Chirp es una técnica novedosa y rápida a los sitios de unión del Mapa del Genoma de los ARNs no codificantes de largo (lncRNAs). El método tiene la ventaja de la especificidad de los oligonucleótidos antisentido baldosas para permitir la enumeración de los sitios genómicos lncRNA enlazados.
RNAs no codificantes largos son los principales reguladores de los estados de la cromatina de importantes procesos biológicos como la compensación de la dosis, la impresión y la expresión de genes en el desarrollo 1,2,3,4,5,6,7. El reciente descubrimiento de miles de lncRNAs en asociación con determinados complejos de la cromatina modificación, tales como el complejo Polycomb represiva 2 (PRC2) que media la histona H3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3), sugiere que las funciones generales de lncRNAs numerosos estados en la gestión de la cromatina en un gen específico 8,9 de la moda. Mientras que algunos lncRNAs se cree que actúa en cis de los genes vecinos, lncRNAs otros trabajan en trans para regular los genes yacimiento lejano. Por ejemplo, Drosophila lncRNAs roX1 roX2 y regiones se unen numerosos en el cromosoma X de las células masculinas, y son fundamentales para la compensación de la dosis 10,11. Sin embargo, la ubicación exacta de sus sitios de unión no se conocen en alta resolución. Del mismo modo, humana lncRNA AIRE CALIENTE puede afectar a la ocupación de PRC2 hientos de los genes en todo el genoma 3,12,13, pero ¿cómo se logra la especificidad no está claro. LncRNAs también puede servir como andamios modulares para contratar el montaje de complejos de proteínas múltiples. El clásico de acción trans ARN andamio es el TERC ARN que sirve como la plantilla y andamio para la telomerasa complejo 14; AIRE CALIENTE también puede servir como un andamio para PRC2 y un desmetilasa H3K4 complejo 13.
Los estudios previos de cartografía de ocupación del ARN en la cromatina han revelado una sólida perspectiva de 15,16, pero sólo en un lugar único gen a la vez. Los sitios de ocupación de la mayoría de lncRNAs no se conocen, y las funciones de regulación de la cromatina en lncRNAs han sido en su mayoría infiere de los efectos indirectos de la perturbación lncRNA. Al igual que la cromatina immunoprecipitation seguida de microarrays o la secuenciación profunda (chip-chip o chip siguientes, respectivamente) ha mejorado enormemente nuestra comprensión de las interacciones proteína-ADN en una escala genómica, aquí se ilustra una recentemente publicada estrategia para asignar tiempo de ocupación en todo el genoma ARN en alta resolución 17. Este método, Aislamiento cromatina por purificación del RNA (CHIRP) (Figura 1), se basa en la captura de afinidad de destino lncRNA: complejo cromatina por embaldosado antisentido-oligos, que luego se genera un mapa de sitios de unión genómicas a una resolución de varios cientos de bases con sensibilidad alta y baja de fondo. Chirp es aplicable a muchos lncRNAs porque el diseño de sondas de afinidad es sencillo dada la secuencia de ARN y no requiere conocimiento de la estructura del ARN o dominios funcionales.
Aquí se describe CHIRP-ss, un método de asignación en vivo sitios lncRNA vinculantes en todo el genoma. Los parámetros clave para el éxito son las piscinas abiertas de mosaico sondas de oligonucleótidos y el entrecruzamiento glutaraldehído. El diseño de las sondas de afinidad es sencillo dada la secuencia de ARN y no requiere conocimiento previo de la estructura del ARN o dominios funcionales. Nuestro éxito con roX2, TERC, y AIRE CALIENTE – tres ARN en lugar de dos especies diferentes – sugiere que CHIRP-ss es probable generalizable a muchos lncRNAs. Al igual que con todos los experimentos, los controles de asistencia y adecuada están obligados a interpretar los resultados. LncRNA diferentes pueden requerir un ajuste de las condiciones, y el cambio razonable de condiciones, como la selección de sondas de afinidad o reticulantes diferentes, puede poner de relieve diferentes aspectos de las interacciones ARN-cromatina. Al igual que el chip-ss, no todos los eventos son necesariamente vinculantes funcional, y se requieren estudios adicionales para determinar las consecuencias biológicas de ARN occupancy en la cromatina. No obstante, prevemos muchas aplicaciones interesantes de esta tecnología para los investigadores de otras asociadas a la cromatina lncRNAs, que ahora se cuentan por miles 8,9. Así como chip-ss ha abierto la puerta a todo el genoma de la exploración de las interacciones proteína-ADN, chirrido-ss estudios de la "interactoma ARN" puede revelar muchas nuevas vías de la biología.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, Swigut T., y yo Shestopalov para los debates. Con el apoyo de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur (CC), el NIH R01-R01 CA118750 y HG004361-(HYC), y California Instituto de Medicina Regenerativa (HYC). HYC es un científico de Carrera Temprana del Instituto Médico Howard Hughes.
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma Aldrich | G5882-10x10ml |
Motorized pellet mixer | VWR | V8185-904 |
Protease inhibitor | Roche | 11873580001 |
PMSF | Sigma Aldrich | 78830 |
Superase-in | Ambion | AM2696 |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 |
Falcon tubes (for sonication) | Corning | 430790 |
Proteinase K | Ambion | AM2546 |
PCR purification kit | Qiagen | 28106 |
C-1 magnetic beads | Invitrogen | 65002 |
PMSF | Sigma Aldrich | P7626-25G |
DynaMag-15 magnet | Invitrogen | 123-01D |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
MIRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 |
Rnase H | Epicentre | R0601K |
Rnase A | Sigma Aldrich | R4875-100MG |
Phase Lock Gel Heavy | 5 PRIME | 2302810 |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Phenol:chloroform:Isoamyl | Invitrogen | 15593-031 |
Chloroform | Ricca | RSOC0020-1C |
GlycoBlue | Ambion | AM9515 |
Glycine | J.T. Baker | 4057-06 |
PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 |
Elution Buffer (EB) | Qiagen | 19086 |
20x SSC | Invitrogen | 15557-036 |
10% SDS | Invitrogen | 15553-027 |
DNA-free | Ambion | AM1906 |
Buffer kit | Ambion | AM9010 |
Formamide | Invitrogen | 15515-026 |