Cıvıldamak uzun kodsuz RNA'lar genomik bağlanma yerleri (lncRNAs) eşleştirmek için yeni ve hızlı bir tekniktir. Yöntemi lncRNA bağlı genomik sitelerin numaralandırılmasına izin anti-sense fayans oligonükleotidden özgüllük yararlanır.
Uzun kodsuz RNA gibi dozaj tazminat, basma, ve gelişimsel gen ekspresyonu 1,2,3,4,5,6,7 gibi önemli biyolojik süreçler için kromatin devletlerin anahtar düzenleyicileri vardır. Aracılık histon H3 lizin 27 trimethylation (H3K27me3), bir gen-spesifik kromatin devletlerin yönetiminde çok sayıda lncRNAs için geniş rolleri önerdiği gibi Polycomb Baskıcı Kompleksi 2 (PRC2) gibi belirli kromatin modifikasyonu kompleksleri ile birlikte lncRNAs binlerce son keşif moda 8,9. Bazı lncRNAs komşu genler üzerinde cis çalışmak için düşünülen, diğer lncRNAs uzaktan bulunan genleri düzenleyen trans çalışır. Örneğin, Drosophila lncRNAs roX1 ve erkek hücrelerin X kromozomu üzerinde roX2 bağlaması çok sayıda bölge ve dozaj tazminat 10,11 kritik öneme sahiptir. Ancak, bağlanma yerlerinin tam yeri yüksek çözünürlükte bilinmemektedir. Benzer şekilde, insan lncRNA HOTAIR h PRC2 doluluk etkileyebilirgenler genom 3,12,13, ama nasıl özgüllük elde edilir ve undreds belirsizdir. LncRNAs aynı zamanda birden fazla protein komplekslerinin birleşmesini işe modüler iskele olarak hizmet verebilir. Klasik trans-etkili RNA iskele 14 karmaşık telomeraz için şablon ve iskele olarak hizmet TERC RNA; HOTAIR de PRC2 için bir iskele ve 13 karmaşık bir H3K4 demetilaz olarak hizmet verebilir.
Kromatin RNA doluluk haritalama Önceki çalışmalar önemli anlayışlar 15,16 olduğu ancak bir seferde sadece tek bir gen de var. En lncRNAs ve doluluk siteleri bilinmemektedir ve kromatin yönetmelikte lncRNAs rolleri çoğunlukla lncRNA pertürbasyon dolaylı etkilerinin olayla edilmiştir. Kromatin immünopresipitasyon mikroarray veya derin sıralama (sırasıyla ChIP-çip ya da ChIP-seq) tarafından takip ettiği gibi büyük bir genomik ölçekte protein-DNA etkileşimleri anlayışımız geliştirdi, burada bir recen göstermektly yüksek çözünürlükte 17 uzun RNA doluluk genom haritası için strateji yayınladı. Sonra birkaç yüz üsleri çözünürlükte genomik bağlama bölgelerinin bir harita oluşturur antisens oligos, döşeme tarafından kromatin kompleksi: RNA Arıtma (chirp) (Şekil 1), bu yöntemi, Kromatin İzolasyon hedef lncRNA bir afinitesi yakalama dayanmaktadır yüksek hassasiyet ve arka plan düşük. Afinite-prob tasarım RNA sekansı verilen basittir ve RNA yapısı ya da işlevsel etki hiçbir bilgi gerektirdiğinden cıvıldamak birçok lncRNAs için de geçerlidir.
Burada cıvıldamak-seq, in vivo lncRNA bağlayıcı siteleri genom içinde haritalama yöntemi tanımladı. Başarı için anahtar parametreleri oligonükleotid problar ve glutaraldehit çapraz döşeme arasında bölünmüş havuzları vardır. Afinite-prob tasarımı RNA dizisi verilen basittir ve RNA'nın yapı veya fonksiyonel etki hiçbir ön bilgi gerektirir. İki tür üç oldukça farklı RNA'lar – – roX2, TERC ve HOTAIR elde ettiğimiz başarılar cıvıldamak-seq birçok lncRNAs muhtemeldir genellenebilir olduğunu göstermektedir. Tüm deneylerde olduğu gibi, bakım ve uygun kontrollerin sonuçlarını yorumlamak için gereklidir. Farklı lncRNA koşulları titrasyonu ve bu farklı ilgi prob veya çapraz bağlayıcıların seçimi gibi koşullar, politikasıyla değişikliği gerektirebilir, RNA-kromatin etkileşimleri farklı yönlerini vurgulamak olabilir. ChIP-SEQ gibi, tüm bağlama olayları ille fonksiyonel olup, ek çalışmalar RNA o biyolojik sonuçlarını tespit etmek için gerekli olankromatin üzerine ccupancy. Yine de, binlerce 8,9 şimdi sayısı diğer kromatin ile ilişkili lncRNAs, araştırmacıları için bu teknolojinin pek çok ilginç uygulama öngörüyoruz. ChIP-seq DNA-protein etkileşimleri genom araştırmaları için kapıyı açtı gibi, "RNA interactome" nin cıvıldamak-seq çalışmaları biyoloji birçok yeni yollar ortaya çıkarabilir.
The authors have nothing to disclose.
Biz T. Hung, MC teşekkür ederim. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut ve tartışmalar için I. Shestopalov. Bilim, Teknoloji ve Singapur (CC), NIH R01-CA118750 ve R01-HG004361 (HYC) ve Rejeneratif Tıp (HYC) için California Institute of Araştırma Ajansı tarafından desteklenir. HYC Howard Hughes Tıp Enstitüsü bir Erken Kariyer bilim adamıdır.
Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma Aldrich | G5882-10x10ml |
Motorized pellet mixer | VWR | V8185-904 |
Protease inhibitor | Roche | 11873580001 |
PMSF | Sigma Aldrich | 78830 |
Superase-in | Ambion | AM2696 |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 |
Falcon tubes (for sonication) | Corning | 430790 |
Proteinase K | Ambion | AM2546 |
PCR purification kit | Qiagen | 28106 |
C-1 magnetic beads | Invitrogen | 65002 |
PMSF | Sigma Aldrich | P7626-25G |
DynaMag-15 magnet | Invitrogen | 123-01D |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
MIRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 |
Rnase H | Epicentre | R0601K |
Rnase A | Sigma Aldrich | R4875-100MG |
Phase Lock Gel Heavy | 5 PRIME | 2302810 |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Phenol:chloroform:Isoamyl | Invitrogen | 15593-031 |
Chloroform | Ricca | RSOC0020-1C |
GlycoBlue | Ambion | AM9515 |
Glycine | J.T. Baker | 4057-06 |
PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 10010-049 |
Elution Buffer (EB) | Qiagen | 19086 |
20x SSC | Invitrogen | 15557-036 |
10% SDS | Invitrogen | 15553-027 |
DNA-free | Ambion | AM1906 |
Buffer kit | Ambion | AM9010 |
Formamide | Invitrogen | 15515-026 |