工程双层凝胶控制升序分化

摘要

该协议着重于利用干细胞的固有能力，其周围的细胞外基质的线索，被诱导分化成多个表型。这种方法手稿延伸我们描述一个利用双层水凝胶的模型，PEG-纤维蛋白和胶原蛋白的组成和特性，同时脂肪干细胞分化 ¹。

摘要

多年来的天然聚合物获得了更多，因为它们的宿主的生物相容性和交互能力与细胞在体外和体内的重要性，认为在再生医学中的承诺的一个研究领域，是新型生物材料和干细胞的组合使用。在组织工程领域的一个基本战略是指导细胞的功能，使用三维支架（如脱细胞外基质，水凝胶，微/纳米颗粒）。这项技术已经从发现，细胞需要一个基板后，他们能够坚持，增殖，并表达他们分化 ​​的细胞表型和功能^2-3。最近，它也已被确定，细胞不仅使用这些基板的坚持，但也互动，并采取从矩阵基板（例如，细胞外基质，细胞外基质^）的线索。因此，细胞和支架有一个相互连接，为控制组织发展，组织，和最终功能。脂肪干细胞（ASCs）是间质，非造血干细胞存在于脂肪组织，可以表现出多谱系分化的细胞现成的源（即前血管内皮细胞和周细胞）作为。我们的假设是，脂肪干细胞可以向简单的合作，培养他们的不同表型，同时在双层矩阵^1。我们的实验室专注于皮肤伤口愈合。为此，我们建立了从天然生物材料的复合材料基体，纤维蛋白，胶原蛋白，壳聚糖，可以模仿特定皮肤伤口愈合的ECM环境的特点和功能。

方案

1。分离脂肪干细胞^{（ASCs）1，5}

注:所有的程序，在室温下进行，除非另有说明。

1. 分离大鼠肾周和附睾脂肪用无菌汉克的缓冲盐溶液，含1％胎牛血清^{（FBS），（5}先前所描述的HBSS中）。这项研究已进行符合动物福利法"，实施动物福利条例，并按照实验动物护理和使用指南"的原则。
2. 百果组织和转移到1-2克25毫升含有500克50毫升管和离心机在室温为8分钟到1％胎牛血清的HBSS。
3. 收集的自由浮动的脂肪层转移到125毫升三角瓶和治疗胶原酶II型（200单位/毫升）25毫升37°轨道摇床（125转）在45分钟的HBSSÇ。
仔细由pipeting删除的液体部分（油和脂肪层以下）和过滤器，它通过一个100顺序 - 微米和70 - 微米尼龙网过滤器。在500克，在常温下为10分钟，离心滤液，吸上清，用25毫升的HBSS沉淀两次。
4. 悬浮细胞沉淀在50毫升的培养基中补充MesenPRO RS生长补充，抗生素，抗霉菌（100 U / ml的青霉素G，100微克/毫升的硫酸链霉素，两性霉素0.25微克/毫升（MesenPRO RS基础培养基） B）和2毫米的L-谷氨酰胺和移液器细胞分为两个的T75瓶（25毫升/瓶）。
5. 文化在5％CO ₂培养箱孵化ASC在37°C间（通过2-4 ASCs的所有实验中使用....

讨论

ASCs的是众所周知的，他们易于隔离和向多种细胞类型分化的能力。在这个手稿中描述的技术，我们能够利用这些细胞暴露多个biomatrices同时ASCs的可塑性。细胞迁移远离他们的CSM基地，并进入其周围的细胞外环境，细胞采取从断头台上的提示，并可以保持"干细胞"（胶原蛋白），或向血管和血管支持细胞类型（纤维蛋白）被诱导分化。由于我们的实验室是在皮肤及软组织伤口愈合的兴趣，我们的战略实施以来的胶原蛋白和纤维蛋白双层胶原真皮和表皮的再生，支持由主机，而纤维蛋白自然引起血管网的形成^9。此外，它现在的理解，增殖皮肤角质细胞，成纤维细胞，和底层的血管网之间发生串音;这个复杂的机制是非常正确的伤口愈合^10的关键。如果没有一个基本的血管网，组织工程皮肤移植有困难inosculating与宿主组织。因此，我们总体的假设是，胶原蛋白和纤维蛋白，作为ASCs的双层结合使用时，将减少伤口愈合时间，改善血管，皮肤，再上皮化进程的一个或多个阶段。

纤维蛋白是一种多功能的凝血酶介导的一个派生纤维蛋白单体纤维蛋白原裂解后形成的生物聚合物。纤维已应用于临床，作为止血剂.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/设备名称	公司	目录编号	评论
汉克斯平衡盐溶液（HBSS中）	Gibco公司	14175	耗材
胎牛血清	胎牛血清	SH30071.03	耗材
二型胶原酶	Sigma-Aldrich公司	C6685	耗材
70微米尼龙网过滤器	BD公司	352350	耗材
100μm的尼龙网过滤器	BD公司	352360	耗材
MesenPRO生长介质系统	Invitrogen公司	12746-012	耗材
L-谷氨酰胺	Gibco公司	25030	耗材
氯化钙2·2H 2 O	西格玛	C8106	耗材
的T75组织培养瓶	BD公司	137787	耗材
壳聚糖	Sigma-Aldrich公司	448869	耗材
醋酸	Sigma-Aldrich公司	320099	耗材
正辛醇	Acros Organics公司	150630025	耗材
山梨醇单声道，油酸	Sigma-Aldrich公司	S6760	耗材
氢氧化钾	Sigma-Aldrich公司	P1767	耗材
丙酮	Fisher Scientific则	L - 4859	耗材
乙醇	Sigma-Aldrich公司	270741	耗材
硝基苯酸	Sigma-Aldrich公司	P2297	耗材
盐酸	Sigma-Aldrich公司	320331	耗材
乙醚	Sigma-Aldrich公司	472-484	耗材
8微米的细胞培养板插入	BD公司	353097	耗材
1.5毫升离心管	费舍尔	05-408-129	耗材
MTT法试剂	Invitrogen公司	M6494	耗材
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich公司	D8779	耗材
qtracker细胞标记试剂盒（问跟踪655）	分子探针	Q2502PMP	耗材
1型胶原	travigen	3447-020-01	耗材
氢氧化钠	Sigma-Aldrich公司	S8045	耗材
12孔细胞培养板	BD公司	353043	耗材
纤维蛋白原	西格玛	F3879	耗材
凝血酶	西格玛	T6884	耗材
benztriazole衍生的聚乙烯	sunbio	DE-034GS	耗材
平板Tris缓冲（pH值7.6）	西格玛	T5030	耗材
离心分离	Eppendorf公司	5417R	马巴贝西pment
轨道摇床	新不伦瑞克省Scienctific	C24的	设备
湿润的孵化器与空气，5％的CO 2	Thermo Scientific的	370型	设备
架空搅拌器	伊嘉	visc6000	设备
磁力搅拌器	康宁	PC-210	设备
真空干燥器	-	-	设备
粒度分析仪	马尔文	STP2000 Spraytec	设备
水浴	Fisher Scientific则	isotemp210	设备
分光光度计	贝克曼	贝克曼DU 800UV/Visible分光光度计	设备
涡旋	diagger	3030A	设备
酶标仪	分子器件	SpectraMax M2的	设备
光/荧光显微镜	奥林巴斯	IX71	设备
共聚焦显微镜	奥林巴斯	FV-500激光共聚焦显微镜	设备
扫描电子显微镜	卡尔蔡司显微成像	狮子座435副总裁	设备
透射电子显微镜	JEOL	JEOL 1230	设备