CHIRP är en ny och snabb teknik för att kartlägga genomiska bindningsställen långa icke-kodande RNA (lncRNAs). Metoden drar fördel av specificiteten för anti-sense tiling oligonukleotider för att möjliggöra en uppräkning av lncRNA bundna genomiska webbplatser.
Långa icke-kodande RNA är viktiga regulatorer för kromatin staterna i viktiga biologiska processer såsom dosering kompensation, prägling och utvecklande genuttryck 1,2,3,4,5,6,7. Den senaste upptäckten av tusentals lncRNAs i samband med specifika komplex kromatin ändringar, till exempel Polycomb repressiva komplex 2 (PRC2) som förmedlar histon H3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3) föreslår breda roller för många lncRNAs i hanteringen kromatin tillstånd i en gen-specifik fashion 8,9. Medan vissa lncRNAs tros arbeta i cis på angränsande gener, andra lncRNAs arbeta i trans för att reglera avlägset belägna gener. Till exempel, Drosophila lncRNAs roX1 och roX2 binder många regioner på X-kromosomen av manliga celler och är avgörande för dosering skadestånd 10,11. Emellertid är de exakta lägena för deras bindningsställen inte känt med hög upplösning. På samma sätt kan människor lncRNA HOTAIR påverkar PRC2 beläggningen på Hundreds av gener genomet hela 3,12,13, men hur specificitet uppnås är oklart. LncRNAs kan också fungera som modulära ställningar att rekrytera montering av flera protein komplex. Den klassiska trans-verkande RNA ställningen är den TERC RNA som tjänar som templat och byggställning för telomeras komplex 14; HOTAIR kan också tjäna som en byggnadsställning för PRC2 och en H3K4 demetylas komplex 13.
Tidigare studier kartläggning RNA beläggning på kromatin har avslöjat stora insikter 15,16, men bara på en enda gen locus åt gången. De beläggning platser i de flesta lncRNAs är inte kända, och de roller lncRNAs i kromatin förordningen har främst härledas från de indirekta effekterna av lncRNA störning. Precis som kromatin immunoprecipitation följt av microarray eller djup sekvensering (chip-chip eller Chip-punkter, respektive) avsevärt har förbättrat vår förståelse av protein-DNA interaktioner på en genomisk nivå, här illustrerar vi en recently publiceras strategi för att kartlägga lång RNA-beläggning Genomvid med hög upplösning 17. Denna metod, Chromatin Isolering av RNA rening (CHIRP) (Figur 1), bygger på affinitetsinfångning av mål lncRNA: kromatin komplex med plattsättning antisense-oligonukleotider, som sedan genererar en karta över genomiska bindningsställen med en upplösning på flera hundra baser med hög känslighet och låg bakgrund. CHIRP är tillämplig på många lncRNAs eftersom utformningen av affinitets-prober är okomplicerad given RNA-sekvensen och kräver ingen kunskap om RNA: s struktur eller funktionella domäner.
Här har vi beskrivit CHIRP-punkter, en metod för kartläggning in vivo lncRNA bindningsställen genomet över. De viktigaste parametrarna för att lyckas är de delade poolerna av kakel oligonukleotidprober och glutaraldehyd tvärbindning. Utformningen av affinitets-prober är okomplicerad given RNA-sekvensen och inte kräver någon tidigare kännedom om RNA: s struktur eller funktionella domäner. Vår framgång med roX2, TERC och HOTAIR – tre ganska olika RNA i två arter – tyder på att CHIRP-artiklar är sannolikt generaliserbara för många lncRNAs. Som med alla experiment, är vård och ordentliga kontroller som krävs för att tolka resultaten. Olika lncRNA kan kräva titrering av förutsättningar och förnuftig förändring av villkor, såsom val av olika affinitet prober eller tvärbindningsmedel kan belysa olika aspekter av RNA-kromatin interaktioner. Liksom Chip-punkter, inte alla bindande evenemang nödvändigtvis funktionella, och ytterligare studier krävs för att kontrollera de biologiska konsekvenserna av RNA occupancy på kromatin. Ändå ser vi många intressanta tillämpningar av denna teknik för forskare från andra kromatin-associerade lncRNAs, som nu nummer i tusental 8,9. Precis som Chip-punkter har öppnat dörren för genomet hela utforskning av DNA-protein interaktioner kan CHIRP-Seq studier av "RNA interactome" avslöjar många nya vägar för biologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, och jag Shestopalov för diskussioner. Stöddes av byrån för vetenskap, teknologi och forskning i Singapore (CC), NIH R01-CA118750 och R01-HG004361 (HYC) och California Institute för regenerativ medicin (HYC). HYC är en tidig karriär Scientist av Howard Hughes Medical Institute.
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma Aldrich | G5882-10x10ml |
Motorized pellet mixer | VWR | V8185-904 |
Protease inhibitor | Roche | 11873580001 |
PMSF | Sigma Aldrich | 78830 |
Superase-in | Ambion | AM2696 |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 |
Falcon tubes (for sonication) | Corning | 430790 |
Proteinase K | Ambion | AM2546 |
PCR purification kit | Qiagen | 28106 |
C-1 magnetic beads | Invitrogen | 65002 |
PMSF | Sigma Aldrich | P7626-25G |
DynaMag-15 magnet | Invitrogen | 123-01D |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
MIRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 |
Rnase H | Epicentre | R0601K |
Rnase A | Sigma Aldrich | R4875-100MG |
Phase Lock Gel Heavy | 5 PRIME | 2302810 |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Phenol:chloroform:Isoamyl | Invitrogen | 15593-031 |
Chloroform | Ricca | RSOC0020-1C |
GlycoBlue | Ambion | AM9515 |
Glycine | J.T. Baker | 4057-06 |
PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 |
Elution Buffer (EB) | Qiagen | 19086 |
20x SSC | Invitrogen | 15557-036 |
10% SDS | Invitrogen | 15553-027 |
DNA-free | Ambion | AM1906 |
Buffer kit | Ambion | AM9010 |
Formamide | Invitrogen | 15515-026 |