本文介绍了一种高通量方法，用于合成寡糖并将其连接到聚酸酐纳米颗粒表面，以进一步用于靶向抗原呈递细胞上的特定受体。
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本文内容
摘要
摘要
必须采用材料设计、纳米技术、化学和免疫学等多学科交叉的方法，以合理设计高效的疫苗载体。基于纳米颗粒的平台可延长疫苗抗原的存留时间，从而可能提高疫苗的免疫原性1。已有多种可生物降解的聚合物被研究作为疫苗递送载体1；特别是聚酸酐颗粒，已证明能够实现稳定蛋白抗原的持续释放，并可激活抗原呈递细胞及调节免疫应答2-12。
这些疫苗载体的分子设计需要综合合理选择聚合物特性，并整合适当的靶向剂。靶向配体和功能化颗粒的高通量自动化制备是一种强大的工具，将增强研究多种特性的能力，并推动可重复的疫苗递送装置的设计。
添加能够被免疫细胞上特异性受体识别的靶向配体已被证明可调节并定制免疫应答10,11,13。C型凝集素受体（CLRs）是一类模式识别受体（PRRs），可识别病原体表面存在的碳水化合物。通过CLRs刺激免疫细胞可增强抗原的内化及其后续呈递，从而进一步激活T细胞14,15。因此，碳水化合物分子在免疫应答研究中具有重要作用；然而，这些生物分子的应用常受限于结构明确且高纯度碳水化合物的获取困难。基于迭代液相反应的自动化平台可显著减少构建单元的使用量，相比传统固相方法更快速、可控地合成这些具有合成挑战性的分子16,17。
本文报道了一种用于自动化液相合成寡糖（如基于甘露糖的靶向配体）的方案，并采用含氟固相萃取对中间产物进行纯化。在开发出自动化方法以制备基于碳水化合物的靶向试剂后，我们描述了利用LabVIEW控制的自动化机器人系统将这些试剂连接到聚酸酐纳米颗粒表面的方法，该系统此前已有报道10。研究表明，以碳水化合物对颗粒表面进行功能化修饰可有效靶向C型凝集素受体（CLRs）10,11，而提高制备方法的通量，有助于揭示多参数系统的复杂性，具有重要意义（图1a）。
方案
1. 高通量碳水化合物合成
- 在进行二糖的自动化合成之前，需在实验台上合成适当保护的糖供体（通常为三氯乙酰亚胺酯）和受体（主要为烯基氟代醇）。
- 编写用于二糖自动化合成的程序。基本自动化流程的示意图见图2。在程序中需确保，在加入促进剂之前，供体与受体的混合物至少搅拌30分钟。
- 将合成用的供体、受体以及三甲基硅基三氟甲磺酸酯溶于二氯甲烷中。甲苯和二氯甲烷是糖苷化反应中最常用的溶剂。
- 同时，配制用于脱除临时保护基团的试剂溶液，分别使用80%甲醇和100%甲醇。
- 在程序启动前，确保自动化反应腔室内的相对湿度为30%或更低。高湿度对糖苷化反应有害。
- 程序启动后，机械臂依次将供体和受体溶液转移至反应小瓶中，随后混合物搅拌30分钟。
- 接着，机械臂向混合物中加入0.2至0.3当量的三甲基硅基三氟甲磺酸酯，通常在室温下进行，但也可达到如-20 °C的较低温度。反应混合物继续搅拌30分钟。
- 30分钟后，终止反应，并取出少量等分试样以监测反应进程。若反应未完成，可继续反应，并最终调整程序中所需的时间。
- 反应完成后，将反应混合物转移至含有C8F17-修饰硅胶的氟固相萃取（FSPE）小柱进行纯化。
- 首先用8 mL的80%甲醇-水混合液洗涤小柱，以去除非氟代组分。
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讨论
碳水化合物作为靶向剂引导纳米颗粒与免疫细胞相互作用的有效性此前已有报道10, 11。我们实验室先前的研究表明，连接在聚酸酐纳米颗粒上的特定糖分子能够靶向抗原呈递细胞（APCs）上不同的C型凝集素受体（CLRs），从而增强免疫细胞的活化，这可能对后续T细胞的激活具有重要意义10, 11。然而，为了实现最佳靶向效果，需要优化多个参数——例如聚酸酐的化学性质、颗粒尺寸、糖的类型或表面糖密度——因此提高制备方法的通量，以揭示此类多参数系统的复杂性，将具有重要价值。此外，功能化纳米颗粒在其他相关研究领域也具有重要应用价值，包括生物传感、酶固定化以及食源性病原体的检测。
通过采用所述的高通量碳水化合物合成方法，可缓解碳水化合物分子在可重复合成方面所面临的挑战。对同一种糖进行自动化平行反应，可根据需要生成更大量的产物。糖类及糖缀合物的已知生物学功能正在迅速扩展。然而，要理解碳水化合物在诸多过程（例如信号转导通路或细胞识别过程）中的分子机制21，仍依赖于结构明确、易于获得且成本低廉的寡糖。为实现精确的糖链延伸，需通过保护/脱保护策.......
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披露
NLBP 是碳水化合物公司 LuCella Biosciences, Inc. 的联合创始人，并持有该公司股权。
致谢
作者感谢美国陆军医学研究与物资司令部（资助号：W81XWH-10-1-0806）和美国国立卫生研究院（资助号：U19 AI091031-01 和资助号：1R01GM090280）提供的经费支持。BN 感谢 Balloun 化学与生物工程讲席教授职位的支持，NLBP 感谢 Wilkinson 跨学科工程讲席教授职位的支持。我们感谢 Julia Vela 在开展纳米颗粒功能化实验过程中提供的协助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 电动 XYZ 位移台：3x T-LSM050A，每轴行程 50 mm | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 单通道注射泵 | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* 无边可重复使用玻璃培养管 | Corning | 07-250-125 | |
| ASW 1000 | Chemspeed Technologies | ||
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE 气密式注射器，鲁尔锁口 | Sigma Aldrich | 509507 | |
| XL-2000 超声波破碎仪 | Qsonica | Q55 | |
| 微型管旋转混合器 | Fisher Scientific | 05-450-127 |
参考文献
- Zepp, F. Principles of vacine design-lessons from nature. Vaccine. 28, C14-C24 (2010).
- Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-....
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