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方法文章

量子点的溶解与生物偶联及通过生长曲线和菌落计数进行的细菌毒性检测

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DOI：

10.3791/3969

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2012年7月11日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, McGill University, Montreal, QC Canada

本文内容

摘要

半导体量子点（QDs）等纳米颗粒可用于制备光活化试剂，以用于抗菌或抗癌应用。本技术展示了如何使碲化镉（CdTe）量子点水溶化，将其与抗生素偶联，并基于生长曲线和平板计数进行细菌抑制实验。

摘要

量子点（QDs）是一类荧光半导体纳米颗粒，其发射光谱依赖于尺寸，并可由多种波长的光激发。由于具有明亮且稳定的荧光特性，量子点在成像、诊断和治疗领域受到广泛关注1,2 3,4,5。量子点可与多种生物活性分子偶联，用于结合细菌和哺乳动物细胞6。

量子点（QDs）也正在被广泛研究作为靶向杀灭细菌的细胞毒性试剂。多重耐药菌株的出现正迅速演变为一场公共卫生危机，尤其在革兰氏阴性病原体方面尤为严重7。由于某些纳米材料（尤其是银，Ag）具有广为人知的抗菌效应，已有数百项研究探讨了纳米颗粒对细菌的毒性作用8。此外，其他类型的半导体纳米颗粒也被用于细菌相关研究，特别是二氧化钛（TiO2）9,10-11，以及氧化锌（ZnO）12和氧化铜（CuO）13等。在这些研究中，部分开展了不同细菌菌株之间的比较，通常为革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的对比。对于所有这些纳米颗粒，其毒性机制均归因于氧化作用：或是颗粒在光照下产生活性氧物种（ROS），或是直接释放可引发氧化毒性的金属离子。即便使用这些材料，不同研究的结果仍存在巨大差异。一些研究报道革兰氏阳性测试菌株比革兰氏阴性菌更敏感10；而在另一些研究中则恰恰相反14。这些研究已得到充分综述15。

在所有纳米颗粒研究中，颗粒的组成、尺寸、表面化学性质、样品老化/降解情况，以及光照的波长、功率和持续时间，均可能显著影响实验结果。此外，还需考虑合成副产物和溶剂的影响16 17。为了能够开发出有效的新型纳米药物制剂，亟需高通量筛选技术。

CdTe量子点单独使用18或与抗生素联合使用均具有抗菌作用。在之前的一项研究中，我们发现将抗生素与CdTe偶联可增加对细菌的毒性，但会降低对哺乳动物细胞的毒性，这归因于偶联物产生的活性氧减少19。尽管含镉化合物不太可能被批准用于人体，但此类制剂可用于物体表面的消毒或水的灭菌。

在本方案中，我们提供了一种使用巯基丙酸（MPA）溶解 CdTe 量子点的简便方法。该量子点可在一小时内完成制备并直接使用。随后，我们展示了将其与抗菌剂偶联的方法。

实验方案的第二部分展示了使用偶联与非偶联量子点的96孔细菌抑制实验。通过在数小时内连续测定光密度，可即时评估量子点添加和光照处理的效果，并可在恢复培养后进一步评估其影响。我们还展示了通过菌落计数来定量分析细菌存活率的方法。

方案

1. 量子点溶解

该方法适用于CdTe。其他类型的量子点（如InP/ZnS20和CdSe/ZnS21）也可采用类似方法。

  1. 在甲苯中配制浓度为 15 μM 的 CdTe 量子点溶液（在第一激子峰处的光密度为 2.5）。
  2. 将 200 μL 该储备液转移至玻璃小瓶中。切勿使用塑料容器！
  3. 加入 800 μL 甲苯、1 mL 200 mM 硼酸盐缓冲液（pH 9）以及 2 μL 11.5 M 巯基丙酸（MPA）。
  4. 盖紧瓶盖，剧烈振荡 30–60 秒。
  5. 水相与有机溶剂相将自发分离，水相将呈现量子点的颜色。为避免甲苯层干扰，将其移除并弃去，然后将水相转移至洁净的小瓶中。
  6. 使用 500 μL、截留分子量为 10000 的离心过滤装置，通过洗涤/过滤四次纯化溶解的量子点。每次离心条件为 3000 × g，离心 13 分钟。最后至少两次洗涤应使用所需的终末缓冲液进行。
  7. 最后一次洗涤后，将纯化的量子点重悬于 50 mM 硼酸盐缓冲液中（调节至所需 pH），并在 4 °C 下保存。样品可稳定保存 1–2 周。
  8. 测定吸光度和发射光谱，依据已发表的公式 22估算量子点浓度。

代表性结果：图1展示了CdTe量子点在紫外灯照射下的图像，以及水溶化前后发射光谱的变化，表明配体交换过程引起的光谱变化可忽略不计。尺寸数值为通过电子显微镜测得的核直径。

2. 量子点与抗生素的偶联

该方案的这一部分适用于任何带负电荷的水溶性纳米颗粒，包括大多数商用量子点、金属颗粒等19。

  1. 任何分子均可使用，只要其能够自发组装到带负电荷的溶解态量子点（QDs）上，或含有可共价偶联的反应性基团（例如伯胺）。本示例中采用多粘菌素B（PMB），该分子带正电荷，可自发组装，无需偶联试剂。将PMB溶解于H2O at 60 μM。（如果所选抗生素不溶于H2O，用DMSO或乙醇溶解，浓度为0.1–1 mM）。该溶液将作为10倍浓缩液（在H2O）或100倍浓度溶液（溶剂中）。
  2. 计算细菌毒性实验所需的量子点溶液用量。对于每孔0.3 mL、设四个重复的96孔板，需要0.5 mL的200 nM偶联物溶液。准备两支试管，分别装有 100 μL 的 1 μM 50 mM 硼酸盐缓冲液中的量子点
  3. 若与伯胺偶联，配制19 mg/mL（100 mM）的1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）水溶液2O. EDC 溶液不稳定，需立即使用，剩余部分应丢弃。
  4. 添加 50 μL 10倍抗生素溶液（溶于H2O) 或 5 μL 将100倍浓度的溶液（溶于溶剂中）加入到偶联管中。对于摩尔比为30:1的PMB:CdTe偶联，添加 50 μL 的 60 μM PMB。加入H2O 或溶剂加入仅含量子点的对照管中。
  5. 如有需要，添加 1 μL 将 EDC 储备液加入偶联管中。
  6. 用适当的缓冲液（硼酸盐缓冲液或PBS；不可使用含胺缓冲液如Tris，因其会抑制EDC反应）将偶联液体积调至0.5 mL。
  7. 用铝箔避光包裹离心管，并在旋转摇床或往复摇床上孵育1小时。若出现聚集现象，应使用较低浓度的抗生素重复偶联反应。逐步提高抗生素浓度，直至颗粒不再发生聚集。
  8. 用适当的滤器冲洗偶联物。对于大多数抗生素，可使用截留分子量为10000的滤器，但不适用于蛋白质或抗体。
  9. 根据分子的不同，可采用多种方法来估算每个量子点所结合的抗生素分子数量：吸光度或荧光光谱法、凝胶电泳法或傅里叶变换红外光谱法（FTIR）。

代表性结果。 在本示例中，PMB 的偶联通过量子点发射光谱的变化进行表征。图2展示了添加PMB后CdTe量子点的光谱。

3. 96孔筛选用细菌的制备；抗生素IC50的测定

这适用于在适当培养基中培养的几乎所有细菌菌株18。记录所需的确切时间取决于细菌的生长速率。在本示例中，我们使用在溶菌肉汤（LB）培养基中培养的大肠杆菌（Escherichia coli）。

  1. 为了选择合适的量子点偶联物浓度，了解IC50 待偶联抗生素的浓度以及量子点（QDs）单独是否存在毒性。该步骤应在偶联实验开始前2天进行。傍晚时，采用正确的无菌和生物安全技术，从新鲜菌落接种10 mL细菌培养基。
  2. 第二天，在实验前1-2小时，向透明底96孔板的每个孔中加入接近最大容量的培养基。使用多通道移液器，向每个孔中接种1-50 μL 细菌培养物的量（具体浓度取决于特定菌株的生长速度，需由实验室自行校准）。
  3. 将培养板放入酶标仪中，设置在特定波长（通常为600 nm）下每10分钟读数一次，持续2小时。监测培养板，防止细菌生长过密过快。
  4. 当所有细胞的 OD 值达到 0.1–0.15 时，从酶标仪中取出培养板并停止记录。
  5. 以至少三个重复孔分别加入不同浓度的药物单独处理组和量子点（QDs）单独处理组。将平板的一侧设为“暗”对照组，另一侧设为光照组。建议的板式布局如下所示 图3浓度范围应足够宽，以包含一个对细菌抑制作用很小的浓度和一个能完全杀死细菌的浓度。
  6. 用铝箔遮盖平板的“暗”面，将另一面暴露于所需波长的光源下。我们使用自制的96孔440 nm灯，由2.4 mW LED制成（图4）并照射30-60分钟。底部透明的黑色板有助于屏蔽未照射侧的细菌免受杂散光影响。也可在照射侧与未照射侧之间使用空列。
  7. 光照后，将培养板放入酶标仪中，根据生长速度每10分钟记录一次OD 600，持续5至12小时。保持温度 < 32 °C 尽可能避免培养物干燥。
  8. 在选定时间点绘制生长曲线，以生长情况对浓度的对数值（log [浓度]）作图，并确定IC50 使用Hill方程计算抗生素的效应：

剂量-反应曲线分析的非线性回归方程，变量为 ymax、ymin、IC50 和 H。
其中 H 为希尔系数，ymax 为生长最高点（理想情况下处于平台期），ymin 为零点，理想情况下也处于平台期。量子点（QDs）在所用浓度下单独作用时不太可能对细胞产生明显毒性，因此不会确定其数值。

代表性结果。 在记录期结束时，透明的孔表明细胞已完全死亡，且随着药物浓度的增加，细胞密度应呈现出梯度变化。细菌应表现出S形生长曲线（图5 A）；最大平台期的位置因菌株而异，并且还取决于温度。可选择某一特定时间点作为代表，将其数值对Log[抗生素]作图，以获得IC50值（图5 B）。为了评估量子点（QD）的毒性，也可绘制存活率对Log[QD]的曲线，但单独使用量子点实现显著的细菌杀伤作用较为罕见（图5 C）。

4. 抗生素/量子点96孔筛选用细菌的制备

  1. 实验前一天，使用无菌及生物安全操作技术，从新鲜菌落中接种10 mL培养物至适当的丰富培养基中。除非量子点-抗生素偶联物极不稳定，否则也应在当天制备。
  2. 实验前1-2小时，用接近最大容量的培养基填充透明底96孔板的每个孔。使用多通道移液器，向每孔接种1-50 μL 细菌培养物
  3. 将培养板放入酶标仪中，设置为在与第3部分相同的波长下，每10分钟读数一次，持续2小时。
  4. 当所有细胞的 OD 值达到 0.1–0.15 时，从酶标仪中取出培养板并停止记录。
  5. 以至少四个复孔为一组，加入不同浓度的量子点偶联物。将平板的一侧设为“暗”对照，另一侧设为光照组。建议的布局如图所示 图6仅含细菌的对照条应 始终 应包含对照组，以防培养、温度等因素影响生长条件。还应设置仅含单条药物和仅含QD的组别，以确保其与之前完成的对照板结果一致。其余孔用于放置偶联物，以便获得良好的统计学数据。
  6. 用铝箔遮盖培养皿的“暗”侧，将另一侧暴露于所需波长的光源下。
  7. 光照后，将培养板放入酶标仪中，每10分钟记录一次OD 600，持续5至12小时。保持温度 < 32 °C 尽可能避免培养物干燥。

代表性结果。量子点与抗生素的组合可能比单独使用抗生素的毒性更低；毒性相当；或毒性更高。这可以通过生长曲线和IC50测定进行量化。图7展示了一个与单独使用抗生素毒性相当的偶联物示例，以及一个毒性更高的偶联物示例。

5. 平板计数

  1. 选择经处理的96孔板中的一个或多个孔，用于进行系列稀释和菌落计数。
  2. 用PBS或生理盐水（0.9% NaCl）对所选的每个细菌样品进行系列稀释。取20 μL细菌溶液加入180 μL生理盐水中，更换移液器吸头，混匀后取20 μL稀释后的细菌溶液加入180 μL生理盐水中。重复此步骤6次。
  3. 从每个稀释度中取10 μL，接种于适当的固体培养基平板上。一个样品的全部8个浓度可接种于一个直径10 cm的圆形培养皿上，但更推荐使用矩形培养皿，因其更便于排列。
  4. 在实验台上静置干燥15分钟，然后在适合该细菌生长的温度下培养16小时。
  5. 计数菌落，并根据公式（菌落数 × 稀释倍数）/ 接种体积 = CFU/mL 计算菌落形成单位（CFU）。

图8 显示了一个菌落形成单位（CFU）平板的示例。

6. 代表性结果

CdTe 光致发光、发射光谱、量子点、小瓶样品、光谱分析图
图 1. CdTe 量子点。(A) 八个 CdTe 量子点样品在 365 nm 紫外灯照射下的发光情况。(B) 五种选定尺寸的量子点在水溶化前后的吸收光谱和发射光谱。虚线表示甲苯中的光谱，实线表示水中的光谱。

发射光谱和吸光度图；PMB与CdTe的比值随波长的变化；光子分析。
图 2. 量子点-PMB 偶联物的光谱和凝胶分析。本示例使用了发射橙光的 CdTe 量子点；其他类型量子点的影响需在每次实验中单独评估。(A) 偶联 PMB 前量子点的典型吸光度（灰色线）和发射光谱（黑色线），以及加入 160 倍摩尔量 PMB 后的发射光谱（虚线）。(B) PMB 与量子点的摩尔比与量子点发射强度（方块）及发射峰波长位置（三角形）之间的关系。

E. coli 生长实验平板布局；PMB 和 QD 的系列稀释；实验设置与分析。
图 3. 建议的对照生长平板布局。展示了较宽范围的 PMB 和 QD 浓度。平板的一半接受光照（以蓝色高亮），另一半则避光。 点击此处查看大图。

光子学实验中用于光学激发的LED阵列；上方为关闭状态，下方为开启状态，发射蓝光。
图4. 定制的96-LED灯，用于实现培养板的均匀照射，图中显示其关闭和开启时的外观。也可使用常见的手持式紫外灯，但无法对整个培养板实现均匀照射。

细菌生长抑制、存活率分析图；PMB光照效应；光学响应研究。
图 5．对照生长平板的示例结果。（A）不同药物浓度下的代表性细菌生长曲线，浓度范围从0至完全细胞死亡。空心符号代表仅使用PMB，浓度如图所示；实心符号代表未照射光的CdTe-PMB；半填充符号代表经光照的CdTe-PMB。光照对仅含PMB的样品无影响，因此为清晰起见省略了这些曲线。所有PMB-CdTe偶联物的PMB:QD比例均为30:1。（B）200分钟时生长曲线数值相对于Log[PMB]的作图，以及对公式（1）的拟合结果。为控制光照的影响，单独使用抗生素并进行30分钟光照处理作为对照曲线。（C）200分钟时细菌存活率相对于QD浓度的变化，使用CdTe量子点（QDs）。可见光照条件下存在一定毒性，但毒性过低，无法确定IC50值。 点击此处查看高清大图。

微量滴定板布局示意图；用于生物测定测试的大肠杆菌、量子点（QD）和多粘菌素B浓度梯度。
图 6. 建议的偶联物测试板布局。板中以蓝色高亮的一半应暴露于光照下，未高亮的一半则需避光保护。 点击此处查看大图。

细菌生长抑制实验，OD 600 与 log[PMB] 的关系，比较不同 PMB 制剂；实验图表。
图 7. 偶联物测试板的示例结果。将 200 分钟时的生长曲线值绘图并拟合至公式 (1)。（A）CdTe-PMB 偶联物表现出比单独使用 PMB 更高的毒性。（B）金纳米颗粒 Au-PMB 偶联物未表现出比单独使用 PMB 更高的毒性。

细菌菌落生长、琼脂平板上的梯度稀释、实验设置、微生物学分析。
图 8. CFU 平板示例。E. coli 接种于 96 孔板中，用 QD-PMB 处理，有或无光照，处理 30 分钟后，在 32 °C 下孵育 4 小时。各细菌样品用生理盐水进行系列稀释，取 10 μL 100 X 至 107 X 的稀释液涂布于琼脂平板上。平板在 37 °C 下孵育，16 小时后计数菌落。图中显示稀释梯度按行排列，如图所示；各列为：(A) 0.06 μM PMB + 2 nM CdTe，(B) 0.12 μM PMB + 4 nM CdTe，(C) 0.2 μM PMB + 6.7 nM CdTe，(D) 0.06 μM PMB + 2 nM CdTe 经光照，(E) 0.12 μM PMB + 4 nM CdTe 经光照，(F) 0.2 μM PMB + 6.7 nM CdTe 经光照。

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讨论

纳米颗粒为开发新型抗菌剂提供了一种有前景的途径。生长曲线分析是一种监测细菌细胞密度的方法，能够区分活跃生长的细胞与生长受抑制的细胞。结合平板计数法，可对偶联物的抗生素潜力进行深入分析。采用96孔板格式可实现浓度及其他条件（如光照）的相对高通量筛选；后者对于量子点等光激活型试剂尤为关键。该基本方法存在多种变体，使其成为纳米毒理学研究中一种灵活且适用性广的技术。

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致谢

本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）个人发现项目、NSERC/加拿大卫生研究院（CIHR）协作健康研究计划（CHRP）以及NSERC CREATE加拿大天体生物学培训计划（CATP）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硼酸盐缓冲液组分 #1FisherBoric acid A-74-1
硼酸盐缓冲液组分 #2Sigma-AldrichSodium Tetraborate B9876
MPASigma-AldrichM5801
Vivaspin 500GE Healthcare28-9322提供多种分子量截留规格
玻璃小瓶Fisher03-338C
EDCSigma-AldrichE6383
多粘菌素 BSigma-AldrichP1004
细菌培养基（LB）组分 #1FisherNaCl S271
细菌培养基（LB）组分 #2BDTryptone 211705
细菌培养基（LB）组分 #3BDYeast Extract 211929
用于光照处理的灯具定制
透明底96孔板Fisher07-200-567 或 07-200-730
荧光光谱仪Molecular Devices
吸光度酶标仪Molecular Devices
用于固体培养基的BactoAgarBioshopAGR001.1
圆形培养皿Fisher08-75-12
矩形培养皿Fisher08-757-11A

参考文献

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