在本研究中，我们阐述了一种微流控混合器的制备与使用方法，该混合器能够在约8 μs内实现两种溶液的混合。我们还展示了将此类混合器与光谱检测技术结合使用，包括紫外荧光和荧光共振能量转移（FRET）检测。
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摘要
摘要
蛋白质折叠为其天然构象的过程与生物学及人类健康密切相关，但目前仍了解甚少。其中一个原因是，折叠过程发生在从纳秒到数秒甚至更长时间范围内的广泛时间尺度上，具体取决于蛋白质1。传统的停流混合器使折叠动力学的测量可从约1毫秒开始。我们最近开发了一种微流控混合器，可在约8 μs内将变性剂稀释约100倍2。与停流混合器不同，该混合器在层流流动状态下运行，不发生湍流。由于无湍流，可对混合器内所有流动进行精确的数值模拟，并与实验结果高度吻合3-4。
当雷诺数 Re ≤100 时，可实现层流。对于水溶液，这需要微米级的几何结构。我们使用硬质基底（如硅或熔融石英）制作宽度为 5–10 μm、深度为 10 μm 的通道（见图 1）。在混合区域入口处的最小尺寸约为 1 μm。芯片通过一层薄玻璃或熔融石英盖玻片密封，以便进行光学观测。典型的总线性流速约为 1 m/s，对应的 Re~10，但蛋白质消耗量仅为 ~0.5 nL/s 或 1.8 μL/hr。蛋白质浓度取决于检测方法：对于色氨酸荧光，典型浓度为 100 μM（每蛋白质含 1 个色氨酸），而对于 FRET，典型浓度约为 100 nM。
通过将变性剂盐酸胍的浓度从6 M迅速稀释至0.06 M，启动蛋白质折叠过程。处于高浓度变性剂中的蛋白质溶液沿中央通道流动，在混合区域两侧与不含变性剂、流速约快100倍的缓冲液相遇（见图2）。该几何结构导致蛋白质流迅速收缩成一股宽度约为100 nm的狭窄射流。轻质的变性剂分子扩散非常迅速，而较重的蛋白质分子扩散较慢，在1 ms内扩散距离不足1 μm。由于变性剂与蛋白质的扩散系数差异，变性剂从蛋白质流中迅速扩散出去，从而降低了蛋白质周围变性剂的有效浓度。蛋白质射流以恒定速度沿观察通道流动，可利用扫描共聚焦显微镜观察折叠过程中蛋白质的荧光信号5。
方案
1. 微流控混合芯片的制备
图3展示了基本的制备步骤。
- 使用新鲜的piranha溶液（3:1 H2SO4:H2O2）清洗4英寸（100 mm）熔融石英晶圆：i) 将硫酸加热至130 °C，然后加入过氧化氢。注意，所用熔融石英晶圆的表面粗糙度和平整度对最终键合步骤至关重要。ii) 将晶圆浸入溶液中至少30分钟。iii) 用水冲洗5分钟并干燥。使用低压化学气相沉积（LPCVD）炉在晶圆表面涂覆一层多晶硅（poly）涂层，每预期10 μm深的微流控通道，涂层厚度约为1 μm。
- 使用步骤1.1中的piranha处理法清洗晶圆和掩模版。以相同方式清洗掩模版，然后用丙酮、甲醇和异丙醇冲洗，并立即用气流吹干。将晶圆置于150 °C的热板上脱水约10分钟（可使用铝箔罩防止颗粒污染），或在120 °C烘箱中至少120分钟（建议过夜）。为增强光刻胶附着力，立即将温热的晶圆暴露于HMDS蒸气中5分钟。在晶圆表面旋涂一层约900 nm厚的AZ5214光刻胶，并在热板上90 °C下软烘1分钟，或在烘箱中110 °C下烘30分钟（图3，步骤1）。
- 对准掩模版并实现硬接触和真空接触。用紫外光照射数秒（总能量：~103 mJ/cm2）（图3，步骤2）。使用AZ400K显影液（按4:1比例用去离子水稀释）轻轻摇动显影约50秒（直至光刻胶完全显影）。用水冲洗2分钟。用显微镜检查图形特征（图3，步骤3）。若图形分辨率不佳，需剥离光刻胶并从1.2步骤重新开始。在热板上115 °C下硬烘2分钟。
- 使用灰化仪或O2等离子体对晶圆去残胶，功率100 W，时间2.5分钟。使用深反应离子刻蚀机（DRIE）将多晶硅层完全刻蚀至下方熔融石英表面。使用PRS2000去胶液在75 °C下剥离剩余光刻胶10分钟。冲洗并干燥。测量刻蚀深度，确保已完全穿透多晶硅涂层（图3，步骤4）。
- 使用具备氧化物刻蚀能力的DRIE设备（如ULVAC NLD-6000刻蚀机），按每微米多晶硅涂层厚度刻蚀约10 μm深度的熔融石英（图3，步骤5）。刻蚀过程中多晶硅涂层将逐渐被消耗，因此需定期检查涂层完整性。若晶圆表面本应无图形的区域在刻蚀过程中失去保护性多晶硅涂层，则表面很可能已产生凹坑，不再适用于后续键合步骤。此时晶圆很可能已失效。使用Matrix灰化仪在100 W射频功率下处理4分钟。使用XeF2刻蚀机去除多晶硅（图3，步骤6）。可能需要重复步骤1.4及本步骤数次，以彻底去除所有光刻胶和多晶硅涂层。
- 在晶圆表面旋涂一层新的约1 μm厚光刻胶，以保护后续操作中的微通道。使用计算机控制的金刚石钻头或手动喷砂法在每块芯片上钻出入口孔（图3，步骤7）。若使用钻头，需将晶圆（图形面朝下）用Aqua Bond 55粘附于牺牲玻璃板上，注意避免粘合剂中产生气泡。使用Micro-90清洗液对钻头进行冷却，以防止玻璃碎屑粘附于通道内，造成使用时堵塞。
- 使用注射器将去离子水注入每个孔中冲洗晶圆。在肥皂水中浸泡1小时。在60 °C下使用PRS 2000去除光刻胶和Aqua Bond，持续数小时直至表面清洁。用去离子水和温热肥皂水冲洗晶圆。再次使用注射器冲洗每个孔，避免接触刻蚀区域。用氮气吹干，并在120 °C真空烘箱中干燥。检查孔洞是否无颗粒残留，必要时重复清洗步骤。使用光学或机械表面轮廓仪测量通道深度（图3，步骤8）。
- 使用以下溶液清洗晶圆及等量的170 μm厚熔融石英盖玻片：1) piranha溶液（按1.1步骤操作，1-2小时），2) RCA 2溶液（5:1:1 去离子水:HCl:H2O2）在75 °C下处理10分钟，3) RCA 1溶液（5:1:1 去离子水:NH4OH:H2O2）在75 °C下处理22分钟。每次溶液处理之间用去离子水冲洗5分钟。
- 将一片晶圆（图形面朝上）放置于洁净台面上的3-4层无尘布上（如小块玻璃板表面）。用氮气彻底吹干至少5分钟。对盖玻片重复相同操作。手持盖玻片边缘将其翻转，使抛光面朝下对准晶圆，并对齐平边。小心将盖玻片放下，使其自然贴合。仅可水平轻推以调整对准。用一根手指按压晶圆中心，应可见键合前沿开始向外扩展。必要时可在晶圆其他位置施加额外压力以推进键合前沿（图3，步骤9）。
- 将密封后的晶圆放入高温烘箱，设定程序为：3小时内从室温升至800 °C，再用1.2小时从800 °C升至1100 °C。在1100 °C下保持2小时，然后用1.5小时降温至室温。
- 使用晶圆划片机将晶圆切割成单个芯片（图3，步骤10）。
- 本方案描述了在较为特殊的熔融石英基底上加工通道的工艺，该基底适用于紫外检测。但该方案也可适用于硅基底，后者仅需一次刻蚀步骤2。玻璃（非熔融石英）盖玻片可通过阳极键合方式与晶圆键合。
2. 芯片的安装与加载
- 用于固定混合芯片和溶液的流体控制装置可由塑料（如Lexan或Plexiglas）或铝制成，其中铝制装置可用于温度控制（见图4）。若使用铝材，溶液储液池应涂覆聚对二甲苯（parylene），以防止储液池中的盐溶液溶解铝。通过安装在装置侧面的热电设备和电子控制器，可对整个流体控制装置、溶液及芯片的温度进行调控。
- 芯片通过小型O型圈与流体控制装置连接，并用卡环固定，以便清晰地从光学上观察芯片中心区域。O型圈凹槽应比标准深度更浅，以确保良好密封的同时不对芯片施加过大压力，例如，002规格的O型圈凹槽深度应为0.025英寸。芯片安装完成后，向中心和侧边储液池中加入溶液，并注意排除孔底部可能滞留的气泡。
- 由于本混合器所用体积极小，可通过在溶液孔上方施加气压来控制流体流动。图4展示了通过O型圈与芯片流体装置顶部连接的压力控制装置。该压力装置连接至由计算机控制的压力传感器，可维持约2–80 PSI的压力。芯片设计使得当中心通道与侧通道施加相等压力时，线性流速比约为100倍。在20 PSI压力下，出口通道中的线性流速约为1 m/s。
- 将流体控制装置置于倒置显微镜上，通过目镜或相机输出观察混合区域。在流体装置顶部放置一个白炽手电筒即可提供足够的照明。在中心通道中使用染料或高折射率溶液（如6 M盐酸胍）以观察射流情况。
- 当中心通道与侧通道压力相等时，射流难以肉眼观察，因此可先将侧通道压力设为0 PSI，再缓慢增加至与中心通道相等。若一侧通道发生堵塞，射流将偏向出口通道的一侧壁。若出现可见堵塞，可通过注射器对出口通道施加压力或真空以解除堵塞。
- 若芯片被蛋白质或其他有机物质堵塞，可将其浸泡于Pirhana溶液中过夜进行清洗。
3. 数据采集
图5展示了基本的光学仪器布局。
- 使用位于显微镜内部或紧邻其外的二向色镜，将准直激光束引入科研级显微镜中。调整激光方向，使焦点在目镜或相机中可见，并大致位于混合区域附近。
- 混合器中蛋白质的荧光信号由物镜收集，经二向色镜反射后，通过透镜聚焦至针孔，并成像于光子计数器上。使用压电扫描器在x和y方向扫描芯片，以成像混合区域（典型步长为2 μm）。选择射流上的一个位置，并在x和z方向扫描，以垂直确定通道中心处的焦点。显微镜的景深远小于通道深度，且通道内的流速在距壁面1 μm以外区域是均匀的。因此，所观测荧光的时间分辨率主要由共焦斑点的尺寸决定。
- 在出口通道内进行水平扫描（典型步长为横跨射流0.2 μm，沿射流方向2 μm），沿射流每前进100 μm进行一次扫描，每个位置观测约1 ms（见图6）。将显微镜载物台沿射流方向移动80–90 μm，以捕捉更晚时间点的信号。
- 或者，可在二向色镜后使用透镜将光聚焦至入射狭缝，由光谱仪和CCD探测光信号。由于数据采集速度比光子计数器慢（每个位置约1秒），通常先用光子计数器成像射流，再用光谱仪测量射流沿线各点（见图7）。
- 对光子计数器的数据进行分析时，通过在每个位置对射流周围3–5个像素求和，生成强度随距离变化的曲线图。时间通过距离和基于施加压力计算出的流速换算得到（见图8）。
- 光谱仪数据可通过多种方式分析。对于FRET实验，可分别对指定为“供体”和“受体”的通道信号求和，并计算邻近比 E=IA/(ID+IA)（见图9）。或者，可进行单值分解分析，以观察随时间变化的独立光谱组分，例如蛋白质折叠过程中色氨酸发射光谱的位移。
- 出口通道内的距离可通过侧通道施加压力所确定的恒定流速转换为时间。在出口通道前2 μm范围内，蛋白质射流的流速加速约100倍，该区域的时间必须通过流线的有限元分析计算（生成图8中所示的时间数据）。此加速过程在流速稳定后产生约1–2 μs的偏移，通常在测量远慢于混合过程的动力学时可忽略不计。
4. 代表性结果
图6显示了由光子计数器测量的混合区域中强度的等高线图。喷流外部出口通道中的背景信号应接近探测器的噪声基线，通常无需扣除。较高的背景信号可能表明对准不良，或蛋白质粘附在通道壁上。喷流出现弯曲或扭曲，特别是在混合区域附近，表明喷嘴刻蚀质量不佳。
图7展示了用Alexa 488和Alexa 647标记的蛋白质酰基辅酶A结合蛋白（ACBP）的时间分辨光谱。该数据已扣除背景信号，以消除暗电流和激光信号。背景信号是在中心通道压力设置为0 PSI时采集的。
可通过测量比混合过程快得多的快速反应来测定混合时间，例如碘化钾（KI）对色氨酸（Trp）荧光的猝灭，或通过加入 NaCl 诱导用 FRET 染料标记的单链 DNA 发生折叠。由于射流小于显微镜的光学分辨率，因此在射流形成时，混合区域会出现明显的强度下降。该仪器响应可通过进行无溶液条件变化的对照实验予以消除。图8展示了N-乙酰色氨酸酰胺荧光在混合（加入400 mM KI）与非混合实验中的比值。图中曲线表示COMSOL模拟预测的KI浓度变化。以浓度降低80%所需时间计算的混合时间为8 μs。
由于数据是在500 μm长的出口通道上以100 μm为步长采集的，因此必须将多个视野的数据拼接在一起。这些视野之间偶尔会出现信号上的微小偏移，这可能是由于显微镜载物台移动芯片时焦点发生轻微变化所致。通过每次移动载物台80或90 μm，可以利用重叠区域的数据消除这些偏移。通常需在至少两种不同的流速下采集数据，并将结果进行合并分析，以确认信号变化确实源于蛋白质真实的光谱变化，而非光学或流动效应。图9展示了变性剂浓度从6 M稀释至0.06 M后，蛋白质ACBP的FRET变化。该实验无需设置对照，因为FRET本身是一个比值信号，且仪器响应已被消除。在T=0附近出现的快速跃变代表在混合时间内FRET信号发生的迅速变化。
图1. 通过电子显微镜测量的混合区域布局。
图 2. 用于研究蛋白质折叠的流体动力学混合示意图。蛋白质溶解于高浓度变性剂中以使其去折叠，沿中心通道流向混合区域，在此处遇到流速约快100倍的缓冲液。层流迫使蛋白质流形成狭窄的射流，使变性剂分子能够快速扩散出去。当射流沿出口通道流动时，可使用共聚焦显微镜以高空间和时间分辨率观测蛋白质的折叠过程。
图 3. 熔融石英器件的制备。1) 该工艺起始于一片高度抛光的500 μm厚熔融石英基底（a），在其顶面和底面沉积有一层多晶硅（poly）（b），并旋涂一层光刻胶（c）。2) 将光掩模（e）与晶圆进行紧密接触，并用紫外光（d）照射光刻胶。3) 将晶圆放入显影液中，使光刻胶中的图形显现出来。4) 将晶圆放入深反应离子刻蚀（DRIE）设备中，将图形刻蚀到顶部的多晶硅涂层中，随后去除光刻胶。5) 接着将晶圆放入氧化物刻蚀机中，以多晶硅层作为掩模，将图形刻蚀进熔融石英基底10 - 40 μm深度。6) 使用XeF2刻蚀机去除多晶硅涂层。7) 将晶圆的功能面朝下，用热激活密封剂（g）键合到一块牺牲性玻璃板上，并使用金刚石钻头（f）从背面磨削加工通孔。8) 使用表面轮廓仪（h）直接测量刻蚀结构的深度。9) 将一片170 μm厚的熔融石英盖玻片晶圆直接键合到晶圆的顶面。10) 最后将晶圆切割成单个的微流控芯片。
图 4. 混合器流道装置。微流控芯片通过精密加工的铝制面板和位于约 200 μL 储液池下方的四个 O 型密封圈固定在溶液流道上。在流道中心加工有一个大孔，正对固定微流控芯片的混合区域上方，使多余的紫外光能够逸出，避免背向散射，从而抑制流道材料自身产生自发荧光，并允许通过肉眼或相机直接观察芯片以进行对准。气路流道可密封各个储液池，使得每个储液池内的气压可通过外部压力控制箱独立调控。
图5. 光学共聚焦显微镜示意图。
图6. 微流控混合器中色氨酸荧光的等高线图。混合区域位于y轴约90 μm处。
图 7. 在混合器内采集的时间依赖性荧光光谱。绿色和红色矩形分别表示指定为供体和受体通道的波长范围。
图 8. 通过碘化钾对色氨酸的荧光猝灭所测得的混合时间（点和右侧纵轴），以及通过有限元分析计算得到的混合时间（线和左侧纵轴）。
图9. 在蛋白质ACBP折叠过程中测得的FRET变化。在t=0附近快速上升代表混合时间内发生的爆发相，较慢的上升则代表蛋白质折叠过程中结构的逐步形成。数据在两种不同的流速下采集并叠加，导致在不同时间点测量值的密度不同。
讨论
多年来，快速混合一直是蛋白质折叠领域的发展目标，因为人们早已认识到生物分子的分子过程发生在从皮秒到秒的时间尺度上。传统的停流混合器的死时间约为1-5毫秒，主要受湍流限制。在过去15年中，少数研究团队开发出了混合时间为30-300 μs的湍流连续流动混合器，但通常需要高流速才能达到此类混合时间，因而消耗大量样品6-8。
本方案描述了使用微流控混合芯片在层流条件下实现快速稀释的方法。在此条件下操作具有多种优势，其中主要优势之一是能够高精度模拟整个混合过程，从而可以调节混合响应。其他研究团队开发的具有简单几何结构的T型混合器已实现100–200 μs的混合时间，主要受限于通道尺寸9-10。Knight通过将通道尺寸缩小至10 μm，将混合时间缩短至约10 μs11。Yao和Bakajin表明，几何结构的微小变化可显著改善混合时间4。然而，该研究也显示，混合加速的同时也可能引入较慢的相位。本研究中采用的设计12-13综合参考了文献4中两种最优设计的优点，旨在最小化变性剂浓度的缓慢指数衰减，同时提高深反应离子刻蚀（DRIE）过程中的结构可重复性。
在超快速混合领域，关于混合时间的定义一直存在一些争议。必须明确区分“混合时间”与“死时间”这两个概念。在湍流混合器中，死时间是指无法进行测量的时间段，其数值实际上可能显著长于真实的混合时间。通常通过在不同浓度下测量一个伪一级双分子反应（例如N-溴代琥珀酰亚胺对色氨酸荧光的淬灭）的多个数据点来确定死时间。将观测到的指数衰减曲线拟合至一个共同的起始点（假设为t = 0 s），该点与第一个实测数据点之间的时间即为死时间。对于层流混合器，可以在混合过程中进行测量，因此不存在死时间，只有混合时间。混合时间即指将两种溶液混合至达到足够均匀状态所需的时间。我们此前曾将混合时间定义为90/10时间，即变性剂浓度从初始未混合值的90%下降至10%所需的时间。然而，混合曲线的形状并非完全对称，其衰减尾部包含一个小的指数组分。此外，蛋白质折叠对变性剂浓度具有高度非线性的依赖性，因此即使变性剂浓度仅降低两倍，折叠过程也可能已经开始。因此，我们最近将混合时间重新定义为变性剂浓度降低80%所需的时间。当然，根据具体实验需求，也可采用其他定义方式。
使用该混合器研究蛋白质折叠始终揭示出令人意外的结果。细胞色素c和脱辅基肌红蛋白的折叠长期以来被认为包含多个折叠步骤，早期使用连续流动混合器的研究结果显示，其塌缩过程发生在约100 μs的时间尺度上10,14-15。我们使用该混合器的测量表明，在这一时间尺度上至少存在两个步骤：第一个是非常快速、可能为非特异性的塌缩过程（通过色氨酸荧光光谱位移测定），发生在混合器的混合时间内；随后是一个较慢的相变过程（通过总色氨酸发射荧光的淬灭测定），该过程很可能代表了天然结构的首次形成5。我们还在蛋白L的B1结构域中观察到一个50 μs的过程，这一发现推翻了该蛋白为两态折叠蛋白的传统观点13。
这种快速混合器的一个优势在于，它能够研究那些通常只能通过纳秒级温度跃升（T-jump）仪器测量的最快折叠蛋白质的折叠过程。T-jump 方法通常需要在蛋白质的熔解温度附近观测其折叠/去折叠的弛豫过程，因此无法追踪整个蛋白质群体的完整折叠过程。利用该混合器，我们通过色氨酸的总发射光强和光谱位移，研究了γ-阻遏蛋白（λ6-86）的折叠过程，并发现证据表明，在强折叠条件下，该蛋白质的折叠不存在能垒，而这些条件在此前的T-jump测量中是无法实现的12。最后，我们测量了villin头结构域HP-35的折叠过程——这是目前已知折叠最快的蛋白质之一——结果发现，混合后的折叠速率比在相同条件下通过T-jump测得的速率慢约5倍16。这一结果表明，折叠动力学依赖于起始条件，从而推翻了该领域的一个重要假设。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本研究工作得到了美国国家科学基金会FIBR项目（NSF EF-0623664）和IDBR项目（NSF DBI-0754570）的支持。本研究还部分获得了由生物光子学中心（美国国家科学基金会科学与技术中心）管理的美国国家科学基金会FIBR资助项目0623664的资金支持，该项目由加利福尼亚大学戴维斯分校根据合作协定PHY 0120999执行。Lisa Lapidus博士的研究工作部分得到了伯勒斯威康基金“科学界面职业奖”的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AZ P4110 光刻胶 | AZ Electronic Materials | ||
| AZ 400 K 显影液 | AZ Electronic Materials | ||
| Baker PRS 2000 光刻胶剥离剂 | Avantor Performance Materials | ||
| AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
| 500 μm 盖板晶圆 | SENSOR Prep Services | ：直径：100 mm ± 0.5 mm 厚度：0.5 mm ± 0.025 mm 标准公差（除非另有说明） 表面光洁度：SI：4–8Å；SII：8–12Å 平边：一个主平边（SEMI-STD）；一个刻痕平边 双面清洁并抛光 | |
| 170 μm 盖板晶圆 | SENSOR Prep Services | 7980 2G 晶圆 | ：直径：100 mm ± 0.5 mm 厚度：0.17 mm ± 0.025 mm 标准公差（除非另有说明） 表面光洁度：SI：4–8Å；SII：8–12Å 平边：一个主平边（SEMI-STD）；一个刻痕平边 双面清洁并抛光 |
| 用于氧化物的深反应离子刻蚀机 | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
| 氩离子激光器 | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
| 氩离子激光器 | Melles Griot | λ=488 nm | |
| 显微镜 | Olympus Corporation | IX-51 | |
| 显微镜物镜 | Thorlabs Inc. | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
| 显微镜物镜 | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
| 纳米定位器 | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
| 电动平移台 | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
| GaAsP 光子计数器 | Hamamatsu Corp. | H7421-40 | |
| 单色仪 | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
| CCD 相机 | Andor | iDus 420A-BU | |
| 盐酸胍（GuHCl） | Sigma-Aldrich | G4505 |
参考文献
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