尽管目前仍在持续努力将细胞培养体系转向无饲养层条件，人类胚胎干细胞（hESC）的分离与培养在很大程度上仍依赖于与小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的共培养。本文中，我们展示了一种在实验前快速去除hESC培养物中饲养层细胞的新型方法。
本文内容
摘要
摘要
在囊胚分离后，使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）建立人类胚胎干细胞（hESCs）培养体系1该饲养系统可维持hESCs在细胞扩增过程中不发生自发性分化。然而，这种共培养方法耗时耗力，需要高度熟练的技术人员操作，且获得的hESCs纯度较低。4许多实验室已尝试减少hESC培养中饲养细胞的数量（即 使用基质包被的培养皿或其他类型的饲养细胞5-8）。这些改良的培养系统已显示出一定前景，但尚未取代以丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为饲养层来培养人胚胎干细胞（hESCs）的标准方法，后者可有效延缓hESC培养物中非预期的自发性分化。因此，在进行分化实验时，应去除用于hESC扩增的饲养层细胞。尽管已有多种技术可用于从饲养层中纯化hESC集落（如FACS、MACS或使用药物抗性载体），但这些方法往往耗时耗力、成本较高，且可能对hESC造成损伤。本项目旨在建立一种高效的纯化方法，以获得更纯净的hESC群体。我们观察到，在融合生长的hESC培养体系中，可通过简单快速地抽吸去除MEF细胞层，从而实现MEF的清除。该过程依赖于多个因素，包括MEF细胞间较强的侧向细胞连接，以及MEF与聚苯乙烯培养皿之间的黏附力较弱；同时，干细胞集落在形成自身“微环境”过程中具有将成纤维细胞向外推挤的能力。在去除MEF后，我们对hESC进行了长达10天的SSEA-4、Oct3/4和Tra 1-81表达检测，以确认其多能性的维持。此外，去除MEF后hESC集落仍能持续生长并形成更大的集落，从而实现进一步的hESC扩增。
方案
1. 小鼠胚胎饲养层的制备
- 用于hESC共培养的MEF应预先经辐照或丝裂霉素C处理，以抑制细胞分裂。
- 在接种MEF前两小时，用2 ml 0.05%明胶对每个60 mm经等离子体处理的培养皿进行包被。
- 解冻一管经处理的MEF，以约20,000个细胞/cm2的密度接种。
- 过夜培养使细胞贴壁。
2. 将hESC与MEF共接种
- 可通过冻存的细胞系或如下的方法将现有细胞系传代至新的MEF包被培养皿来建立新的细胞克隆。
- 用3 ml预热的1×PBS对含有拟传代的大规模hESC克隆的培养板洗涤1次。
- 加入3 ml胶原酶IV/PBS溶液（1 mg/ml），在37 °C孵育5–10分钟。（注意：与胰蛋白酶处理不同，细胞不会明显分离或团缩成球状）。
- 在细胞仍处于胶原酶处理状态时，使用5 ml移液管吸头的边缘在克隆上划出网格状图案，将其分割成小的细胞团块。
- 将移液管吸头末端垂直于培养板表面，轻轻刮擦培养板底部，使所有细胞从表面脱落。
- 将细胞收集至Falcon管中，在1000 rpm下离心5分钟。
- 离心后，吸除上清液，保留Falcon管中的细胞沉淀。
- 吸除前一天接种的MEF细胞所含的MEF培养基。
- 按1:3的比例将细胞重新接种至新的培养板，并加入3 ml hESC培养基进行培养。
3. 从共培养体系中去除小鼠胚胎成纤维细胞
注意：人 ESC 培养物必须达到高密度，通常在培养 10 至 14 天之间。
- 将吸管的管尖置于培养皿边缘，让负压轻轻吸起 MEF 细胞层的边缘。
- 吸除培养皿中的培养基，并使管尖带动细胞层在培养皿上方以弧形轨迹缓慢移动。注意：细胞层可能会堵塞在吸管管尖，但这通常不会影响操作，用户仍可手动将细胞层从培养皿表面完全剥离。如果细胞粘附在吸管末端，可用培养皿盖顶部轻轻刮擦以分散细胞层，便于完全吸出。
- 立即更换 hESC 培养基，并将培养皿放回培养箱中。
4. 典型结果
MEF 去除过程的最终结果是获得小型且未受干扰的 hESC 克隆（图 1D），这些克隆能够显著扩增形成非常大的克隆（图 2），同时维持多能性标志物 SSEA-4、Oct-¾ 和 Tra 1-81 的表达（图 3）。
图1. ESC集落形态在去除MEF前后的变化 人类胚胎干细胞集落 A) 第1天和 B) 接种至培养皿后的第2天。 C) 高密度 人胚胎干细胞集落（H7）被MEFs包围。两个hESC集落以红色虚线标出。 D) 在使用所述的吸除技术去除MEF后，我们获得了一个孤立的人类胚胎干细胞集落，其周围仅有极少量的MEF细胞环绕该完整集落。
图 2. 去除 MEF 后 10 天的 ESC 克隆扩增。人胚胎干细胞（hESC）在去除 MEF 后的原始克隆 （左） 经培养后扩展为一个非常大的克隆 （右），直径约 800 μm，放大倍数为 10×。注意，原始克隆的成像放大倍数（10×）与复合克隆相同。
图3. MEF去除后hESC集落的免疫染色。 MEF去除后长达10天的免疫荧光鉴定显示，集落仍维持多能性标志物的表达，Oct3/4、SSEA-4和Tra-1-81染色结果清晰可见。此外，这些hESC集落未表现出向中胚层分化的趋势，表现为Flk-1染色阴性。A、E、I和M)分别为免疫荧光染色集落的透射光图像，放大倍数分别为20倍、10倍、10倍和2倍。B、F、J和N)显示免疫荧光染色集落的细胞核——DAPI染色细胞，放大倍数分别为20倍、10倍、10倍和2倍。C-D)仅显示人干细胞标志物SSEA-4的表达及复合图像，放大倍数为20倍。G-H)仅显示人干细胞标志物Oct3/4的表达及复合图像，放大倍数为10倍。K-L)仅显示人干细胞标志物Tra-1-81的表达及复合图像，放大倍数为10倍。M-P)最后一行图像显示在2倍放大下具有典型光滑边界的集落，这些集落不表达O)Flk-1（中胚层分化的早期标志物），也未P)含有成纤维细胞，表现为DDR2染色阴性。
补充视频。 通过片状抽吸去除成纤维细胞。 点击此处观看视频。
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讨论
本文所述方法为从人胚胎干细胞培养物中去除成纤维细胞饲养层提供了一种快速且成本较低的替代方案。成功去除成纤维细胞依赖于在较长时间的干细胞培养后形成的致密汇合单层成纤维细胞。培养7-10天后，生长中的人胚胎干细胞集落会将饲养层成纤维细胞向外推挤，从而在集落之间形成日益致密的成纤维细胞单层。成纤维细胞单层内部牢固的细胞间连接使其能够以细胞片的形式被快速移除。需特别注意的是，该纯化技术仅建议在实验前用于从人胚胎干细胞中去除MEF，而不应用于常规的扩增培养。
也可利用该纯化技术挽救质量较差的干细胞克隆。高质量的人胚胎干细胞（hESC）克隆应与饲养层细胞之间具有清晰的边界。然而，如果干细胞克隆已发生部分分化，克隆边界变得模糊不清，则该方法也可用于在去除MEF细胞层的同时清除部分分化的hESC克隆；但可能需要使用移液器吸头进行物理分离，以切断hESC克隆与不需要的分化细胞或MEF细胞之间的连接。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由加州再生医学研究所的新教员奖 II（RN2-00921-1）以及美国国立卫生研究院资助的国家研究奖（F32-HL104924）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | 成纤维细胞标志物 |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | 细胞核标志物 |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | 人胚胎干细胞标志物 |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | 人胚胎干细胞标志物 |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | 早期分化标志物 |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | 人胚胎干细胞标志物 |
| 表1. 用于人胚胎干细胞免疫染色的特异性试剂表。 |
参考文献
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