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使用未固定的冷冻组织研究天然黏蛋白分布

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DOI：

10.3791/3928

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2012年9月21日

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego , 2Biosecurity and Public Health, Los Alamos National Laboratory

本文内容

摘要

嵌入最佳切割温度介质（OCT）中的未固定冷冻组织样本可用于研究分泌型黏液的天然分布及其糖基化状态。该方法对组织的处理步骤最少，可保留糖脂、黏蛋白及糖链表位的天然构象。可通过免疫组织化学方法结合荧光或显色检测对组织切片进行分析。

摘要

黏蛋白是一类复杂且高度糖基化的O连接糖蛋白，其糖类成分按重量计超过70%1-3。由杯状细胞和胃黏膜分泌的黏蛋白可形成微米级厚度的黏液层，覆盖于肠道和呼吸道上皮表面3,4。除了黏蛋白外，黏液层还含有抗菌肽、细胞因子和免疫球蛋白5-9。黏液层是宿主先天免疫系统的重要组成部分，构成了抵御入侵微生物的第一道防线8,10-12。因此，黏液会与多种微生物（包括病原体和共生菌）发生广泛的相互作用，而分泌型黏蛋白则成为介导这些相互作用的关键界面。对这类生物学相互作用的研究通常涉及组织取材与染色的组织学方法。在临床和科研实验室中，最常用的两种组织取材与保存的组织学方法分别为：甲醛固定后石蜡包埋，以及组织冷冻后包埋于冷冻保护介质中。

石蜡包埋的组织样本可产生适合组织学观察的优质切片，具有清晰度高和形态结构分明的特点。然而，在石蜡包埋过程中，许多表位会发生改变，为了研究这些表位，组织切片必须经过多种抗原修复方法中的一种进一步处理。13在石蜡包埋脱蜡步骤中，分泌型黏蛋白和脂质会从组织中被提取出来，此过程需要长时间孵育于有机溶剂（二甲苯或Citrisolv）中。因此，该方法在研究黏蛋白和黏液的性质与分布时并非最优选择 体内.

相比之下，将组织在最佳切割温度（OCT）包埋介质中进行冷冻可避免样本的脱水和透明处理，从而保持样本的水合状态。这有助于更好地保存水合的黏液层，进而允许研究黏蛋白在上皮生物学中的多种作用。由于该方法对组织的处理步骤最少，组织得以保持更接近自然的状态。因此，冷冻组织切片在染色前无需任何额外处理，可直接用于免疫组织化学分析。

我们展示了在冷冻的结肠样本中可保存数微米厚的分泌型黏液层。而当相同组织包埋于石蜡中时，该黏液层则显著减少。我们还展示了利用植物凝集素对黏蛋白上的糖链表位进行免疫荧光染色的方法。该方法的优势在于无需使用特殊固定剂，并可利用实验室中已保存的冷冻组织样本。

方案

1. OCT包埋组织

  1. 在浅的泡沫塑料盒中，将干冰加入2-甲基丁烷中，制备冷冻浴。
  2. 采集组织，并用纸巾轻轻吸干以去除多余液体。若使用速冻组织（即在液氮中冷冻的组织），将其置于冷冻切片机舱内，使其温度升至-20 °C。
  3. 向Peel-A-Way冷冻模具中加入少量OCT包埋剂，足以覆盖模具底部即可。
  4. 将组织放入模具中，确保组织按所需方向平置于模具底部。组织块冷冻后，将从底部或侧面进行切片。
  5. 用OCT包埋剂覆盖组织，然后将模具放入冷冻浴中。随着组织冻结，OCT包埋剂会变为白色。
  6. 待完全冻结后，将模具从冻好的组织块上剥离，并放入标记好的冷冻袋中。
  7. 冷冻组织块可于-80 °C保存，直至使用。

2. 组织切片

  1. 将组织块放入冷冻切片机腔室中，使其温度降至 -20 °C（约需 30 分钟）。
  2. 切取 3–5 μm 厚的切片，并将带正电荷的玻璃载玻片置于切片上，组织将黏附于载玻片上。
  3. 将组织在空气中干燥 30–60 分钟。
  4. 载玻片可在此阶段直接使用，也可于 -80 °C 保存以备后续使用。

3. 组织染色

  1. 储存于 -80 °C 的载玻片：将载玻片在室温下解冻并风干 30 分钟。
  2. 用 10% 缓冲福尔马林在室温下固定载玻片 30 分钟。
  3. 在 PBS 或 TBST 缓冲液中洗涤三次，每次洗涤将载玻片在 250 ml 缓冲液中浸洗 10 次。免疫荧光染色可使用 PBS 缓冲液，但若使用碱性磷酸酶偶联抗体进行显色检测，则应使用 TBST 缓冲液，因为 PBS 中的磷酸盐会抑制碱性磷酸酶的活性。
  4. 组织切片载玻片现已准备好进行染色。

4. 使用组织化学染色法（如阿利新蓝和过碘酸雪夫染色）检测黏液

  1. 阿利新蓝染色：
    1. 将切片用清水冲洗，在3%乙酸溶液中室温孵育3分钟。
    2. 用pH 2.5的阿利新蓝染色液室温染色30分钟。
    3. 将切片在流动的自来水下冲洗10分钟，再用去离子水冲洗。
    4. 用核快红复染5分钟，室温。
    5. 用去离子水清洗切片三次。
  2. 过碘酸雪夫染色：
    1. 将切片用清水冲洗，加入新配制的1%过碘酸溶液中孵育5分钟。
    2. 用去离子水清洗三次，再浸入一次miliQ水中。
    3. 用雪夫试剂室温染色15分钟。
    4. 将切片在流动的自来水下冲洗10分钟，再用去离子水冲洗。
    5. 用Surgipath苏木精复染30秒，室温。
    6. 用去离子水清洗切片三次。
    7. 将切片在Scott's自来水溶液中室温孵育30秒。
    8. 用去离子水清洗三次。
  3. 脱水并透明切片：将切片在95%乙醇中孵育1分钟，随后依次快速更换三次100%乙醇，再更换三次Citrisolv，每次2分钟，均在室温下进行。
  4. 用树脂封固剂（Cytoseal 60）将切片封片。

5. 使用凝集素和抗体（表1）通过组织化学方法检测糖类表位

  1. 使用凝集素进行三种糖类表位的荧光检测时，用含1% BSA的PBS在室温下封闭载玻片10-30分钟。
  2. 由于使用了生物素标记的凝集素，需在室温下先用0.1%亲和素孵育15分钟，再用0.01%生物素孵育15分钟，以封闭内源性生物素。
  3. 每次封闭步骤后均用PBS洗涤载玻片。
  4. 在HEPES/NaCl缓冲液（10 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.5）中新鲜配制以下混合液：1 μg/ml罗丹明标记的琥珀酰化小麦胚芽凝集素（sWGA）、1.3 μg/ml生物素标记的Sambucus nigra凝集素（SNA）和5 μg/ml荧光素标记的刺毛黧豆凝集素（Jacalin）。
  5. 将载玻片置于平坦表面或染色盒中，加入上述凝集素混合液覆盖表面。可通过轻轻覆盖一层Parafilm来减少液体体积，Parafilm可使液体展平并防止蒸发。
  6. 在避光条件下室温孵育1小时。
  7. 用PBS洗涤载玻片三次。
  8. 在载玻片上覆盖0.7 μg/ml CY5标记的链霉亲和素（用于检测生物素化的SNA），避光条件下室温孵育30分钟。
  9. 用PBS洗涤载玻片三次。
  10. 用0.1 μg/ml DAPI对细胞核进行复染。
  11. 使用水性封片介质（如VectaMount封片剂或其他水性介质）将载玻片封固于盖玻片上。

6. 控制凝集素染色特异性

  1. 凝集素染色特异性可通过染色前对目标聚糖表位进行特异性酶解或通过小分子竞争来控制。
  2. Sambucus nigra 凝集素（SNA）结合特异性的酶解处理
    1. 将 Arthrobacter ureafaciens 神经氨酸酶（AUS）用50 mM醋酸钠缓冲液（pH 5.5）稀释至250 mU/mL。
    2. 在空的枪头盒底部加入去离子水，以形成孵育过程中的湿盒环境。
    3. 将载玻片正面朝上放置于枪头盒的顶层托架上，每张载玻片上加150–200 μL AUS溶液，然后加盖盖玻片，避免产生气泡。
    4. 盖上盒盖，在37 °C孵育2.5小时。
    5. 在室温下用PBS洗涤载玻片三次，以去除所有游离的唾液酸。这些载玻片在SNA染色中应呈阴性结果。
  3. Jacalin 和 脱乙酰化小麦胚芽凝集素（sWGA）特异性的竞争性抑制剂实验
    1. 将第5.4步制备的凝集素混合液各取200 μL分装至两个Eppendorf管中。
    2. 在一个管中加入200 mM蜜二糖（Jacalin抑制剂），在另一个管中加入1:10稀释的甲壳素水解物（sWGA抑制剂）。
    3. 将含抑制剂的混合液覆盖于阴性对照载玻片上，与其他载玻片同时在室温下孵育1小时。这些载玻片应分别对Jacalin或sWGA染色呈阴性结果。

7. 代表性结果

对石蜡包埋组织样本与冷冻保护介质（OCT）包埋的冷冻组织样本进行比较，发现两者在黏蛋白糖蛋白的保存效果和染色质量方面存在显著差异。使用组织化学染料（如阿利新蓝和过碘酸希夫试剂）对组织进行染色时，相同类型的组织切片在冷冻或石蜡包埋样本中呈现出截然不同的结果（图1）。似乎在石蜡包埋过程中使用的有机溶剂（二甲苯或Citrisolv）会影响上皮细胞表面分泌型黏蛋白的分布，并去除样本中的大部分糖脂（图2）。因此，黏液层在黏膜细胞表面出现塌陷，主要局限于杯状细胞内。而将组织在冷冻保护介质（OCT）中快速冷冻，则能维持样本的水合状态，并保留分泌型黏液层的原有结构尺寸。石蜡包埋过程也以类似方式影响其他与黏液相关的聚糖和糖脂。聚糖分布通过凝集素进行检测，凝集素是糖类检测中常用的工具（图3），此外还使用针对黏蛋白和糖脂上表位的抗体进行检测（图6）。由于凝集素结合特异性尚不完全明确，且受聚糖空间分布及结构本身的影响14,15，因此在凝集素染色中设置适当的对照至关重要。本文展示了在待测组织上控制凝集素染色的两种方法：酶切处理和竞争性抑制。聚糖表位的切除可通过使用特异性针对聚糖的酶消化组织切片实现，例如使用细菌来源的唾液酸酶作为SNA结合唾液酸的对照（图4）。当缺乏可特异性去除目标聚糖表位的酶（例如 糖苷酶）时，可通过添加竞争性抑制剂来验证凝集素的特异性，例如使用蜜二糖作为Jacalin染色的抑制剂，或使用几丁质水解物作为sWGA染色的抑制剂（图5）。

本文证明，临床和科研实验室常规获取的速冻组织样本可进一步包埋于OCT中，用于研究黏蛋白糖蛋白及其上存在的多种聚糖。

凝集素 / 抗体来源主要特异性
LFALimax flavus（黄蛞蝓）末端唾液酸（Terminal Sia）
MAA*Maackia amurensis（东北山黧豆）Siaα2-3Galβ1-R / Galβ1-R 上的 3-O-硫酸化物
SNASambucus nigra（接骨木莓）Siaα2-6Gal / Siaα2-6GalNAc
WGATriticum vulgaris（小麦胚芽）GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc / 唾液酸（Sia）
sWGA琥珀酰化的 Triticum vulgaris（小麦胚芽）GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc
PNAArachis hypogaea（花生）Galβ1-3GalNAc（未修饰的 T 抗原）
JacalinArtocarpus integrifolia（刺桐凝集素）O-连接聚糖上的 Galβ1-3GalNAc
ECAErythrina cristagalli（珊瑚树）Galβ1-4GlcNAc
TKH2抗体O-连接聚糖上的 Siaα2-6GalNAc（STn）
CA19-9抗体Siaα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc（SLea）
SNH3抗体Siaα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc（SLex）

缩写：Ab，抗体；Sia，唾液酸；Gal，半乳糖；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺；GlcNAc，N-乙酰葡萄糖胺；Fuc，岩藻糖；STn，唾液酸基-Tn；SLea，唾液酸基-Lewis a；SLex，唾液酸基-Lewisx。* MAA 的商业来源包括 MALI、MALII 和 MAH。

表1. 用于糖类表位的凝集素和抗体的部分列表。

组织学染色比较；PAS 和 AB 方法；人、小鼠、鸡组织；显微镜观察。
图1. 冰冻和石蜡包埋结肠组织的阿利新蓝与过碘酸-雪夫染色。 对包埋于OCT中的冰冻组织（上图）或石蜡包埋的人、小鼠或鸡结肠组织切片，分别使用过碘酸-雪夫（PAS）或阿利新蓝（AB）进行染色。这两种试剂分别将黏液染成粉红色或蓝色。上图：在冰冻组织中，除杯状细胞内的黏蛋白外，分泌的黏液也清晰可见（箭头所示）。下图：在石蜡包埋组织中，黏液染色仅局限于杯状细胞。细胞核使用Surgipath（PAS）或Mayer（AB）苏木精复染。比例尺为100 μm。 点击此处查看大图。

组织学分析，H&E 和阿尔新蓝染色；肝脏组织与对照组、乙醇组、Citrisolv组的比较。
图2. Citrisolv孵育导致黏蛋白显著丢失。 冷冻鸡回肠标本的连续切片经10%缓冲福尔马林固定后，分别保持水化状态（左图）、通过依次在70%、90%和100%乙醇中各孵育20分钟进行脱水（中图），或在乙醇脱水后用Citrisolv透明1小时（右图）。脱水后的样本在进行苏木精-伊红（H&E）或阿尔新蓝染色前，需重新水化至PBS中。乙醇脱水和Citrisolv透明改善了组织形态学结构（例如，上排图像中，中图和右图与左图相比）。乙醇脱水对阿尔新蓝染色无明显影响（中排图像，比较左图与中图）。相比之下，Citrisolv孵育减少了阿尔新蓝染色信号，并将其限制在杯状细胞内（中排图像，右图），该模式与石蜡包埋组织中观察到的结果相似（图1）。这些数据表明，石蜡包埋样本中黏液颗粒的强染色是由于透明步骤中杯状细胞内黏液发生收缩和浓缩所致。而在冷冻OCT包埋组织中黏液染色较弱且密度较低，反映了黏液在组织中更自然的分布状态。方框区域的高倍放大图像以箭头标示。比例尺表示50 μm（上排和中排）和10 μm（下排）。

冰冻组织与石蜡组织染色；Jacalin、sWGA、SNA 标记物；免疫荧光分析。
图 3. 凝集素对冰冻组织和石蜡包埋组织中糖链表位的结合。 鸡小肠（回肠）标本经 OCT 包埋冷冻（上排）或石蜡包埋（下排），分别用 Jacalin（蓝色）、sWGA（绿色）和 SNA（红色）进行检测。方框区域的高倍放大图以箭头标示。在冰冻组织中，Jacalin 对 O-连接聚糖的结合显示出似乎从杯状细胞渗入管腔的结构（Jacalin，上排，箭头）。相比之下，Jacalin 在石蜡包埋组织中的结合局限于杯状细胞（Jacalin，下排，箭头）和绒毛刷状缘（左下图，箭头）。sWGA 对 β1-4GlcNAc 的染色在冰冻组织（上排，箭头）和石蜡包埋组织（下排，箭头）中均与 Jacalin 凝集素的结合部分共定位。相反，SNA 凝集素对 α2-6 连接唾液酸的结合位于细胞内（SNA，空心箭头），不与 Jacalin 共定位（彩色图像中，SNA 以红色显示，空心箭头标示；Jacalin 以蓝色显示，虚线箭头标示）。比例尺表示 100 μm（左侧图像）和 20 μm（放大方框区域）。

未经处理与AUS处理组织的荧光比较；显微图像展示染色效果。
图4. 使用SNA进行唾液酸染色的酶切对照实验。 鸡小肠组织样本分别在含有250 mU/ml Arthrobacter ureafaciens 神经氨酸酶（AUS）或50 mM pH 5.5醋酸钠缓冲液中，37 °C孵育2.5小时。AUS处理消除了生物素标记SNA的染色信号，证实SNA对唾液酸结合的特异性。比例尺为100 μm。

荧光显微镜，聚糖检测，Jacalin，sWGA，抑制剂效应，结合分析。
图 5. 使用 Jacalin 和 sWGA 进行聚糖染色的竞争性抑制对照实验。 鸡小肠（回肠）组织样本在特异性凝集素抑制剂存在下，与 Jacalin 和 sWGA 混合物共同孵育：蜜二糖（中间列）、壳聚糖水解物（右列）或无抑制剂（A 和 D）。上图：（左）无抑制剂时的 Jacalin 染色；（中）蜜二糖抑制了 Jacalin 染色；（右）壳聚糖水解物未抑制 Jacalin 染色。下图：（左）无抑制剂时的 sWGA 染色；（中）蜜二糖未抑制 sWGA 染色；（右）壳聚糖水解物抑制了 sWGA 染色。该抑制结果证实了凝集素与组织之间的特异性相互作用。星号标记了染色被抑制的图像区域。比例尺为 100 μm。

比较绒毛状癌和黏液癌中MUC5AC、CA19-9标志物染色的组织学切片。
图6. 冷冻人源结直肠癌组织中分泌型黏蛋白、糖脂及糖链表位的检测。 来自绒毛状癌和黏液癌的结直肠癌活检组织经液氮速冻后包埋于OCT中。组织切片先后与针对分泌型黏蛋白MUC5AC、存在于神经节苷脂上的唾液酸化路易斯a糖链表位（结直肠癌标志物CA 19-9）、以及黏蛋白上富集的唾液酸化-Tn糖链表位（使用TKH2抗体检测）的抗体在室温孵育1小时，随后与生物素化驴抗小鼠IgG二抗孵育30分钟，再与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育30分钟。另取部分组织切片与生物素化凝集素SNA和sWGA在室温孵育1小时，随后同样与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育30分钟。辣根过氧化物酶显色使用AEC试剂盒进行。黑色标尺表示200 μm。

讨论

冷冻组织中黏液和糖类表位的保存效果优于石蜡包埋组织。我们展示了与石蜡包埋组织相比，冷冻组织中分泌的黏液层（图1和图3）以及三种糖类结构的分布情况（图3）。已有专门的固定液（如Carnoy's溶液（60%乙醇、30%氯仿、10%乙酸））被开发用于在组织样本中最佳保存黏液层17。理想情况下，该溶液应用于专用于黏液研究的组织样本采集，并已被证明可保持黏液层的平滑外观16-17。未固定的冷冻样本在OCT包埋后，其黏液层表面显得粗糙，某些区域可能从组织上脱落；然而，整体黏液层厚度与经Carnoy's溶液固定后石蜡包埋的组织所观察到的结果一致16-17。例如，冷冻人结肠组织切片中的黏液层厚度约为100 μm（图1），该数值处于经Carnoy's溶液固定的结肠样本报道范围之内（55.4±2.5 μm，范围为7.7 - 204.8 μm）16。

数十年来已知，乙醇脱水会导致生物样本收缩约30%18，而二甲苯、Citrisolv和氯仿等有机溶剂则会从组织中提取脂质、糖脂，并在一定程度上提取蛋白质13。石蜡包埋的组织处理包括以下步骤：固定（10%缓冲甲醛）、脱水（梯度乙醇）和透明（Citrisolv或二甲苯）。通过对未固定的冷冻组织切片模拟这些步骤，我们证明Citrisolv可从冷冻组织切片中提取黏液，从而产生与石蜡包埋组织相似的组织形态（图2，右图）。相比之下，用甲醛或乙醇孵育并未改变黏液层（图2，左图和中图）。这表明标准石蜡包埋程序中的透明步骤（需长时间孵育于Citrisolv/二甲苯中）会导致黏液层塌陷。甲醛固定不会破坏黏液层，经甲醛固定的冷冻组织切片可直接使用凝集素及针对聚糖、糖脂和蛋白质的抗体进行染色（图2、图3和图6）。这些影响在研究膜结合蛋白和组织病理学时可能微不足道，但对于高度水合的结构（如分泌型黏液层）则具有破坏性。然而，目前对黏蛋白的组织学研究仍主要使用石蜡包埋样本，而此类样本中黏液层的保存效果并不理想。对黏液层成分的深入分析，例如精确鉴定分泌型或膜结合型MUC糖蛋白的组合，需要特异性抗体和质谱技术以确定蛋白质骨架。黏液层的保存仅是开展此类研究的初步前提。

许多实验室都保存着过去为不同项目采集并用OCT包埋冷冻的组织样本，这些组织可直接用于研究黏蛋白、糖脂及聚糖分布，从而无需再使用专为保存黏液而设计的特殊固定剂来收集组织。冷冻组织经过的处理步骤较少，因此天然水合状态的聚糖自然分布得以保留。这一点在微生物与宿主相互作用的研究领域尤为重要。了解分泌型黏蛋白及其所携带的多种聚糖结构在“屏障”分子上的自然分布与丰度，对于理解宿主防御机制、微生物的利用策略以及致病过程具有关键意义。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者感谢佐治亚大学的 Nicole M. Nemeth 和洛斯阿拉莫斯国家实验室（LANL）的 Jeanne M. Fair 在采集鸡组织过程中提供的帮助，以及 Steven A. Springer 在拍摄过程中的协助。本研究中所有禽类的饲养与管理均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物人道使用指南，所有实验方案均经洛斯阿拉莫斯国家实验室运营方洛斯阿拉莫斯国家安全有限责任公司（Los Alamos National Security, LLC）的机构动物照护与使用委员会批准（合同编号：DE-AC52-06NA25396，美国能源部）。本研究中对小鼠的照护符合加州大学圣地亚哥分校（UCSD）批准的动物实验方案。人类组织样本的获取遵循加州大学圣地亚哥分校批准的机构审查委员会（IRB）方案。本研究得到了加州大学校长实验室费用计划（University of California Lab Fee President Program）基金项目 118645（P.G.）以及美国国立神经疾病与中风研究所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke）基金项目 NS047101（加州大学圣地亚哥分校神经科学显微成像共享设施）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-甲基丁烷Fisher Scientific03551-4
AEC 过氧化物酶底物试剂盒Vector LabsSK-4200
阿辛蓝Sigma-AldrichA3157
抗 CA 19-9 单克隆抗体CalbiochemCA1003
抗 MUC5AC 单克隆抗体MilliporeMAB2011
亲和素-生物素封闭试剂盒Vector LabsSP-2001
生物素化驴抗小鼠抗体Jackson Immunoresearch90863
生物素化 SNAVector LabsB-1305
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA4503
壳聚糖水解物Vector LabsSP-0090
冷冻切片机Leica MicrosystemsLeica CM 1800
伊红Surgipath Medical Ind.3801570
30% 过氧化氢Fisher ScientificH325-100
刺槐凝集素-FITCVector LabsFL-1151
梅耶氏苏木精Sigma-AldrichMHS32
蜜二糖Sigma-AldrichM5500
核固红Vector LabsH-3403
OCT 包埋剂VWR International25608-930
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素Jackson Immunoresearch94638
希夫试剂Electron microscopy sciences26052
sWGA-罗丹明Vector LabsRL1022S
TKH2 单克隆抗体ATCCHB-9654
VectaMount 水溶性封片介质Vector LabsH-5501
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-4
Peel-A Way 模具Polysciences Inc.18646A-1

参考文献

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