闭塞性细支气管炎在原位肺移植小鼠模型的发展

摘要

闭塞性细支气管炎，肺移植受者长期存活的主要障碍和缺乏一个强有力的临床前模型排除闭塞性细支气管炎免疫病理检查。不同于其他实体器官移植，肺移植血管鼠标只有最近开发。在这里，我们显示我们独立开发的闭塞性细支气管炎模型小鼠原位单肺移植后。

摘要

首先报道于1971年¹ Asimacopoulos和同事在大鼠原位肺移植。目前，这种方法是很好的接受和标准化不仅为异体排斥反应的研究，而且也为研究肺移植后缺血再灌注损伤的机制之间的同源菌株。虽然老鼠和其他大型动物模型^2的应用显着澄清这些研究，这些调查的范围是有限的敲除和转基因大鼠的稀缺。由于没有有效的治疗闭塞性细支气管炎，肺移植患者死亡的首要原因，出现了一个密集的搜索，复制闭塞性细支气管炎的临床前模型。气管移植模型是使用最广泛的，可能会重现一些闭塞性细支气管炎的病理特点^3。然而，缺乏一个完整的vasculat余吕杏茜没有连接到收件人的传导性气道，不完全闭塞性细支气管炎的病理特点限制了这种模式^4的效用。不同于其他固体器官移植，血管小鼠肺移植仅在最近才报道由冈崎和他的同事在2007年^5月首次。我们的实验室应用的大鼠肺移植的基本原则，发起闭塞性细支气管炎模型，利用未成年人histoincompatible抗原小鼠原位左单肺移植手术，让⁶闭塞性细支气管炎的免疫病理的进一步研究。

方案

1。捐助者的程序

1. 利用无菌技术进行所有的外科手术。没有抗生素给捐赠者和接受者小鼠。
2. 对诱导捐助老鼠麻醉开始用5％的异氟醚。
3. 鼠标orotracheally插管用20号静脉导管，然后放在啮齿动物呼吸机，使用125次/分钟，约0.5毫升的潮气量（其体重的2％）的速度在100％的氧气。
4. 吸入1-2％的异氟醚维持麻醉。
5. 捐助鼠标放置在仰卧位，用70％酒精prepped。
6. laparosternotomy进行联合中线和横切口。
7. 肝素100 U /公斤注入下腔静脉（IVC），略低于肝脏。
8. 隔膜被切断沿肋骨向脊柱腹侧附件，胸腔被切割的胸部两侧暴露墙上的脖子。
9. 切开膈肌水平下腔静脉后，右心耳切肺部冲洗2的冷却毫升（4°ç）乳酸林格氏液的注射液和0.1肝素毫升通过1，肺动脉根（横切口PA）的躯干。
10. 逮捕三分之二呼气末通胀通风，心脏，肺块切除冰（4℃）保存。
11. 捐助左肺准备的收件人由袖口附件。肺韧带，切开肺静脉（PV）。肺门取出食道和主动脉。
12. 确定的PA，位于肺门最颅方面，以及附加的（Br）的主支气管。仔细解剖支气管的PA。
13. PA的袖口是由24号静脉注射（IV）导管，并下调至0.5毫米，0.7毫米的延伸长度。
14. 袖口的整个表面，然后打磨，以方便anastoMOSIS。
15. 支气管袖来自20号静脉导管，并削减1.0毫米，0.7毫米的延伸长度。
16. 使用相同的材​​料，光伏袖口不同与捐助鼠标的重量。具体来说，对小鼠24-27克的袖口大小是22号，在0.7毫米延伸长度0.7毫米。对于重27-32克的小鼠，研究利用20号导管，在0.7毫米延伸长度为0.7毫米。
17. 袖口的PA，PV和Br的末端插入，并用9-0缝线担保。
18. 供肺被刷新和入库前的无菌肝素的无菌生理盐水冲洗。供肺，然后在无菌生理盐水中浸泡消毒纱布上冰（4℃），这使肺很干净，无菌包装。
19. 一个微血管钳放在支气管进入气道，防止乳酸林格氏项。

2。收件人程序

1. 诱导的anesthesia和机械通风是相同的，为上述捐助。
2. 左侧胸壁被剃光，用70％酒精和外科领域搭着prepped。
3. 在左侧第三肋间开胸手术切口，延长切口，背部脊柱，和微血管钳置于毗邻心脏左侧肺血管和支气管。你可以看到在脑神经方面的PA，光伏在他们之间的尾端肺门和Br。
4. 使用柔和的止血牵引，导致PA，Br和光伏轻度紧张，左肺被拉到胸腔，而离开中央肺门结构夹住。
5. 钝性分离放置9-0缝合的位置，周围的PA，PV和Br松散分离的PA，PV和Br。
6. 是完全从它的外膜鞘，小横切口约一船的周长的四分之一解剖后的PA制成的前壁，留下完整的背动脉的延续。
7. 冷，乳酸林格氏液浸泡过的纱布包裹，并准备如上所述，供体肺，然后定位到胸腔，袖口插入收件人PA，PV和Br和固定9-0缝合。
8. 肺门交叉钳被删除，允许再灌注损伤和通风。
9. 开胸切口定位到收件人胸部的肺移植后，使用5-0缝合关闭。
10. 鼠标被允许从麻醉中恢复。丁丙诺啡（0.05-0.15毫克/千克）管理后，立即手术，手术后2-3天，每8小时。

3。代表结果

我们的经验告诉我们，它需要几个月的反复实践，成为精通在小鼠肺移植模型。能力达到后，我们一chieved发生手术后七天内与死亡的96％（96/100连续手术）的围手术期存活率。两人死亡是由于出血，开始手术，，并pneumothraces其他两只老鼠的死亡原因。所有程序，热缺血时间为14.32±3.14分钟，冷缺血时间为58.51±18.06分钟。三原位肺移植组进行了研究:同系C57BL / 6→的C57BL / 6，移植:C57BL/10→的C57BL / 6和C57BL / 6→C​​57BL/10。我们只用雄性小鼠，但我们的技术还可以应用到雌性小鼠，这是因为没有显着两性之间的解剖差异。

排斥反应的病理分级进行了一项双盲临床肺移植^7（ 见表1）利用标准的时尚。而我们观察到轻度或无排斥反应，在同系（C57BL / 6→的C57BL / 6），同时移植的组合开发COMPArable急性或慢性排斥反应（ 图1）。相比之下，OB明显更频繁的C57BL/10→C57BL / 6比C57BL / 6→C57BL/10组day28（ 见表1）。

	只C57BL / 6→ C57BL / 6小鼠	C57BL/10→ C57BL / 6小鼠	只C57BL / 6→ C57BL/10	P-值
排斥反应的病理 "A"的成绩在28天	0.67±0.89	* 3.33±0.82	* 3.29±0.76	* P <0.05
在21和28天的OB /共有小鼠	0/24（0％）	** 14/34（42.1％）	** 2/16（12.5％）	**示P <0.05

表1。闭塞性细支气管炎移植后急性排斥反应和患病的组织学评分。急性排斥反应的评分标准CRI（"A"的成绩）teria中所述的有代表性的成果。数据代表"A"的成绩在28天移植后的平均值±标准差。数据代表各组小鼠，发达国家在21天及28移植后的OB的数量和比例。

图1。宏观结果与组织病理学肺移植后28天。 1A小组代表的宏观结果，H＆E染色的同系移植肺和右天真肺。代表小组1B和1C，H＆E和Masson染色染色BL/10肺移植，移植到收件人，分别开发的OB OB和非基本法/ 6小鼠。在1B的白色箭头标识的OB病变。 1D面板显示"基本法"/ 6肺移植移植到BL/10鼠标收件人。

在手术过程中的主要故障排除如下。

1. 血流障碍:冲洗供肺​​，直到颜色变成白色。使用压力过大，可能引起肺水肿。但不推太多，以防止移植后的水肿。
2. 袖口插入到捐助的困难:确定有足够的长度和所附的脂​​肪和结缔组织，血管。
3. 吻合口出血:用Q提示申请约5分钟，受影响网站的压力。
4. 收件人的PA血流梗阻:主要由扭转引起的在袖口插入。如果空气在PA的观察，然后重新做吻合术是必要的。
5. 困难光伏吻合:光伏膜非常薄，容易流泪。选择合适的袖带大小和笔直插入收件人的PV非常轻柔。
6. 收件人光伏血流受阻:确保袖带的位置和方向。释放压缩支气管袖。
7. 气胸:这可能会造成无论是支气管穿孔由于以manipulatio，n的气道，或由于肺表面与移植过程相关的创伤穿孔。前者被视为外科手术的气道壁内孔和后者则通过oversewing肺表面用10-0尼龙缝线泄漏的处理。

讨论

在小鼠原位肺移植是具有挑战性的，由于显微组织的要求和极端脆弱性。袖口技术引进已允许⁸在大鼠原位肺移植的广泛使用。这成为在我们的实验室小鼠原位肺移植模型的发展奠定了基础。与人类不同，在小鼠和大鼠，左肺只包含一个肺叶，只有25％的肺总质量。这使得左单肺移植小鼠模型是可行的，没有循环支持系统的必要性。

我们初步的手术透露，通风和灌注肺移植是高度依赖对光伏吻合的大小。具体光伏吻合袖口大小，利用匹配的捐助者和受助人报告^9。不适当的袖口上浆导致肺不张或肺移植或裂开光伏anastomosis。冈崎等人报告使用合并血管结扎和夹闭支气管^5。在目前的研究中，我们使用所有肺门结构的动脉瘤夹，我们建议可缩短热缺血时间。原位左肺移植小鼠模型中的一个限制是，收件人的动物可以生存后，其移植⁵介导的免疫性坏死。因此，生存的研究是不可行的移植评估取决于病理检查肺移植^10。

使用这种技术，我们已经制定了临床前的闭塞性细支气管炎模型小鼠。具体来说，的捐助鼠标C57BL/10和收件人的C57BL / 6。这表明对未成年人的作用，而不是主要组织相容性抗原闭塞性细支气管炎发病^6。此外，我们已报道中IL-17在小鼠模型防止闭塞性细支气管炎。此模式L代表的检查和肺移植的临床肺移植手术的进步，新的研究工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备名称	公司	目录 数
蔡司OPMI 6SFC-1880	普雷斯科特公司	PMZ014
哈佛鼠类呼吸的	哈佛仪器	55-7058
20号静脉导管	泰尔茂医疗公司	100510D
22号静脉导管	泰尔茂医疗公司	081015S
24压力表静脉导管	泰尔茂医疗公司	100522A
9/0冰毒蓝维珍丝绸	ashaway线和绳索制造配套有限公司	MBVS-90
10-0爱尔康手术缝合	爱尔康公司	8065-192101
"基本法"ACK编织丝绸5-0/18inches	亨利施恩	M652630
肝素钠1000单位/毫升	APP的制药	407156
优碘溶液	普渡产品	67618-150
乳酸林格氏注射液	Hospira公司	NDC 0409-7953-03

老鼠的应变	供应商	年龄，体重	性别，评论
C57BL/10	哈伦只Sprague-Dawley	8-12周，25-30G	男，捐助
C57BL / 6小鼠	哈伦只Sprague-Dawley	8-12周，25-30G	男，捐助者或收件人