Chirpが長い非コードRNAのゲノム結合部位(lncRNAs)をマッピングするための新規かつ迅速な手法である。メソッドは、lncRNAバインドされたゲノムサイトの列挙を許可するアンチセンスタイルオリゴヌクレオチドの特異性を利用しています。
長い非コードRNAは、そのような投与量補正、プリント、発達遺伝子発現1,2,3,4,5,6,7として重要な生物学的プロセスのためにクロマチン状態の重要な調節因子である。仲介ヒストンH3リジン27トリメチル(H3K27me3)は、遺伝子特異的にクロマチンの状態を管理するための多数のlncRNAsのための広範な役割を示唆しているようなポリコーム抑圧的な複合体2(PRC2)などの特定のクロマチン修飾複合体との関連でlncRNAs数千人の最近の発見ファッション8,9。いくつかのlncRNAsが隣接遺伝子のシスに働くと考えられているが、他のlncRNAsは遠くに位置する遺伝子を調節するためにトランスで働いています。例えば、男性の細胞のX染色体上に、 ショウジョウバエ lncRNAs roX1とroX2バインド多数の領域、および量補償10,11のために重要である。しかし、その結合部位の正確な場所は、高解像度で知られていません。同様に、ヒトlncRNAギョレメでは、hにPRC2占有に影響を与える可能性が遺伝子のゲノムワイド3,12,13のundredsが、どのように特異性が達成されるかは不明である。 LncRNAsまた、複数のタンパク質複合体のアセンブリーを採用するモジュラー足場として機能することができます。古典的なトランス作用RNA足場は14複雑なテロメラーゼのテンプレートと足場としてTERC RNAである、ギョレメもPRC2のための足場と13の複雑なH3K4脱メチル化酵素として機能することができます。
クロマチンでのRNAの占有率をマッピングする先行研究は、実質的な洞察力15,16を認めたが 、一度に1つの遺伝子座でいます。最もlncRNAsの占有サイトが知られていない、とクロマチン調節におけるlncRNAsの役割は主にlncRNA摂動の間接的な影響から推測されています。マイクロアレイまたはディープシークエンシング(チップ·チップまたはチップ配列は、それぞれ)が続いてクロマチン免疫沈降が大きく、ゲノムスケールでのタンパク質-DNA相互作用の理解を向上させたように、ここではrecenを示していますTLY高解像度17で長いRNA占有ゲノムワイドにマッピングするための戦略を発表した。その後の数百塩基の解像度でゲノム結合部位のマップを生成するアンチセンスオリゴをタイルによってクロマチン複合体:このメソッドは、RNA精製(チャープ)( 図1)によるクロマチンの単離、ターゲットlncRNAの親和性のキャプチャに基づいています高感度、低バックグラウンド。アフィニティープローブの設計は、RNA配列の指定された簡単で、RNAの構造や機能ドメインの知識は必要ありませんので、チャープは多くのlncRNAsに適用されます。
ここでは、チャープ配列は、in vivo lncRNA結合部位をゲノムワイドにマッピングする方法を説明します。成功の鍵パラメータは、オリゴヌクレオチドプローブおよびグルタルアルデヒド架橋をタイルの分割プールです。アフィニティープローブの設計は、RNA配列与えられた簡単で、RNAの構造や機能ドメインの事前知識を必要としません。 roX2、TERCと、ギョレメの私たちの成功 – 2種の3ではなく別のRNAは – のChirp-seqは多くのlncRNAsに可能性が一般化であることを示唆している。すべての実験では、ケアと適切なコントロールと同様に結果を解釈する必要があります。異なるlncRNA条件の滴定、及び当該異なる親和性プローブまたは架橋剤の選択などの条件の賢明な変更が必要になる場合があり、RNA-クロマチンの相互作用のさまざまな側面を強調することができます。 CHIP-seqのように、すべてのバインディングイベントは、必ずしも機能的であり、さらなる研究は、RNA oの生物学的影響を把握する必要がありませんクロマチン上でccupancy。それにもかかわらず、我々は何千人も8,9の現在数の他のクロマチン関連lncRNAsの研究者のためにこの技術の多くの興味深いアプリケーションを予見する。 CHIP-seqはDNA-タンパク質相互作用のゲノムワイドな探求のためにドアを開いたように、 "RNAインタラクトーム"のチャープseqの研究は、生物学の多くの新たな道を明らかにすることができます。
The authors have nothing to disclose.
我々はT.ハングアップ、MCに感謝します。ツァイ、O.マナー、E.シーガル、M.黒田、T. Swigut、および議論のためのI. Shestopalov。シンガポール(CC)、NIH R01-CA118750とR01-HG004361(HYC)、および再生医療(HYC)はカリフォルニア工科大学の科学技術研究庁によってサポートされています。 HYCは、ハワード·ヒューズ医学研究所の初期のキャリアの科学者です。
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma Aldrich | G5882-10x10ml |
Motorized pellet mixer | VWR | V8185-904 |
Protease inhibitor | Roche | 11873580001 |
PMSF | Sigma Aldrich | 78830 |
Superase-in | Ambion | AM2696 |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 |
Falcon tubes (for sonication) | Corning | 430790 |
Proteinase K | Ambion | AM2546 |
PCR purification kit | Qiagen | 28106 |
C-1 magnetic beads | Invitrogen | 65002 |
PMSF | Sigma Aldrich | P7626-25G |
DynaMag-15 magnet | Invitrogen | 123-01D |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
MIRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 |
Rnase H | Epicentre | R0601K |
Rnase A | Sigma Aldrich | R4875-100MG |
Phase Lock Gel Heavy | 5 PRIME | 2302810 |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Phenol:chloroform:Isoamyl | Invitrogen | 15593-031 |
Chloroform | Ricca | RSOC0020-1C |
GlycoBlue | Ambion | AM9515 |
Glycine | J.T. Baker | 4057-06 |
PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 |
Elution Buffer (EB) | Qiagen | 19086 |
20x SSC | Invitrogen | 15557-036 |
10% SDS | Invitrogen | 15553-027 |
DNA-free | Ambion | AM1906 |
Buffer kit | Ambion | AM9010 |
Formamide | Invitrogen | 15515-026 |