量子点的溶解与生物偶联及通过生长曲线和菌落计数进行的细菌毒性检测

摘要

半导体量子点（QDs）等纳米颗粒可用于制备光活化试剂，以用于抗菌或抗癌应用。本技术展示了如何使碲化镉（CdTe）量子点水溶化，将其与抗生素偶联，并基于生长曲线和平板计数进行细菌抑制实验。

摘要

量子点（QDs）是一类荧光半导体纳米颗粒，其发射光谱依赖于尺寸，并可由多种波长的光激发。由于具有明亮且稳定的荧光特性，量子点在成像、诊断和治疗领域受到广泛关注^{1,2 3,4,5}。量子点可与多种生物活性分子偶联，用于结合细菌和哺乳动物细胞⁶。

量子点（QDs）也正在被广泛研究作为靶向杀灭细菌的细胞毒性试剂。多重耐药菌株的出现正迅速演变为一场公共卫生危机，尤其在革兰氏阴性病原体方面尤为严重⁷。由于某些纳米材料（尤其是银，Ag）具有广为人知的抗菌效应，已有数百项研究探讨了纳米颗粒对细菌的毒性作用⁸。此外，其他类型的半导体纳米颗粒也被用于细菌相关研究，特别是二氧化钛（TiO₂）^9,10-11，以及氧化锌（ZnO）¹²和氧化铜（CuO）¹³等。在这些研究中，部分开展了不同细菌菌株之间的比较，通常为革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的对比。对于所有这些纳米颗粒，其毒性机制均归因于氧化作用：或是颗粒在光照下产生活性氧物种（ROS），或是直接释放可引发氧化毒性的金属离子。即便使用这些材料，不同研究的结果仍存在巨大差异。一些研究报道革兰氏阳性测试菌株比革兰氏阴性菌更敏感¹⁰；而在另一些研究中则恰恰相反¹⁴。这些研究已得到充分综述¹⁵。

在所有纳米颗粒研究中，颗粒的组成、尺寸、表面化学性质、样品老化/降解情况，以及光照的波长、功率和持续时间，均可能显著影响实验结果。此外，还需考虑合成副产物和溶剂的影响^{16 17}。为了能够开发出有效的新型纳米药物制剂，亟需高通量筛选技术。

CdTe量子点单独使用¹⁸或与抗生素联合使用均具有抗菌作用。在之前的一项研究中，我们发现将抗生素与CdTe偶联可增加对细菌的毒性，但会降低对哺乳动物细胞的毒性，这归因于偶联物产生的活性氧减少¹⁹。尽管含镉化合物不太可能被批准用于人体，但此类制剂可用于物体表面的消毒或水的灭菌。

在本方案中，我们提供了一种使用巯基丙酸（MPA）溶解 CdTe 量子点的简便方法。该量子点可在一小时内完成制备并直接使用。随后，我们展示了将其与抗菌剂偶联的方法。

实验方案的第二部分展示了使用偶联与非偶联量子点的96孔细菌抑制实验。通过在数小时内连续测定光密度，可即时评估量子点添加和光照处理的效果，并可在恢复培养后进一步评估其影响。我们还展示了通过菌落计数来定量分析细菌存活率的方法。

方案

1. 量子点溶解

该方法适用于CdTe。其他类型的量子点（如InP/ZnS²⁰和CdSe/ZnS²¹）也可采用类似方法。

1. 将 CdTe 量子点（QDs）溶于甲苯中，配制成 15 μM 的溶液（在第一激子吸收峰处的光密度为 2.5）。
2. 取 200 μL 该储备液转移至玻璃小瓶中。切勿使用塑料容器！
3. 加入 800 μL 甲苯、1 mL 200 mM 硼酸盐缓冲液（pH 9）以及 2 μL 11.5 M 巯基丙酸（MPA）。
4. 盖紧瓶盖，剧烈震荡 30–60 秒。
5. 水相与有机溶剂相将自发分层，水相呈现量子点的颜色。为避免甲苯层干扰，将其移除并弃去，然后将水相转移至洁净的小瓶中。
6. 使用截留分子量为 10000 的 500 μL 离心过滤器对溶解的量子点进行纯化，洗涤/过滤共四次。每次以 3000 × g 离心 13 分钟。最后至少两次洗涤使用所需的最终缓冲液进行。
7. 最后一次洗涤后，将纯化后的量子点重悬于 50 mM 硼酸盐缓冲液中，调节至所需 pH 值，并在 4 °C 下保存。样品可稳定保存 1–2 周。
8. 测定吸收光谱和发射光谱，依据已发表的公式 ²²估算其浓度。

代表性结果：图1展示了CdTe量子点在紫外灯照射下的图像，以及水溶化处理前后的发射光谱，显示配体交换引起的光谱变化可忽略不计。尺寸数值为通过电子显微镜测得的核直径。

2. 量子点与抗生素的偶联

本实验方案的这一部分适用于任何带负电荷的水溶性纳米颗粒，包括大多数商用量子点（QDs）、金属颗粒等¹⁹。

1. 任何分子均可使用，只要其能够自发组装到带负电荷的可溶性量子点（QDs）上，或含有可进行偶联的反应性基团（例如伯胺）。在此示例中，我们使用带正电荷的多粘菌素B（PMB），它可自发组装，无需偶联试剂。将PMB溶解于H₂O₂ 在 60 μM.（如果所选抗生素不溶于H₂O，用DMSO或乙醇溶解，浓度为0.1–1 mM）。此溶液为10倍浓缩液（在H₂O）或100倍浓度溶液（溶剂中）。
2. 计算细菌毒性实验所需的QD溶液量。对于每孔0.3 mL、设四个重复的96孔板，需要0.5 mL的200 nM偶联物。准备两支试管，每管含有100 μ1 升 μM量子点溶于50 mM硼酸盐缓冲液中。
3. 若与伯胺偶联，将1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶于H₂O. EDC 溶液不稳定，需立即使用，剩余部分应丢弃。
4. 加入50 μL 的 10 倍抗生素溶液（溶于 H₂O）或 5 μ将50 L的100倍溶液（溶于溶剂中）加入到偶联管中。对于摩尔比为30:1的PMB:CdTe偶联，添加50 μ60 升 μM PMB。加入H₂向仅含量子点的对照管中加入 O 或溶剂。
5. 如有需要，添加 1 μ向偶联管中加入 EDC 储存液 L。
6. 用适当的缓冲液（硼酸盐缓冲液或PBS；避免使用含胺缓冲液如Tris，因其会抑制EDC反应）将结合物体积调至0.5 mL。
7. 用铝箔将管子遮光，并在旋转摇床或摇床上孵育1小时。如果发生聚集，应使用较低浓度的抗生素重复偶联反应。逐步提高浓度，直至颗粒不再发生聚集。
8. 使用适当的滤器冲洗偶联物。对于大多数抗生素，可采用10000分子量截断值的滤器，但不适用于蛋白质或抗体。
9. 根据分子的不同，可采用多种方法来估算每个量子点所结合的抗生素分子数量：吸光度或荧光光谱法、凝胶电泳法或傅里叶变换红外光谱法（FTIR）。

代表性结果。 在本示例中，PMB 的偶联通过量子点发射光谱的变化进行表征。图2展示了添加PMB后CdTe量子点的光谱。

3. 96孔筛选用细菌的制备；抗生素IC₅₀的测定

这适用于在适当培养基中培养的几乎所有细菌菌株¹⁸。记录持续的确切时间取决于细菌的生长速率。在本示例中，我们使用在溶菌肉汤（LB）培养基中培养的大肠杆菌（Escherichia coli）。

1. 为了选择合适的量子点偶联物浓度，了解IC₅₀ 待偶联抗生素的浓度以及量子点（QDs）单独是否存在毒性。此项工作应在偶联实验开始前2天进行。傍晚时，采用无菌及生物安全操作技术，从新鲜菌落接种10 mL细菌培养基。
2. 次日，在实验前1-2小时，向透明底96孔板的每个孔中加入接近最大容量的培养基。使用多通道移液器，向每孔接种1-50个 μ细菌培养物的体积（具体浓度取决于特定菌株的生长速度，需由实验室自行校准）。
3. 将培养板放入酶标仪中，设置在特定波长（通常为600 nm）下每10分钟读数一次，持续2小时。监测培养板，防止细菌生长过密过快。
4. 当所有细胞的 OD 值达到 0.1–0.15 时，从酶标仪中取出培养板，停止记录。
5. 以不同浓度分别加入药物单独组和量子点单独组，每组至少设三个复孔。将平板的一侧设为“暗”对照组，另一侧用于光照。建议的布局如以下所示 图3浓度范围应足够宽，以包含一个对细菌抑制作用极小的浓度和一个能完全杀死所有细菌的浓度。
6. 用铝箔遮盖培养板的“暗”面，将另一面暴露于所需波长的光源下。我们使用自制的96孔440 nm LED灯，其LED功率为2.4 mW（图4）并照射30-60分钟。底部透明的黑色板有助于屏蔽未照射侧的细菌免受杂散光影响。也可在照射侧与未照射侧之间使用一个空列。
7. 光照处理后，将培养板放入酶标仪中，根据生长速度，每10分钟记录一次OD600，持续5至12小时。保持温度 < 32 °C 尽量避免培养物干燥。
8. 在选定时间点绘制生长曲线，以生长情况对浓度的对数值（log [浓度]）作图，并确定IC₅₀ 使用Hill方程测定抗生素的效应：

其中 H 为希尔系数，y_max 为生长最高点（理想情况下位于平台期），y_min 为零点，理想情况下也位于平台期。量子点（QDs）在所用浓度下单独作用时不太可能对细胞表现出明显毒性，因此不测定其数值。

代表性结果。 在记录期结束时，透明的孔表明细胞已完全死亡，且随着药物浓度的增加，细胞密度应呈现出梯度变化。细菌应显示出S形生长曲线（图5 A）；最大平台期的位置因菌株而异，并且还取决于温度。可选择某一特定时间点作为代表，将其数值对Log[抗生素]作图，以获得IC₅₀值（图5 B）。为了评估量子点（QD）的毒性，也可将存活率对Log[QD]作图，但仅使用量子点实现显著的细菌杀灭效果较为罕见（图5 C）。

4. 抗生素/量子点96孔筛选用细菌的制备

1. 实验前一天，使用新鲜菌落接种10 mL培养物至合适的丰富培养基中，操作时应采用正确的无菌和生物安全技术。除非量子点-抗生素偶联物极不稳定，否则应在当天制备该偶联物。
2. 实验前1-2小时，向透明底96孔板的每个孔中加入接近最大容量的生长培养基。使用多通道移液器，向每孔接种1-50 μL细菌培养物。
3. 将培养板放入酶标仪中，并设置为每隔10分钟读取一次吸光度，持续2小时，检测波长与第3部分相同。
4. 当所有菌液的OD值达到0.1-0.15时，将培养板从酶标仪中取出，并停止记录。
5. 以至少四个重复孔为一组，加入不同浓度的量子点偶联物。将板的一侧设为“暗”对照组，另一侧用于光照。建议的布局见图6。应始终设置仅含细菌的对照条带，以防培养、温度等因素影响生长条件。还应设置单独的药物对照条带和仅量子点对照条带，以确保其结果与先前完成的对照板一致。其余孔用于偶联物测试，以便获得良好的统计学数据。
6. 用铝箔遮盖培养板的“暗”侧，另一侧则用特定波长的光源照射。
7. 光照结束后，将培养板放入酶标仪，每10分钟记录一次OD600，持续5-12小时。尽可能将温度保持在< 32 °C，以避免培养液蒸发。

代表性结果。量子点与抗生素的组合可能比单独使用抗生素的毒性更低；毒性相当；或毒性更高。这可以通过生长曲线和IC₅₀测定进行量化。图7展示了一个与单独使用抗生素毒性相当的偶联物示例，以及一个毒性更高的偶联物示例。

5. 平板计数

1. 选择经处理的96孔板中的一个或多个孔，用于进行系列稀释和菌落计数。
2. 用PBS或生理盐水（0.9% NaCl）对所选的每个细菌样品进行系列稀释。取20 μL细菌溶液加入180 μL生理盐水中，更换移液枪头，混匀后取20 μL稀释后的细菌溶液加入下一份180 μL生理盐水中。重复此步骤6次。
3. 从每种稀释度中取10 μL，接种于适当的固体培养基平板上。一个样品的全部8个浓度可接种于一个直径10 cm的圆形培养皿上，但更推荐使用矩形培养皿，因其更便于排列整齐。
4. 在实验台上静置干燥15分钟，随后在适合该细菌生长的温度下培养16小时。
5. 计数菌落，并根据公式（菌落数 × 稀释倍数）/ 接种体积 = CFU/mL 计算菌落形成单位（CFU）。

图8 显示了一个CFU平板示例。

6. 代表性结果

图1. CdTe量子点。(A) 八组CdTe量子点在紫外灯（365 nm）照射下的发光情况。(B) 五种选定尺寸的量子点在水溶化处理前后的吸收光谱和发射光谱。虚线代表甲苯中的光谱，实线代表水中的光谱。

图 2. QD-PMB 偶联物的光谱和凝胶分析。本示例使用橙色发射的 CdTe 量子点（QDs）；其他类型量子点的效果需在每次实验中单独评估。(A) 偶联多粘菌素 B（PMB）前量子点的典型吸收光谱（灰色线）和发射光谱（黑色线），以及加入 160 倍摩尔过量 PMB 后的发射光谱（虚线）。(B) PMB 与量子点比例对量子点发射强度（方块）和发射峰波长位置（三角形）的影响关系。

图3. 推荐的对照生长板布局。展示了多种PMB和QD浓度组合。平板的一半接受光照（蓝色高亮区域），另一半则避光处理。 点击此处查看高清大图。

图4. 定制的96-LED灯，用于对培养板进行均匀照射，图中显示灯关闭和开启时的外观。也可使用典型的便携式紫外灯，但无法对整个培养板实现均匀照射。

图5．对照生长板的示例结果。（A）不同药物浓度下的代表性细菌生长曲线，浓度范围从0至完全细胞死亡。空心符号代表仅使用多粘菌素B（PMB），浓度如图所示；实心符号代表未照射的CdTe-PMB；半填充符号代表经照射的CdTe-PMB。光照对仅含PMB的样品无影响，因此为清晰起见省略了这些曲线。所有PMB-CdTe偶联物的PMB:QD比例均为30:1。（B）200分钟时生长曲线数值相对于Log[PMB]的作图，以及对公式（1）的拟合结果。为控制光照的影响，单独使用抗生素并进行30分钟光照处理作为对照曲线。（C）使用CdTe量子点（QDs）时，200分钟时的细菌存活率相对于QD浓度的关系图。可见光照条件下存在一定毒性，但毒性过低，无法确定IC₅₀值。 点击此处查看高清大图。

图6. 建议的偶联测试板布局。应将板中高亮为蓝色的一半暴露于光照下，未高亮的一半则需避光保护。 点击此处查看大图。

图7. 偶联物测试平板的示例结果。将200分钟时的生长曲线数值绘图并拟合至公式(1)。(A) CdTe-PMB偶联物显示出比单独PMB更高的毒性。(B) 金纳米颗粒Au-PMB偶联物与单独PMB相比未显示出毒性增强。

图8. CFU平板示例。E. coli接种于96孔板中，经QD-PMB处理，有或无光照照射30分钟，随后在32 °C下孵育4小时。各细菌样品用生理盐水进行系列稀释，取10 μL 100 X至10⁷ X的稀释液涂布于琼脂平板上。平板在37 °C下孵育16小时后计数菌落。图中各行表示如标注所示的不同稀释度；各列分别为：(A) 0.06 μM PMB + 2 nM CdTe，(B) 0.12 μM PMB + 4 nM CdTe，(C) 0.2 μM PMB + 6.7 nM CdTe，(D) 0.06 μM PMB + 2 nM CdTe 经光照，(E) 0.12 μM PMB + 4 nM CdTe 经光照，(F) 0.2 μM PMB + 6.7 nM CdTe 经光照。

讨论

纳米颗粒为开发新型抗菌剂提供了一种有前景的途径。生长曲线分析是一种监测细菌细胞密度的方法，能够区分活跃生长的细胞与生长受抑制的细胞。结合平板计数法，可对偶联物的抗生素潜力进行深入分析。采用96孔板格式可实现浓度及其他条件（如光照）的相对高通量筛选；后者对于量子点等光激活型试剂尤为关键。该基本方法存在多种变体，使其成为纳米毒理学研究中一种灵活且适用性广的技术。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硼酸盐缓冲液组分 #1	Fisher	Boric acid A-74-1
硼酸盐缓冲液组分 #2	Sigma-Aldrich	Sodium Tetraborate B9876
MPA	Sigma-Aldrich	M5801
Vivaspin 500	GE Healthcare	28-9322	提供多种分子量截留规格
玻璃小瓶	Fisher	03-338C
EDC	Sigma-Aldrich	E6383
多粘菌素 B	Sigma-Aldrich	P1004
细菌培养基（LB）组分 #1	Fisher	NaCl S271
细菌培养基（LB）组分 #2	BD	Tryptone 211705
细菌培养基（LB）组分 #3	BD	Yeast Extract 211929
用于光照处理的灯具	定制
透明底96孔板	Fisher	07-200-567 或 07-200-730
荧光光谱仪	Molecular Devices
吸光度酶标仪	Molecular Devices
用于固体培养基的BactoAgar	Bioshop	AGR001.1
圆形培养皿	Fisher	08-75-12
矩形培养皿	Fisher	08-757-11A