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发育中的神经上皮内细胞行为的高分辨率活体成像

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DOI：

10.3791/3920

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2012年4月12日

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1Neural Development Group, Division of Cell and Developmental Biology, College of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK, 2Wellcome Trust Centre for Gene Regulation and Expression, College of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK

本文内容

摘要

长时间实时成像胚胎组织具有挑战性。本文介绍一种可在较长时间内以高空间和时间分辨率监测鸡胚脊髓中细胞及亚细胞水平变化的检测方法。该技术可适用于神经系统及其他胚胎发育区域的研究。

摘要

胚胎脊髓由不断增殖的神经前体细胞组成，这些细胞产生了中枢神经系统（CNS）中大部分的神经元和胶质细胞。尽管关于模式化脊髓并诱导神经元分化的分子机制已有较多研究1, 2，但我们对这些早期事件在细胞行为层面的理解仍然不足。因此，实时研究神经前体细胞在神经发生过程中的行为至关重要。

过去，早期胚胎组织的实时成像受到体外培养中细胞/组织存活能力以及荧光成像光毒性效应的限制。本文介绍一种新颖的检测方法，结合新型的ex vivo组织切片培养方案与宽场荧光显微镜技术（图1），可实现对组织长时间成像。该方法能够以高空间和时间分辨率对鸡胚脊髓前体细胞进行长期的延时监测。

该实验方法可经修改用于成像多种胚胎组织3, 4。除了可用于观察细胞及亚细胞行为外，随着针对基因活性（例如 Notch 信号通路5）的新型高灵敏度报告系统的开发，该实验已成为研究信号通路如何调控胚胎发育过程中细胞行为的有力工具。

方案

1. 培养皿准备

  1. 用于脑片培养的培养皿为玻璃底培养皿（以盖玻片作为底部）（WillCo dishes）。将这些培养皿放置在6 cm组织培养皿内的镜头纸上，以保持玻璃底部清洁。
  2. 实验前一天，向玻璃底培养皿中加入2 ml 0.1%的多聚-L-赖氨酸溶液，在室温下孵育5分钟，使多聚-L-赖氨酸充分包被玻璃底部。
  3. 去除多聚-L-赖氨酸溶液，用去离子水冲洗三次，再用70%乙醇冲洗一次。
  4. 静置过夜晾干。也可将培养皿置于微波炉中，用低功率轻轻加热30–45秒以加速干燥。

2. 胚胎电穿孔

  1. 将鸡蛋在 37 °C 下孵育至 Hamburger-Hamilton (HH) 10 期（约 36 小时）（或其他所需时期）。
  2. 实验开始前，制备玻璃针（我们使用 Flaming/Brown 型号 p87 微量毛细管拉制仪），并在解剖显微镜下用精细镊子折断针尖。针的末端应足够锋利以刺入胚胎，但又不能过于狭窄而阻碍 DNA 溶液的注射。
  3. 打开蛋壳窗口，并在胚胎两侧放置电极（电极间距为 5 mm）。
  4. 将 DNA 溶液（去离子水中含 ~0.025 - 0.5 μg/μl DNA，并加入少量快绿染料显色）注入神经管中。
  5. 施加电流——12–17 V，脉冲三次，每次脉冲持续 50 ms，脉冲间隔 950 ms。
  6. 我们使用低浓度 DNA 和低电穿孔电压以实现嵌合表达，从而能够追踪单个细胞。
  7. 用透明胶带封住蛋壳上的窗口，并确保密封良好。
  8. 让胚胎在 37 °C 下恢复 3–4 小时，或过夜孵育。

3. 胶原蛋白和脑片培养基的制备

  1. 在切片前约一小时，准备好胶原蛋白混合液和切片培养基。
  2. 向 300 μl I 型胶原蛋白中加入 100 μl 0.1% 乙酸溶液和 100 μl 5 x L15 培养基。每次加入后充分涡旋混匀。溶液应变为黄色。
  3. 然后加入 15–20 μl 7.5% 碳酸氢钠，并充分涡旋。溶液应略呈粉红色，所需碳酸氢钠的体积可能有所不同。置于冰上，并每次新鲜配制。
  4. 向 10 ml Neurobasal 培养基中加入 B-27 添加剂和 GlutaMax，使其终浓度为 1 x，并加入 10 μl 庆大霉素溶液。
  5. 将培养基置于以 5% CO2 平衡的 37 °C 培养箱中。容器盖子应留有缝隙，以使其与 CO2 充分平衡。

4. 切片培养

  1. 从卵中取出胚胎，并用L15培养基清洗。
  2. 将胚胎置于底部铺有硅胶（sylgard）的组织培养皿中，通过周围的胚外膜用针固定，使其拉紧。
  3. 使用微型刀片尽可能笔直地切取目标区域。对于脊髓组织，切片厚度应为1-2个体节。在切取其他胚胎时，先将切片保留在胚胎上，以免丢失。
  4. 准备一支200 μl的移液枪头，剪去约1 mm的尖端，并将其连接至P2或P10移液器上。此枪头将用于将脊髓切片转移至玻璃底培养皿中。10 μl的枪头口径过窄，无法有效吸取切片。
  5. 通过移液吸取1 μl预先配制的胶原混合液，使枪头内壁包被胶原。静置1-2分钟，然后用L15培养基冲洗。此步骤可防止组织黏附在枪头内壁。
  6. 使用微型刀片将切片从胚胎上分离，并用装有200 μl枪头且设定体积为1 μl的P2或P10移液器将切片从培养皿中取出。尽量减少吸取的培养基量。
  7. 涡旋混匀胶原混合液，取5-8 μl滴加至已涂覆多聚-L-赖氨酸的培养皿上。
  8. 立即将胚胎切片放入胶原液滴中，并用精细镊子调整其位置。切片应使待成像的一面与盖玻片表面齐平。组织应黏附在盖玻片的多聚-L-赖氨酸涂层上。
  9. 重复此操作，直至盖玻片上放置多个切片。通常可在同一培养皿中放置6-9个切片。
  10. 待所有切片就位后，盖上培养皿，使胶原在20分钟内凝固。部分较早放置的胶原可能已开始干燥，可在盖上皿盖前向其添加少量L15培养基以防止干燥。
  11. 胶原凝固后，小心加入2 ml已在37 °C、5% CO2条件下平衡至少1小时的切片培养基。加液时需注意避免冲起盖玻片上的胶原块。
  12. 将培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中，使切片恢复至少3小时后再进行成像。若培养箱内无足够湿度，可将培养皿放入一个有机玻璃盒中，并在盒角放置少量湿润的纸巾以维持湿度。

5. 胚胎切片成像

  1. 我们使用配备 WeatherStation 环境培养舱的 DeltaVision Core 宽场显微镜对切片进行成像。培养舱始终保持在 37 °C，并通过 CO2 灌注装置将显微镜载物台环境维持在 5% CO2 / 95% 空气。
  2. 成像通常使用 40 x / 1.30 NA 油浸物镜，并通过 CoolSnap HQ2 冷却 CCD 相机采集图像。
  3. 每隔 1.5 μm 采集一次 Z 轴切片，贯穿 45 μm 厚的组织。曝光时间应尽可能缩短，我们通常对每个 Z 切片曝光 5–50 ms。每 7 分钟采集一次图像，利用 DeltaVision 系统的精确定点访问功能，最多可轮询 9 个不同位置的切片。

6. 典型结果

一个脊髓前体细胞的时间推移序列示例显示在 图 2a 以及相应的 视频 1从两天龄（HH 12 期）胚胎的脊髓切片开始进行成像。该细胞转染了表达 GFP-αTubulin 的质粒。在此早期阶段，神经前体细胞主要进行前体-前体模式分裂，即细胞分裂产生两个继续增殖的前体细胞。 图 2b 以及相应的 视频 2 显示一个转染了GFP-GPI（GPI锚定型GFP）的细胞，用于标记细胞膜。该细胞进行分裂，期间基底突起分裂为两部分，并均等地遗传给两个子细胞。

神经管DNA注射、切片、封片、成像；Deltavision宽场显微镜装置。
图1. 用于延时成像的脑片培养实验方案。

GFP-Tubulin 和 GFP-GPI 标记细胞的延时显微成像；随时间变化的荧光分析。
图 2. 正常脊髓发育过程中细胞的行为。(a) 来自视频 1的选帧。表达 GFP-tubulin 的细胞进行分裂，其分裂面垂直于顶面（2 小时 20 分钟），产生两个子细胞，随后这两个子细胞再次分裂（24 小时 23 分钟和 25 小时 54 分钟）。 (b) 来自视频 2的选帧。转染 GFP-GPI 的细胞发生细胞分裂，期间基底突起被分割（白色箭头），并均等地遗传给两个子细胞。

视频 1. 点击此处观看视频。

视频 2. 点击此处观看视频。

讨论

本文介绍一种新型的时间延时成像检测方法，用于监测鸡胚组织切片培养中的细胞行为。该方法可实现对活体组织长达70小时的高分辨率成像，尽管24至48小时的时间范围更容易获取。通过使用高数值孔径（NA）的油镜以及较短的时间间隔，不仅能够以高分辨率采集图像，还可监测那些通常发生迅速、在使用共聚焦显微镜进行常规时间延时成像时容易被遗漏的细胞动态行为。

该检测方法的主要优势在于能够对细胞进行长时间的成像观察。实现这一点的关键在于采用宽场6而非共聚焦激光扫描7显微镜。传统上，共聚焦显微镜相比宽场显微镜具有多项优势，包括能够获取光学切片并直接消除失焦信息7；但其使用针孔会导致探测器接收到的光信号损失8，从而丢失大量信息，并需要更长的曝光时间。相比之下，宽场显微镜采用全视野照明，所有通过物镜的光线均被传送至探测器。结合高量子效率的冷却耦合器件（CCD）相机，可实现比共聚焦显微镜更高的信噪比9，并具有极快的曝光速度。在我们的应用中，必须进行长时间成像、记录三维图像堆栈，并最终分辨出接近衍射极限的小结构。尽管共聚焦显微镜可阻止失焦光线到达探测器，从而显著降低厚且标记密集样品中的背景信号7,8，但其要达到可用的信噪比，所需光输入量远大于宽场显微镜10。因此，对于像我们电穿孔处理的脊髓切片这类光敏感性高且标记稀疏的样品，宽场显微镜的表现优于共聚焦显微镜。当结合反卷积图像重建技术时，宽场显微镜可去除失焦信息并提高对比度，从而特别适用于微弱小结构的检测11。尽管该方法并非适用于所有组织成像实验，但在我们的活细胞成像应用中已证明非常有效。

荧光蛋白的选择是影响细胞存活的重要因素。我们发现，使用绿色荧光蛋白（GFP）12 作为标记的构建体可获得最佳结果。目前我们正在评估一系列红色荧光蛋白，这些蛋白可与 GFP 有效结合，用于双通道时间序列成像。此类蛋白有多种可供选择13。尽管许多蛋白作为荧光蛋白融合体时具有稳定性，但某些蛋白在融合后可能变得不稳定，从而导致细胞活力下降。在此类情况下，使用包含内部核糖体进入位点（IRES）的构建体，有助于将目标蛋白与荧光蛋白分离开来。

在对脊髓切片进行成像时，必须注意尽量减少荧光光源的暴露。显微镜目镜仅可在透射光（明场）模式下用于定位和调整切片位置。荧光图像应始终通过显微镜软件获取，并使用最短的曝光时间，曝光时间应控制在5-50毫秒范围内，并可尝试使用中性密度滤光片。尽管较长的曝光时间最初可能产生更清晰的图像，但荧光光暴露的光毒性效应可能导致细胞死亡。最靠近盖玻片的前5-10 μm组织层不应进行成像，因为该区域的组织可能在切片过程中受到损伤。

尽管此处展示的示例为在HH 10期进行电穿孔并在6-7小时后成像的胚胎，但该方法也可用于高达HH 18期的胚胎。在更晚期的阶段，脊髓组织体积更大，手动切片较为困难。在此类情况下，将胚胎包埋于低熔点琼脂糖中，并使用振动切片机进行切片，可能获得更佳结果。尽管我们将本实验方法作为观察发育中脊髓细胞的成像技术进行介绍，但该方法也已被改进用于其他胚胎组织的成像，包括感觉板3。

参考文献

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