortex miscelare centrifugare brevemente. incubare 50 c. estrarre kit purificazione pcr qiagen. eluire elution qiagen (eb) le dimensioni su gel agarosio 1%. se massa della striscio 100-500 bp, completa. continuano ultrasuoni. i campioni sonicati 16100rcf 10 minuti combina surnatanti, 1 flash-congelamento azoto, liquidon. conservare -80 6. chirp ibridano sonde rna biotinilati isolare cromatina legata. scongelare ambiente. preparare tampone ibridazione buffer, 2 cromatina). mescolare. esempio tipico utilizzando lisato, l rimuovere input posto tenere ghiaccio al successivo utilizzo. trasferire ciascun tubo. totale ml, nanodrop importo, lo avete utilizzato lungo (100 pm dovrebbe spec ~ 500-600 ng > descrive il flusso di lavoro CHIRP. Un esperimento CHIRP successo arricchisce tipicamente RNA bersaglio significativamente nel non-specifici RNA. Figura 2 mostra arricchimento della telomerasi RNA umano (TERC) da cellule HeLa oltre GAPDH, un RNA abbondanti cellulari che serve come controllo negativo. La maggior parte degli RNA TERC (~ 88%) presenti nella cellula sono state abbattute eseguendo CHIRP, mentre solo il 0,46% del GAPDH RNA è stato recuperato, dimostrando un fattore di arricchimento di circa 200 volte. Le sonde non specifici quali sonde di targeting LacZ RNA, che non è espressa in cellule di mammifero (Figura 2), può essere usato come addizionali controlli negativi. Regioni di DNA prevede di impegnare la lncRNA destinazione sono in genere arricchiti sulle regioni negativi quando misurata dal qPCR. La figura 3 mostra la convalida qPCR di quattro Hotair-bound siti primari fibroblasti del prepuzio umano che siamo determinati eseguendo CHIRP-seq nella linea stessa cella, mentre TERC e GAPDH DNA siti di sérve come regioni di controllo negativo. Sia "anche" e la sonda "dispari" imposta arricchimento prodotto comparabile attesi Hotair-bound siti su regioni negativi, un segno distintivo di veri lncRNA siti di legame. High-throughput sequenziamento del DNA CHIRP arricchito produce una mappa globale di lncRNA siti di legame. La Drosophila lncRNA roX2 è noto per interagire con il cromosoma X in un modo che è necessaria la compensazione del dosaggio. Figura 4 mostra roX2 profilo di legame su una sezione del cromosoma X. Sia "anche" e "dispari" i campioni sono stati sequenziati e le loro unici rumori sono stati eliminati per produrre una traccia di segnali sovrapposti. Ogni "picco" indica qui un sito di forte roX2 vincolante. La pista e la lista delle roX2 geni bersaglio sono stati descritti in Chu et al. 2011 17. Figura 1. Diagramma di flusso della procedura CHIRPdure. La cromatina è reticolata ad lncRNA: addotti proteici in vivo Biotinylated sonde piastrelle sono ibridate per indirizzare lncRNA e complessi della cromatina sono purificati utilizzando perline streptavidina magnetici, seguiti da lavaggi stringenti.. Noi eluire DNA legato lncRNA o proteine, con un cocktail di RNasi A e H. è schematizzata Una sequenza putativa lncRNA vincolante in arancione. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17. Figura 2. Arricchisce CHIRP per l'uomo TERC RNA. TERC-asDNA sonde recuperare ~ 88% dei cellulari TERC RNA non rilevabile e GAPDH. LacZ-asDNA sonde vengono utilizzati come controlli negativi e recuperare né RNA. Media + sd vengono visualizzati. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17. Figura 3. Hotair CHIRP-qPCR in umana primaria perfibroblasti Eskin. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 e ABCA2 sono regioni che interagiscono con Hotair. TERC e GAPDH serviti come controlli negativi. Media + sd vengono visualizzati. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17. Figura 4. CHIRP-seguenti dati di roX2 SL2 RNA in cellule di Drosophila. "Anche" e "dispari" sono stati sequenziati separatamente, i loro dati si fondono in modo da riflettere solo picchi comuni in entrambi. La pista è mostrato unito. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17.

Discussion

Qui abbiamo descritto CHIRP-seq, un metodo di mappatura in vivo i siti di legame lncRNA genome-wide. I parametri chiave per il successo sono le piscine separate di piastrelle sonde oligonucleotidiche e reticolazione glutaraldeide. Il disegno di sonde per affinità è semplice data la sequenza di RNA e non richiede alcuna conoscenza preventiva della struttura del RNA o domini funzionali. Il nostro successo con roX2, TERC e Hotair – tre RNA piuttosto differenti in due specie – suggerisce che CHIRP-seq è probabile generalizzabile a molte lncRNAs. Come per tutti gli esperimenti, i controlli per la cura e propria sono tenuti a interpretare i risultati. LncRNA diversi possono richiedere la titolazione delle condizioni, giudizioso e il cambiamento delle condizioni, come la selezione di sonde affinità diverse o reticolanti, può mettere in luce aspetti diversi di interazioni RNA-cromatina. Come ChIP-seq, non tutti gli eventi vincolanti sono necessariamente funzionali, e sono necessari ulteriori studi per accertare le conseguenze biologiche di RNA occupancy sulla cromatina. Tuttavia, si prevede molte interessanti applicazioni di questa tecnologia per i ricercatori di altri cromatina associate lncRNAs, che ora si contano a migliaia ^8,9. Proprio come ChIP-seq ha aperto la porta per la genome-wide esplorazioni di interazioni proteina-DNA, CHIRP-seq studi della "RNA interattoma" può rivelare molte nuove vie della biologia.

Materials

Buffer List:

Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.

Lysis Buffer:

50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads

Proteinase K Buffer (for DNA)

100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use

Hybridization Buffer

750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use

Wash Buffer

2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use

DNA elution Buffer

50 mM NaHCO3
1% SDS

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Glutaraldehyde (EM grade)	Sigma Aldrich	G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer	VWR	V8185-904
Protease inhibitor	Roche	11873580001
PMSF	Sigma Aldrich	78830
Superase-in	Ambion	AM2696
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Falcon tubes (for sonication)	Corning	430790
Proteinase K	Ambion	AM2546
PCR purification kit	Qiagen	28106
C-1 magnetic beads	Invitrogen	65002
PMSF	Sigma Aldrich	P7626-25G
DynaMag-15 magnet	Invitrogen	123-01D
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	123-21D
MIRNeasy mini kit	Qiagen	217004
Rnase H	Epicentre	R0601K
Rnase A	Sigma Aldrich	R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy	5 PRIME	2302810
Trizol	Invitrogen	15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl	Invitrogen	15593-031
Chloroform	Ricca	RSOC0020-1C
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Glycine	J.T. Baker	4057-06
PBS, pH 7.4	Invitrogen	10010-049
Elution Buffer (EB)	Qiagen	19086
20x SSC	Invitrogen	15557-036
10% SDS	Invitrogen	15553-027
DNA-free	Ambion	AM1906
Buffer kit	Ambion	AM9010
Formamide	Invitrogen	15515-026