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研究鼻咽相关淋巴样组织（NALT）在小鼠疫苗应答中的作用

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DOI：

10.3791/3960

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2012年8月1日

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1U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases

本文内容

摘要

描述了研究鼻咽相关淋巴样组织（NALT）在小鼠经鼻疫苗接种后对鼻腔及全身免疫应答作用的方法。我们展示了一种外科手术操作，以建立依赖于NALT的小鼠模型。 离体 提取的NALT培养物。

摘要

在人类、啮齿类动物及其他哺乳动物中发现的鼻咽相关淋巴组织（NALT）参与鼻窦部位的免疫防御1-3。NALT 是位于硬腭上方鼻腔通道内的两个平行的钟形结构，通常被认为是黏膜相关淋巴组织系统的次要组成部分4-6。NALT 内含有分隔分布的 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞区域，其间散布着抗原呈递树突状细胞4,7,8。这些细胞被一层上皮细胞包围，上皮层中嵌有M细胞，负责从呼吸道黏膜表面摄取抗原9,10。在 NALT 中循环的初始淋巴细胞能够迅速应对呼吸道病原体的初次入侵7。尽管人类在两岁后 NALT 逐渐消失，但韦氏环及其他结构相似的淋巴器官则终生存在6。与人类不同，小鼠终生保留 NALT，因此为研究源自鼻窦的免疫应答提供了便利的动物模型11。

由于单核细胞得率较低，难以对NALT单细胞悬液进行培养。然而，可通过完整器官的ex vivo培养来研究NALT生物学特性，该方法的额外优势在于能够维持天然的组织结构。在in vivo研究中，目前尚无仅特异性影响NALT的基因敲除模型，原因在于对NALT发育通路的理解仍不充分。例如，淋巴毒素-α基因敲除小鼠虽表现为NALT萎缩，但其派伊尔结、外周淋巴结、滤泡树突状细胞及其他淋巴组织也同时发生改变12,13。作为基因敲除小鼠的替代方案，手术切除可永久性去除鼻腔通道中的NALT，且不影响其他组织。由此建立的小鼠模型已被用于阐明NALT与疫苗免疫应答之间的关系1,3。为明确机体对疫苗接种的应答基础，需连续采集血清、唾液、鼻腔冲洗液及阴道分泌物；而直接来源于NALT的免疫应答则可通过组织培养加以验证。以下操作步骤概述了研究经鼻（IN）疫苗接种后局部与全身体液免疫应答所必需的手术操作、组织培养及样本采集方法。

方案

1. NALT 组织的采集与培养

  1. 根据批准的IACUC指南实施小鼠安乐死。避免使用可能影响NALT的吸入性麻醉剂。将小鼠转移至无菌工作区或生物安全柜中。移除小鼠下颌，并用酒精和碘伏擦拭上腭区域进行清洁。
  2. 使用装有11号外科刀片的手术刀柄，沿小鼠门齿和臼齿内侧轮廓小心切割并切除上腭组织。
  3. 用镊子轻轻掀开上腭组织，注意避免撕裂。
  4. 此步骤旨在减少培养污染，适用于批量处理多个上腭样本。将上腭组织分别放入已预先加入250 μL完全培养基（37 °C）的无菌48孔板第一列各孔中，培养基成分为RPMI 1640，添加10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素、100 UI/mL青霉素、50 μg/mL庆大霉素和1 μg/mL抗真菌素/两性霉素B。若将上腭置于5% CO2/95%湿度空气培养箱（37 °C）中培养，应使用碳酸盐缓冲体系；若为非CO2培养条件，则可改用10 mM HEPES（pH 7.4）。
  5. 为清洗上腭组织，使用镊子将组织逐孔转移至同一行的后续孔中，每次换液后轻轻敲击培养板以去除残留物，直至完成总共八次清洗。
  6. 将清洗后的上腭组织转移至新的无菌48孔板中，每孔加入250 μL新鲜的完全培养基（37 °C）。
  7. 将含有上腭组织的培养板置于37 °C培养箱中，根据实验设计持续培养。
  8. 每隔24小时，用无菌操作方式从培养孔中转移100 μL培养基至Eppendorf管中用于取样分析，并立即补充100 μL新鲜的37 °C培养基。
  9. 将收集的培养上清样品在4 °C条件下以380 × g离心10分钟，以沉淀细胞碎片等杂质。
  10. 将离心后的上清液转移至新的Eppendorf管中，保存于-20 °C，待后续分析时使用。
  11. 采用标准酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测组织培养上清中的抗原特异性IgG、IgM和IgA抗体或分泌型细胞因子。

2. NALT 的手术消融

  1. 7至9周龄的雌性BALB/c小鼠是合适的实验对象，但其他品系也可接受。术前3天提供凝胶状湿粮，使小鼠适应术后将给予的食物和水分替代物。
  2. 手术前向口腔内滴入一滴美达克（Metacam）镇痛药（1.5 mg/ml，即每滴0.05 mg）。
  3. 根据IACUC批准的指导方案对小鼠进行麻醉，例如使用氯胺酮、乙酰丙嗪和赛拉嗪混合物（KAX），并在眼睛上涂抹Puralube Vet眼膏以防止角膜干燥。避免使用可能影响鼻相关淋巴组织（NALT）的吸入性麻醉剂。可通过轻捏脚趾无反射反应来确认麻醉效果。
  4. 使用22–28号针头和注射器，在肩胛骨之间皮下注射1 mL生理盐水（0.9%氯化钠注射液，USP），以预防术后小鼠脱水。同时在肩胛骨之间皮下注射0.1 mL Respiram，以促进术中和术后的正常呼吸。
  5. 在所有后续操作过程中为小鼠提供保温支持。
  6. 将麻醉后的小鼠置于仰卧位，用外科缝线分别绕上、下门齿形成两个环，轻轻撬开嘴巴，暴露硬腭。
  7. 使用11号外科刀片，在鼻相关淋巴组织（NALT）所在区域沿硬腭中线做一条长约3 mm的切口。
  8. 将0.5 mm的微型刮匙插入切口，轻轻在边缘下方刮擦，以破坏鼻相关淋巴组织（NALT）。
  9. 使用电热灼仪上的直形细环对切口进行电灼止血。
  10. 在小鼠恢复完全意识和活动能力期间持续提供保温支持。
  11. 根据需要，术后每天最多皮下注射生理盐水三次，每次1 mL，注射部位为肩胛骨之间，以防止脱水；术后3天内每天给予一次口服镇痛药。通过皮肤帐篷试验检测皮肤张力以判断是否脱水：捏起肩胛间的皮肤和毛发使其呈帐篷状。若皮肤迅速恢复原位，则小鼠未脱水；若皮肤保持隆起且回落缓慢，则表明小鼠已脱水，需补充生理盐水。术后至少提供湿粮三天，以确保充分恢复时间。
  12. 在进行任何实验操作前，应连续观察小鼠8–10天，并监测体重增长情况。体重恢复不良通常提示硬腭愈合不完全，此类小鼠应退出后续研究。

3. 鼻咽相关淋巴组织的组织学制备及鼻咽相关淋巴组织手术效果评估

  1. 必须通过以下所述的组织学方法确定NALT手术的成功。完成所有实验研究后，按照批准的IACUC指南实施安乐死，准备小鼠进行颅骨组织取材。避免使用可能影响NALT的吸入性麻醉剂。
  2. 抓住已安乐死小鼠颈部背侧的皮肤。用剪刀在两侧髁突处剪断，将下颌骨从颅骨其余部分移除。
  3. 从颈部背侧开始，缓慢剥离并剪开皮肤和毛发，向颅骨腹侧方向进行，以去除颅骨上的皮肤和毛发。
  4. 小心去除鼻部周围的皮肤，并剪除吻突末端的皮肤，确保完全清除。
  5. 用剪刀剪断颅骨与椎骨之间的连接，使颅骨与脊柱分离。
  6. 将剪刀插入枕骨大孔，沿颅骨中线向下剪切至一半长度，以便在固定过程中甲醛能够渗透进入软组织。
  7. 将颅骨置于10%中性缓冲福尔马林（NBF）中，在室温下固定24小时。
  8. 进行脱钙时，将样本和独立的包埋盒用纱布包裹（防止Rexyn接触骨组织），放入含甲酸混合液的瓶中。室温孵育12小时，随后在自来水下持续冲洗约20分钟。
  9. 使用剃刀刀片将样本修剪至鼻中隔并超过眼眶区域。
  10. 样本及包埋盒可短期保存于10% NBF中。
  11. 将样本放入组织处理机中进行过夜处理。此步骤旨在去除样本中的水分，为石蜡包埋做准备。
  12. 取出处理后的组织，将吻突朝下包埋于石蜡块中，并使其冷却固化。
  13. 使用自动切片机对石蜡块进行粗切，制备约15 μm的横切面，接近NALT的大致位置后，继续以5 μm厚度切片，并在44.3 °C水浴中展片后转移至玻璃载片上。
  14. 应采用苏木精和伊红（H&E）组织学染色法评估NALT的消融情况。

4. 小鼠生物样本的采集

4.1 血清

  1. 使用加热灯小心升高体温可增加血流量。用手术刀片划开侧尾静脉采血，让血液自由滴入微量采血管（含分离胶）中。
  2. 用纱布或毛巾等吸水材料对切口施加轻柔压力，以止血。
  3. 将微量采血管中的血液静置凝固30分钟，然后以6-15 × 1,000 g离心至少90秒。
  4. 将分离出的血清转移至洁净的微量离心管中，于-80 °C保存。

4.2 唾液

  1. 用移液器吸取20–30 μL无菌磷酸盐缓冲液（PBS），在小鼠麻醉状态下将其注入颊部与牙龈线之间。将移液器尖端对准颊部与牙龈线之间，收集稀释后的唾液。
  2. 将稀释后的唾液转移至含有10 μL 2倍蛋白酶抑制剂的新鲜离心管中，并于-20 °C保存。

4.3 鼻腔分泌物

  1. 在采集鼻腔分泌物前，根据批准的IACUC指南对小鼠实施安乐死。避免使用可能影响鼻相关淋巴组织（NALT）的吸入性麻醉剂。
  2. 将小鼠垂直握住，小心地将30 μL无菌PBS加入其中一个鼻孔，并从另一鼻孔收集冲洗液。
  3. 将冲洗液转移至含有10 μL 2x蛋白酶抑制剂的新鲜离心管中，并于-20 °C保存。

4.4 阴道分泌物

  1. 将微量移液器的吸头插入安乐死小鼠外阴开口处，用 50 μL 无菌 PBS 冲洗阴道，并用移液器收集全部液体。
  2. 将冲洗液转移至含有 10 μL 2x 蛋白酶抑制剂的新离心管中，于 -20 °C 保存。

5. 可通过 ELISA 或其他定量方法检测所收集样品中抗原特异性的抗体或细胞因子。

6. 代表性结果

图1 提供了处理含有NALT组织的一般步骤示意图 离体 分析。在 图2（A，B），显示了腭部的大小以及消融手术期间切口的位置（A），如虚线所示。在切除的经苏木精染色的腭部样本中，箭头指示了前磨牙区域 NALT 的位置 图2（C），显示平行的组织。

图3展示了NALT破坏手术的步骤，包括暴露上颚以接触NALT（A、B）、消融（C）以及最终对切口进行烧灼（D）。图3E显示了术前NALT周围鼻窦区域典型的H&E染色横截面，而图3F则展示了手术后立即使用微型刮匙破坏NALT的图像。术后应给予足够时间恢复，此时切口应已闭合，鼻腔内无NALT组织（图3G）。

使用这些技术获得的典型实验结果如图4所示，比较了金黄色葡萄球菌亚单位疫苗（STEBVax）研究中的组织培养上清液和生物样本。小鼠通过鼻内（IN）或腹腔内（IP）途径接种STEBVax疫苗。疫苗制剂中含有可激活Toll样受体4通路的佐剂3,14，对照组仅给予生理盐水或不含佐剂的疫苗。来自实验组的小鼠培养鼻相关淋巴组织（NALT）向培养基中分泌可经ELISA检测的抗原特异性免疫球蛋白。在此示例（图4A）中，结果表明，经含佐剂的亚单位疫苗鼻内免疫的小鼠其NALT释放的IgA量最多。

来自对照组或无NALT小鼠的生物样本（如血清、唾液、鼻腔分泌物、阴道分泌物）可用于分析 体内 与组织培养结果比较的鼻部抗原免疫应答。在 图4B，缺乏功能性NALT时，IN免疫诱导的IgA和IgG反应显著降低。在免疫小鼠的黏膜分泌物（唾液、鼻腔冲洗液）中，抗原特异性IgA水平通常高于IgG。

Mouse palate tissue preparation diagram; sterile technique; tissue culture; centrifugation process.
图1. NALT采集示意图及 离体 培养。

小鼠舌部解剖；用于研究的解剖、测量和组织学染色图像。
图 2. 显示小鼠腭部中NALT位置及手术切口的示意图。上腭的大小和位置，手术切口以虚线标示（A）；上腭被切除（B）或经苏木精染色（C），以观察腭部前磨牙区域的平行NALT结构（在腭部前侧染成深紫色）。NALT由箭头指示。

动物拔牙手术、组织学图像、牙科手术、组织分析。
图 3. 手术破坏鼻相关淋巴组织（NALT）。NALT破坏手术的关键步骤：术前小鼠上腭仰视图（A）；在上腭正中切开以暴露NALT（B）；通过正中切口插入微型刮匙探针以破坏NALT结构完整性（C）；手术结束时对切口进行电灼止血（D）。鼻腔的显微图像，经H&E染色，术前（E）；术后即刻（F）；以及一只成功愈合、无NALT的小鼠（G）。

IgA 抗体吸光度柱状图、免疫反应分析、鼻腔和唾液数据比较
图 4. 来自接种小鼠的培养后鼻相关淋巴组织（NALT）、唾液及鼻腔分泌物中的疫苗特异性抗体。未接受手术或正常的对照小鼠通过鼻内（IN）或腹腔（IP）途径接种 STEBVax 疫苗，并采集生物样本。使用 ELISA 检测三份样本的抗体水平。（A）从对照小鼠（未进行手术操作）中分离 NALT 并进行培养，以检测抗体反应。经鼻内接种的小鼠在培养中产生的疫苗特异性 IgA 反应与对照组相比具有统计学差异（Student t 检验，p ≤ 0.01，相对于无佐剂或无疫苗组）。（B）NALT 结构的破坏显著降低了对鼻内接种的特异性抗体反应。除唾液 IgG 结果外，所有比较中 NALT 缺失组（NALT-）与 NALT 正常组（NALT+）（无手术或对照手术）之间的特异性抗体水平均存在显著差异（Student t 检验，p ≤ 0.05）。

讨论

我们已介绍了一系列用于建立动物模型、获取生物样本以及检测与鼻相关淋巴组织（NALT）免疫反应相关指标的综合方法1-4。在实施这些方法时，还需考虑其他若干因素。手术和组织培养过程中应遵循标准的无菌操作技术。在组织分离与培养期间使用抗菌和抗真菌试剂的组合，并保持器械、操作区域的无菌状态以及腭部的消毒，可降低污染风险。唾液、鼻腔冲洗液及其他类似的黏膜分泌物样本应检查是否可能混有血液，因为血清抗体的浓度通常较高。此外，黏膜分泌物在分析时仅可轻微稀释，因为这些样本中的抗体浓度较血清低得多。

手术后必须使小鼠保持温暖，以防止麻醉引起的低体温。在术后恢复期间，交替将小鼠侧卧放置，以尽量减少呼吸不规则的情况。该手术操作由三人协作完成效率更高：一人进行手术，一人协助打开小鼠口腔，另一人负责小鼠从麻醉中恢复期间的术后护理。

在所有实验操作或研究结束时，必须对颅部横切面进行苏木精和伊红（H&E）染色，以验证每只小鼠手术的成功情况。可能的手术结果包括：完全且双侧的鼻相关淋巴组织（NALT）消融、不完全消融或完整的NALT。由于并非所有手术都能实现NALT的完全缺失，因此残留或完整NALT的动物可作为内部对照。另一种可能的结果是腭部未能完全愈合，留下连接鼻腔与口腔的开口。腭部愈合不全将导致体重偏低和生长不良，此类个体应从研究中剔除。

首先利用小鼠模型检测疫苗反应，有助于确立鼻相关淋巴组织（NALT）在预期研究结果（如抗体反应、存活率等）中的作用。通过手术切除NALT，可明确鼻部对局部和全身免疫的贡献。本文所述的手术方法是获得无NALT小鼠模型最直接的途径。已有报道某些基因敲除小鼠模型缺乏NALT，但这些动物同时缺失对其他次级淋巴组织发育至关重要的细胞因子或趋化因子，可能还存在其他缺陷12,13。此外，本文描述的方法旨在研究源自鼻腔的免疫反应的多个方面。我们的实验结果基于使用小鼠完整上颚组织进行体外培养的研究，尽管也可使用组织切片。最后，体外培养的NALT模型适用于完全在组织培养条件下开展实验。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

支持由 Becton Dickinson Technologies 提供。本提交内容所表达的观点属于作者，不代表反映美国政府的官方政策。研究实施遵循《动物福利法》及其他与动物及涉及动物实验相关的联邦法规，并符合所述原则 实验动物护理与使用指南，国家研究委员会，1996年。开展本研究的机构已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）的全面认证。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
不锈钢无菌手术刀片，11号Miltex4-311
3号刀柄Miltex4-7
48孔细胞培养板Costar3548
RPMI 1640Invitrogen11875-093
胎牛血清，热灭活Gibco/Invitrogen16000-044终浓度：培养基中体积比为10%
硫酸链霉素SigmaS9137终浓度：100 μg/mL
青霉素SigmaP7794终浓度：100 UI/mL
庆大霉素Sigma-AldrichG1397-10ML终浓度：50 μg/mL
制霉菌素（Fungizone）Gibco/Invitrogen15290-018终浓度：1 μg/mL
HEPESSigma-AldrichH0887终浓度：10 mM
Eppendorf 微量离心管Eppendorf022364111
Nutra-gel 小鼠樱桃味湿粮Bio-ServeS4798-TRAY
美洛昔康（Metacam）Boehringer Ingelheim6015310001.5 mg/mL 口服混悬液，一滴
氯胺酮（Ketamine）Pfizer00856440301终浓度：6.06 mg/mL
乙酰丙嗪（Acepromazine）VedcoVEDC207终浓度：0.061 mg/mL
赛拉嗪（Xylazine）Lloyd4811终浓度：0.667 mg/mL
Puralube Vet 眼膏Pharmaderm Animal Health1621
0.9% 氯化钠注射液 USPBaxter2B1302
0.5 mm 微型刮匙RobozRS-6350
热凝止血装置Geiger150-S/150A-S
TCU 替换头，直型细环Geiger214
手术剪
10% 中性缓冲福尔马林SigmaHT501128
甲酸FisherA119P-4将426 mL甲酸加入1047 mL自来水中，然后加入45 mL Rexyn 101 (H)
Rexyn 101 (H)FisherR231-500
Tissue-Tek VIP E150/E300Sakura
旋转式切片机LeicaRM2255
梅耶氏苏木精染液SigmaMHS16-500ML
吉尔1号苏木精染液SigmaGHS116
伊红BSigma2853
Microtainer 血清分离管BD Medical365956
磷酸盐缓冲液100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4
蛋白酶抑制剂混合物，不含EDTAThermo Scientific78415

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