高通量合成碳水化合物及聚酸酐纳米颗粒的功能化

摘要

本文介绍了一种高通量方法，用于合成寡糖并将其连接到聚酸酐纳米颗粒表面，以进一步用于靶向抗原呈递细胞上的特定受体。

摘要

必须采用材料设计、纳米技术、化学和免疫学等多学科交叉的方法，以合理设计高效的疫苗载体。基于纳米颗粒的平台可延长疫苗抗原的存留时间，从而可能提高疫苗的免疫原性¹。已有多种可生物降解的聚合物被研究作为疫苗递送载体¹；特别是聚酸酐颗粒，已证明能够实现稳定蛋白抗原的持续释放，并可激活抗原呈递细胞及调节免疫应答^2-12。

这些疫苗载体的分子设计需要综合合理选择聚合物特性，并整合适当的靶向剂。靶向配体和功能化颗粒的高通量自动化制备是一种强大的工具，将增强研究多种特性的能力，并推动可重复的疫苗递送装置的设计。

添加能够被免疫细胞上特异性受体识别的靶向配体已被证明可调节并定制免疫应答^10,11,13。C型凝集素受体（CLRs）是一类模式识别受体（PRRs），可识别病原体表面存在的碳水化合物。通过CLRs刺激免疫细胞可增强抗原的内化及其后续呈递，从而进一步激活T细胞^14,15。因此，碳水化合物分子在免疫应答研究中具有重要作用；然而，这些生物分子的应用常受限于结构明确且高纯度碳水化合物的获取困难。基于迭代液相反应的自动化平台可显著减少构建单元的使用量，相比传统固相方法更快速、可控地合成这些具有合成挑战性的分子^16,17。

本文报道了一种用于自动化液相合成寡糖（如基于甘露糖的靶向配体）的方案，并采用含氟固相萃取对中间产物进行纯化。在开发出自动化方法以制备基于碳水化合物的靶向试剂后，我们描述了利用LabVIEW控制的自动化机器人系统将这些试剂连接到聚酸酐纳米颗粒表面的方法，该系统此前已有报道¹⁰。研究表明，以碳水化合物对颗粒表面进行功能化修饰可有效靶向C型凝集素受体（CLRs）^10,11，而提高制备方法的通量，有助于揭示多参数系统的复杂性，具有重要意义（图1a）。

方案

1. 高通量碳水化合物合成

1. 在进行二糖的自动化合成之前，需在实验台面上合成适当保护的糖供体（通常为三氯乙酰亚胺酯）和受体（主要为烯基氟代醇）。
2. 编写用于二糖自动化合成的程序。基本自动化流程的示意图见图2。在程序中需确保，在加入促进剂之前，供体与受体的混合物至少搅拌30分钟。
3. 将合成用的供体、受体以及三甲基硅基三氟甲磺酸酯溶于二氯甲烷中。甲苯和二氯甲烷是糖苷化反应中最常用的溶剂。
4. 同时，配制用于脱除临时保护基的试剂溶液，分别使用80%甲醇和100%甲醇。
5. 在程序启动前，确保自动化反应腔室内的相对湿度为30%或更低。高湿度对糖苷化反应有害。
6. 程序启动后，机械臂依次将供体和受体溶液转移至反应小瓶中，随后混合物搅拌30分钟。
7. 接着，机械臂向混合物中加入0.2至0.3当量的三甲基硅基三氟甲磺酸酯，通常在室温下进行，但也可达到如-20 °C的较低温度。反应混合物继续搅拌30分钟。
8. 30分钟后，终止反应，并取出少量等分试样以监测反应进程。若反应未完成，可继续反应，并最终调整程序中所需的时间。
9. 反应完成后，将反应混合物转移至含有C₈F₁₇修饰硅胶的氟固相萃取（FSPE）小柱进行纯化。
10. 先用8 mL的80%甲醇-水混合液洗涤小柱，以去除非氟代组分。
11. 然后用100%甲醇洗涤小柱，以获得目标氟标记产物。若需进一步纯化，可暂停仪器，取出反应产物通过其他方法进行额外纯化。
12. 纯化循环结束后，机械臂向反应小瓶中加入甲醇钠。反应搅拌2小时。若反应未完成，可继续延长反应时间，并最终调整程序中设定的反应时间。
13. 反应完成后，产物通过FSPE纯化，随后溶于无水甲苯，再经蒸发除去残留水分。
14. 然后重复该循环（从第6步到第13步），直至目标分子达到所需的链长。
15. 从自动化系统中获得的保护态产物需进一步纯化，并通过核磁共振（NMR）波谱等技术进行充分表征。最终目标分子的完全去保护（即脱除所有剩余保护基）通常在自动化平台之外完成，因为该步骤通常涉及易爆的氢气和钯催化剂。最终的去保护步骤在实验台面上、自动化平台外进行：第一步为氟代标签中双键的臭氧分解，随后将生成的醛氧化为羧酸；产物通过柱层析纯化；最后一步为钯催化氢解去除苄基醚保护基，产物经硅藻土垫过滤以除去钯，得到纯净的最终产物。

2. 高通量纳米颗粒表面功能化

1. 高通量聚合物合成与纳米颗粒制备按照 Petersen et al¹⁹. 所描述的相同方案和机器人装置进行。用于颗粒制备的共聚物体系基于癸二酸（SA）与1,6-双（对-羧基苯氧基）己烷（CPH），以及1,8-双（对-羧基苯氧基）-3,6-二氧杂辛烷（CPTEG）与CPH。所用机器人点样装置的示意图见图1b。
2. 完成纳米颗粒制备后，将装有纳米颗粒文库试管的支架重新连接至线性执行器平台。
3. 为将碳水化合物连接至聚酸酐颗粒表面，需进行一种胺-羧酸偶联反应²⁰，该反应包含两个连续步骤。
4. 第一步反应中，第一台可编程注射泵的注射器内装入10当量（eq.）（以颗粒表面平均摩尔羧酸浓度为基准）的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10当量的乙二胺水溶液，第二台可编程注射泵的注射器内则装入12当量的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）水溶液。
5. 通过LabVIEW程序，将试剂悬浮液点样至纳米颗粒文库*中。
6. 随后，每个样品经超声处理（40 Hz下30秒），并将试管支架从机器人平台拆下。
7. 纳米颗粒悬浮液在4 °C下以恒定旋转孵育9小时**。
8. 反应完成后，将试管离心（12000 × g，5分钟），并送回机器人工作站进行两次洗涤步骤。
9. 洗涤过程中，第一台可编程注射泵的注射器保持空置，第二台注射泵的注射器内装入冷水。将每根试管中的上清液吸入空注射器，再由第二台泵注入冷水。
10. 纳米颗粒悬浮液的均质化处理按步骤2.6所述进行。随后将试管离心（12000 × g，5分钟），并按步骤2.9所述进行第二次洗涤。
11. 第二步反应采用两次点样操作。第一次点样时，一台泵装载12当量EDC，另一台泵装载12当量NHS。
12. 第二次点样包括在第一和第二泵中分别装载10当量的特定单糖（即半乳糖、乳糖或双甘露糖）***，以及第三台泵装载10当量乙醇酸（作为对照****）。
13. 纳米颗粒悬浮液按步骤2.6所述进行均质化处理，并在4 °C下以恒定旋转孵育9小时。
14. 反应时间结束后，按步骤2.8、2.9和2.10所述进行一次洗涤步骤。
15. 功能化纳米颗粒文库随后置于真空干燥箱中干燥至少2小时。
16. 对功能化纳米颗粒采用X射线光电子能谱和高通量苯酚-硫酸法进行表征，以分别确定其表面组成和糖类浓度。采用扫描电子显微镜和动态光散射技术测定颗粒粒径、粒径分布及表面电荷。

注意事项：*每管中沉积体积随所含纳米颗粒的质量而变化。
**第一和第二步反应的反应时间可根据需要调整，以调节最终寡糖浓度。
***每种寡糖根据实验分组需求分别加入不同的试管中。
****本研究所采用的特定碳水化合物连接反应中，使用羟基乙酸作为连接子对照，因为去保护的寡糖已共价连接该分子，从而可进一步与纳米颗粒表面结合。

3. 代表性结果

如图2所示的完全保护的双甘露糖苷通过自动化平台合成。该合成化合物使用CDCl₃作为溶剂，在VXR 400 MHz波谱仪上通过¹H NMR进行表征。核磁共振谱图如图3所示。

利用本文所述的聚酸酐纳米颗粒的高通量制备与功能化方法，已成功实现双甘露糖、乳糖和半乳糖的偶联^{10, 11}。通过该实验体系，确定了实现理想纳米颗粒功能化及形貌的最优反应条件（即反应温度和时间）。当反应在4 °C而非室温下进行时，扫描电镜（SEM）观察到纳米颗粒聚集减少（数据未显示）。表1展示了在4 °C条件下合成的、分别功能化双甘露糖或乳糖的50:50 CPTEG:CPH纳米颗粒的代表性表征结果。数据显示，由于功能化修饰，纳米颗粒的平均直径略有增加。未功能化的纳米颗粒具有约-20 mV的负zeta电位，而功能化后的颗粒则呈现正zeta电位，表明纳米颗粒表面的功能化成功实现。乳糖和双甘露糖均为中性糖；然而，用于连接糖类的乙二胺连接剂中的游离氨基可能引起zeta电位的正向变化。

反应时间是另一个可能影响纳米颗粒最终形貌及糖类连接程度的变量。通过调节反应时间，可以控制连接到纳米颗粒表面的最终糖浓度，如图4A所示。正如预期，50:50 CPTEG:CPH 纳米颗粒表面的双甘露糖浓度随着总反应时间的延长而增加，并在18小时后达到最大值。采用总反应时间为24小时的纳米颗粒，评估其靶向小鼠骨髓来源树突状细胞（DCs）上C型凝集素受体（CLRs）的能力。通过流式细胞术评估在非功能化、乳糖功能化以及双甘露糖功能化纳米颗粒刺激后，两种C型凝集素受体（即CIRE（CD209，DC-SIGN）和甘露糖受体（CD206））的表达情况（图4B）。当细胞受到乳糖和双甘露糖功能化纳米颗粒刺激时，两种受体的表达水平均更高，表明实现了有效靶向。然而，双甘露糖功能化的颗粒显示出更高的受体表达水平，提示该配体对所研究的受体具有更高的特异性。

纳米颗粒类型	平均粒径 (nm)	平均粒径 ζ-电位 (mV)
非功能化	162 ± 43	-20 ± 0.6
乳糖	235 ± 34	26 ± 2.4
二甘露糖	243 ± 32	30 ± 4.2

表1. 纳米颗粒表征。通过准弹性光散射和ζ电位测量对非功能化和功能化的纳米颗粒进行了表征。粒径数据表示三次独立实验中采集的动态光散射数据的平均值±标准差（SD）。ζ电位数据表示三次独立测量读数的平均值±SD。ζ电位符号的变化表明糖已成功偶联至50:50 CPTEG:CPH 纳米颗粒表面。

图1. (A) 多酸酐纳米颗粒碳水化合物功能化的研究策略示意图，以及利用所述高通量方法设计的功能化纳米颗粒文库的一个示例。(B) 用于颗粒功能化的自动沉积装置的示意图，该装置包括：(i) 三台NE 1000泵；(ii) 一个由两个执行器（Zaber）集成的机器人平台：一个用于x方向移动，另一个用于y方向移动；(iii) 第二个机器人平台，配有两排相邻的支架（适用于试管和比色皿），包含三个执行器，分别对应三个方向（x、y和z）。泵和总共五个执行器以串联方式连接。执行器和泵通过计算机使用LabVIEW软件进行控制。本示意图未按比例绘制。 点击此处查看大图。

图2. 以甘露糖为例，展示利用自动化迭代合成方法合成碳水化合物的示意图。

图3. 保护态双甘露糖苷的¹H NMR谱图。

图4. (A) 反应时间对纳米颗粒表面糖类浓度的影响。图中数据显示，50:50 CPTEG:CPH 纳米颗粒在4 °C条件下与二甘露糖在不同反应时间下进行功能化修饰。结果展示的是两次独立功能化实验的平均值及标准误差。(B) 乳糖和二甘露糖功能化的纳米颗粒可有效靶向骨髓来源树突状细胞上的DC-SIGN（CIRE, CD209）和甘露糖受体（CD206），表现为经功能化修饰的50:50 CPTEG:CPH 纳米颗粒刺激后，这两种标志物的表达水平较非功能化颗粒显著增强。

讨论

碳水化合物作为靶向剂引导纳米颗粒与免疫细胞相互作用的有效性此前已有报道^{10, 11}。我们实验室先前的研究表明，连接在聚酸酐纳米颗粒上的特定糖分子能够靶向抗原呈递细胞（APCs）上不同的C型凝集素受体（CLRs），从而增强免疫细胞的活化，这可能对后续T细胞的激活具有重要意义^{10, 11}。然而，为了实现最佳靶向效果，需要优化多个参数——例如聚酸酐的化学性质、颗粒尺寸、糖的类型或表面糖密度——因此提高制备方法的通量，以揭示此类多参数系统的复杂性，将具有重要价值。此外，功能化纳米颗粒在其他相关研究领域也具有重要应用价值，包括生物传感、酶固定化以及食源性病原体的检测。

通过采用所述的高通量碳水化合物合成方法，可缓解碳水化合物分子在可重复合成方面所面临的挑战。对同一种糖进行自动化平行反应，可根据需要生成更大量的产物。糖类及糖缀合物的已知生物学功能正在迅速扩展。然而，要理解碳水化合物在诸多过程（例如信号转导通路或细胞识别过程）中的分子机制²¹，仍依赖于结构明确、易于获得且成本低廉的寡糖。为实现精确的糖链延伸，需通过保护/脱保护策...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电动 XYZ 位移台：3x T-LSM050A，每轴行程 50 mm	Zaber Technologies	T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 单通道注射泵	New Era Pump Systems	NE-1000
Pyrex* Vista* 无边可重复使用玻璃培养管	Corning	07-250-125
ASW 1000	Chemspeed Technologies
LabVIEW	National Instruments	776671-35
SGE 气密式注射器，鲁尔锁口	Sigma Aldrich	509507
XL-2000 超声波破碎仪	Qsonica	Q55
微型管旋转混合器	Fisher Scientific	05-450-127