拉曼光谱是一种适用于活细胞、组织工程构建物及天然组织的非接触、无标记分析技术。可通过多元分析生成并分析具有来源特异性的光谱指纹。
本文内容
摘要
摘要
在生物医学研究领域，亟需一种能够对细胞和组织培养物进行非破坏性、非接触且无需标记的监测技术。1-5 然而，目前可用的常规方法通常需要样品处理步骤，并会改变样品的完整性。拉曼光谱是一种快速检测方法，能够在无需额外处理步骤的情况下对生物样品进行测量。6 这种基于激光的技术可检测单色光的非弹性散射。由于每种化学键的振动均对应特定的拉曼谱带（波数，单位为 cm-1），每种生物样品因其固有的生化组成而呈现出特征性的光谱图谱。7-9 在拉曼光谱中，谱峰强度与样品中相应分子键的含量呈正相关。1 通过采用多元分析方法（例如主成分分析（PCA）），可识别光谱数据集之间的相似性与差异性。10
在此，我们对活细胞和天然组织进行拉曼光谱分析。细胞在测量前接种于玻璃底培养皿中，或在正常的细胞培养条件下（37 °C，5% CO2）保持悬浮状态。天然组织则被分离后置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在测量前于4 °C保存。根据实验设计，我们随后重点关注细胞核或细胞外基质（ECM）蛋白（如弹性蛋白和胶原蛋白）。所有研究中，至少测量30个细胞或ECM内30个随机感兴趣点。数据处理步骤包括背景扣除和归一化。
方案
1. 生物样本的制备
- 活细胞的制备
- 贴壁细胞的制备
- 种子 体外-将培养或新鲜分离的细胞接种于玻璃底培养皿（Greiner BioOne/Germany）中，并在 37 °C 和5% CO2 直到细胞贴壁完成。
- 移除培养基，测量前用 PBS 轻柔清洗三次。在整个测量过程中，始终保持细胞被 PBS 或细胞培养基覆盖。
- 细胞悬液的制备
- 解离 体外-根据常规方案消化细胞（例如使用胰蛋白酶-EDTA或刮取法），离心收集细胞，并将所得细胞沉淀重悬于PBS或细胞培养基中。
- 转移 100 μl 将细胞悬液（浓度：最高100,000个细胞/毫升）加入玻璃底培养皿中。
- 贴壁细胞的制备
- 原代组织的制备
- 组织收获后，立即转移至无菌的预冷 PBS 中，并在 4 °C 下保存不超过 12 小时 4 °C 或在测量前置于冰上。先前的实验表明，长时间储存（冷缺血时间 > 12 小时 4 °C）由于自然降解过程导致了光谱变化。
- 必须在组织覆盖 PBS 或培养基的条件下进行测量，以避免因组织干燥而损伤细胞外基质蛋白和细胞。
2. 拉曼光谱仪
我们定制的拉曼光谱仪将一台标准荧光显微镜（Olympus IX 71）与拉曼光谱仪相结合，可实现明场和荧光图像与拉曼光谱的直接比对。基本装置包括一个784 nm的半导体激光器（Toptica photonics AG/Germany）、一个用于分离拉曼散射光与激发光的陷波滤光片、一台显微镜，以及一台配备电荷耦合器件（CCD相机，F-view，Soft Imaging Systems/Germany）的光谱仪（Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor/USA），该光谱仪专为光谱信息检测而优化。
3. 激光功能的控制
- 启动 Andor Solis 软件（Andor/英国），并将 CCD 相机的温度设置为 -60 °C，以最大限度减少相机中热诱导电流引起的噪声。
- 将硅晶圆放置在显微镜载物台上，用于校准程序。
- 打开激光器，并将功率设置为 85 mW。
- 使用 Cell B 软件（Olympus/德国）将激光聚焦到晶圆上，直至出现 XY 界面。
- 使用 60 倍空气物镜，以 1 秒的单次积分时间对硅晶圆进行测量。
- 在 Andor Solis 软件中，将横轴单位从像素数更改为拉曼位移（cm-1）。
- 调节所采集光谱中位于 520 cm-1 的硅峰的激光聚焦，以找到该拉曼峰所能达到的最大强度。为完成有效校准，最小计数值必须高于 11,000。
4. 拉曼光谱测量
所有测量均在室温下进行。
- 基本设置
- 使用数值孔径为1.2的60倍水浸物镜（Olympus/德国）采集样品的光谱。
- 将采集参数设置为每次测量10次积分，每次积分10秒，总计每样品测量100秒。
- 贴壁细胞的测量
- 取带有细胞的玻璃底培养皿，将其放置于显微镜载物台上。
- 为获得更佳信号并确保可重复性，将激光聚焦于细胞核区域，关闭显微镜照明光源，开始采集光谱。
- 每采集10个细胞光谱后，通过将激光焦点移至细胞旁区域测量一次背景参考光谱。需注意的是，每次改变焦深时，必须重新采集对应深度的背景光谱。
- 悬浮细胞的测量
- 将100 μl细胞悬液转移至玻璃底培养皿中，并将其放置于显微镜载物台上。
- 将激光聚焦于细胞中心，关闭显微镜照明光源，开始采集光谱。
- 每采集10个细胞光谱后，通过将激光焦点移至细胞旁区域测量一次背景参考光谱。每次改变焦深时，必须重新采集对应深度的背景光谱。
- 原生组织的测量
- 取待测样品并将其置于玻璃底培养皿中，确保感兴趣区域（ROI）朝向培养皿底部。
- 向培养皿中加入足量PBS以完全覆盖样品。
- 在样品上方加盖盖玻片，以防止测量过程中样品移动。
- 将激光焦点设定于目标结构内（深度分辨率取决于激光与组织特性），开始采集光谱。
- 每采集10个组织光谱后，将激光焦点移出整个组织区域以采集一次背景参考光谱。每次改变焦深时，必须重新采集对应深度的背景光谱。
- 免疫荧光（IF）标记冷冻切片的测量
- 使用标准冷冻切片机对新鲜速冻的组织样本进行切片，并将其贴附于硅化涂层的盖玻片上。
- 按照常规IF染色流程对冷冻切片进行染色，仅采用短暂固定步骤（最多使用4%多聚甲醛固定10分钟），并使用针对目标蛋白的特异性抗体。
- 在荧光信号出现的区域进行拉曼光谱测量，激光聚焦于该区域。
- 弹性蛋白降解实验
- 将分离的猪主动脉瓣叶ventricularis层（富含弹性蛋白，为心脏瓣膜瓣叶的血流进入侧）朝下放置于玻璃底培养皿底部。
- 在未孵育对照组中，于整个组织表面随机选取30个点位，聚焦于纤维结构进行原生组织的光谱测量。
- 将样品分为3个部分，分别放入三个含有2 ml弹性蛋白酶溶液（5 U/ml，Worthington/德国）的2.5 ml离心管中。
- 在37 °C条件下孵育15分钟或30分钟。
- 孵育15分钟或30分钟后，将组织从离心管中取出，并用PBS小心清洗，以彻底终止酶反应。
- 对每个样品在30个随机点位进行测量，激光聚焦于纤维结构。
5. 数据处理与分析
- 拉曼光谱处理
使用 OPUS 软件（Bruker Optik GmbH/德国）对生成的光谱进行预处理。- 为降低玻璃和培养基带来的干扰信号，并避免测量过程中因焦距变化引起的信号波动，需从采集到的光谱中减去相应的背景光谱。
- 将光谱数据缩减至波数范围 400–1800 cm-1，该区间包含最丰富的信息。
- 如有需要，将光谱归一化至最大峰强度。归一化可消除强度波动和系统性偏差，有助于更清晰地识别样品光谱中的结构变化。
- 进行基线校正，以提高不同实验之间的可比性。
- 拉曼光谱分析
采用 The Unscrambler（CAMO/挪威）软件对拉曼光谱进行主成分分析（PCA）。该多变量分析方法可用于检测光谱数据集内部的差异与相似性。每条光谱根据各拉曼位移处的计数被表示为多维空间中的一个点。每个主成分（PC）描述了原始数据中特定比例的总信息量。第一主成分（PC1）包含最大的变异来源，随后的每个主成分依次包含的信息量递减。每个变量在每个主成分上均有对应得分（score）和载荷（loading）。通过绘制主成分得分图，可揭示重要的样本间相关性。载荷值则描述了每个分析变量对主成分分析结果的贡献程度。- 通过为每个样品组创建行范围，对各测量组进行标签标注。
- 使用以下基本设置进行主成分分析：采用交叉验证，选择 NIPALS 算法，不进行旋转，并开始分析。这些设置依赖于具体光谱特征。
- 执行主成分分析。
6. 典型结果
来自贴壁细胞的拉曼光谱通常表现出较低的信噪比和整体信号强度（图1）11。由于激光焦点必须设置在玻璃底部附近，来自玻璃的干扰信号影响较大，从而掩盖了实际样品的信号。因此，在后续背景扣除过程中，样品信号可能被削弱甚至完全消除。因此，我们更倾向于在拉曼光谱分析中使用悬浮细胞，因为它们能够提供更丰富的光谱信息。然而，贴壁细胞与悬浮细胞的光谱具有相同的主要峰位，仅在峰强度上有所差异。
对于悬浮液中不同类型细胞的表征，无需进行预处理。图中展示了在悬浮状态下测得的人成纤维细胞、间充质干细胞（MSCs）、软骨细胞和角质形成细胞的平均拉曼光谱及其标准差（图2）。所有拉曼光谱结构相似，其峰信号来源于典型的生物分子，如蛋白质、核酸和脂质（见表1）12。对于这些细胞类型，600 至 1800 cm-1 的光谱区域包含了大多数相关光谱信息，可清晰区分不同细胞类型之间的差异（图2A）。作为示例，我们突出显示了一个具有明显结构差异的光谱区域（1280–1350 cm-1），该区域可归属于胶原蛋白和脂质的分子振动。相比之下，形态学分析不适用于大多数细胞的识别与区分（图2B–I）。尽管软骨细胞与皮肤细胞之间的差异可以观察到（图2D,H 对比 B,F 以及 E,I），但仅通过明场显微镜难以区分成纤维细胞与间充质干细胞（图2B,F 对比 C,G）13。
对天然组织（特别是细胞外基质蛋白）进行拉曼光谱分析时，需要通过明场成像观察到感兴趣区域（ROI），以便能够聚焦于相应结构。为了将特定蛋白质与其特征光谱相对应，我们采集了市售纯蛋白质以及免疫组织化学染色冷冻切片的拉曼光谱。在此，我们通过比对冻干弹性蛋白以及使用抗弹性蛋白抗体进行免疫荧光染色的冷冻切片，确定了天然组织中弹性纤维的特征光谱。然而，由于弹性蛋白具有强烈的自发荧光，该特性会反映在拉曼光谱中，从而给数据分析带来挑战（图 3A）。为减少因样本自身特性（如自发荧光）导致的系统性偏差，对数据集进行适当处理至关重要。在我们的数据分析中，采用了归一化方法以消除纯弹性蛋白信号强度显著偏高的影响，从而获得可比较的拉曼光谱（图 3B）。弹性蛋白是体内最稳定的细胞外基质蛋白之一，因此极难降解14。在本实验设计中，我们通过酶消化法诱导健康猪主动脉瓣叶中的弹性蛋白降解。采用多元分析方法主成分分析（PCA），我们发现经酶处理样本与天然对照样本的拉曼光谱之间存在显著差异（图 3C）。这些光谱差异体现在 861、1003 和 1664 cm-1 处的载荷光谱中。通过 HART 染色显示，随着弹性蛋白酶作用时间延长，含弹性蛋白的纤维出现预期的结构变化（图 4），该变化也在更加明显分离的得分簇中得到体现（图 3C）。
图1. 脱离和贴壁成纤维细胞的平均拉曼光谱。
图 2. (A) 四种不同原代分离细胞类型（成纤维细胞、间充质干细胞、软骨细胞和角质形成细胞）的平均拉曼光谱及其标准差。框内突出显示了 1280 - 1350 cm-1 的光谱区域，该区域存在结构差异。(B-E) 脱落的 (B) 成纤维细胞、(C) 间充质干细胞、(D) 软骨细胞和 (E) 角质形成细胞的明场图像。比例尺为 20 μm。(F-I) 贴壁生长的 (F) 成纤维细胞、(G) 间充质干细胞、(H) 软骨细胞和 (I) 角质形成细胞的明场图像。比例尺为 200 μm。
图3. （A）冻干弹性蛋白（蓝色线）、免疫荧光（IF）标记的冷冻切片（橙色线）以及在天然主动脉瓣叶内测得的弹性纤维（红色线）的拉曼光谱（未归一化）。冻干弹性蛋白的高信号强度由自发荧光引起。（B）归一化后的拉曼光谱，以消除系统性偏差。（C）天然组织中未经处理的对照组（红色）与酶解处理后的弹性纤维（蓝色和绿色）之间的主成分得分图与载荷图比较。
图4. 经HART染色的猪主动脉瓣瓣叶。弹性纤维呈黑色。（A）和（B）为未经处理的对照组，（C）和（D）为暴露于弹性蛋白酶（elastase）降解弹性蛋白30分钟后的组织样本。
| 波数（cm-1） | 归属12 | |
| 717-719 | C-N | 磷脂 |
| 785-788 | DNA/RNA 碱基， O-P-O 骨架 | DNA/RNA |
| 1003-1005 | 苯丙氨酸 | 蛋白质 |
| 1220-1280 | 酰胺 III | 蛋白质 |
| 1445-1447 | CH2 | 蛋白质/脂质 |
| 1655-1680 | 酰胺 I C=C | 蛋白质 脂质 |
表1. 在所有细胞类型（成纤维细胞、间充质干细胞、软骨细胞和角质形成细胞）光谱中检测到的拉曼峰。
讨论
拉曼光谱是一种适用于分析生物样本（例如 体外培养的细胞、ECM蛋白以及天然组织中的细胞。11,15,16 在此，我们证明了这种非接触、无标记的技术仅基于这些生物样本的内在生物分子组成，即可实现不同细胞类型的区分以及细胞外基质蛋白降解的检测。
拉曼光谱的主要优势在于能够通过样品产生的拉曼光谱，非侵入性地定量分析其生化特征指纹。与提供类似信息的红外光谱相比，拉曼光谱可从水溶液样品中采集，因为水的拉曼散射信号较弱。此外，拉曼光谱仅基于单色光后向散射的检测，因此测量前无需对样品进行任何处理。这些特性使拉曼光谱成为潜在的体内成像应用的一种有前景的替代方法。在这方面，相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）是一种非常有趣的技术，因为它能够基于本实验所利用的相同振动信号，实现更快且更灵敏的数据采集。15,16 其他替代方法，包括多光子诱导自体荧光和二次谐波生成成像，此前已被证明适用于非侵入或微侵入式地监测生物样品。17 然而，这些成像方式成本极高，且仅限于能产生自体荧光的分子。此外，拉曼光谱仪易于与常规光学显微镜联用。这些特性使拉曼光谱成为在生理环境中研究生物样品的有力工具。
目前我们的拉曼光谱系统存在一个局限性，即使用高数值孔径物镜（NA=1.2）所产生的激光聚焦光斑较小（横向全宽半高为250 nm，轴向全宽半高为700 nm）。尽管高数值孔径有助于收集较多的发射拉曼光信号，从而获得较高的信噪比，但其产生的采样聚焦区域在样品中非常小，通常远小于一个细胞的尺寸。为了比较不同细胞的拉曼光谱，获取具有代表性的光谱至关重要，而使用较小的聚焦区域则难以实现这一点。为解决该问题，我们正在开发一种在细胞内多个位置自动采集信号的技术（即拉曼光谱成像），通过对多个位置的光谱进行平均，从而获得具有代表性的光谱。此外，该技术还将提供特定拉曼谱带分布的总体信息，例如细胞内蛋白质的分布情况。
生物样本具有高度复杂性，包含多种异质性的生物分子，这些分子共同贡献于采集到的拉曼光谱。因此，光谱模式极为复杂，单凭拉曼光谱监测某一种特定分子时，常因不同分子信号的重叠而难以实现。此外，样本固有的荧光可能掩盖较弱拉曼信号的有价值信息。有趣的是，在我们之前的一些研究中，通过适当的分析工具，我们发现拉曼光谱中的自体荧光是区分细胞类型（间充质干细胞与成纤维细胞）的主要判别因素13。我们还发现，整体拉曼信号强度的变化可作为主动脉瓣叶细胞外基质（ECM）中胶原及其纤维状态的指示指标9。然而，在分析这些组织中弹性蛋白的状态时，我们未能获得类似的结果。如结果部分所述，与天然对照组相比，我们仅能检测到弹性酶处理样本中特定拉曼峰的变化。我们并未观察到酶处理样本的整体拉曼信号强度如预期般下降。这些现象导致所得的得分图未能像先前研究中那样呈现出清晰的聚类模式9。相反，酶处理的影响在主成分分析（PCA）结果中仍可被检测到。我们认为，弹性蛋白与胶原这两种细胞外基质蛋白之间的这些差异，源于其形态学差异以及不同的酶降解过程：在主动脉瓣叶中，富含胶原的区域（fibrosa）为连续层状结构，经酶处理后变得疏松；而含弹性蛋白的区域（ventricularis）则呈网状结构，在弹性酶作用后呈现碎片化（图4）。因此，单点拉曼测量不足以检测弹性蛋白网络中的微小断裂。在此情况下，对组织进行拉曼成像将有助于识别网络结构的破坏情况。
生物样品拉曼光谱分析的另一个挑战是缩短测量时间。一种解决方案是提高激光功率，只要生物样品不受光损伤影响，这种方法就是可行的。我们目前的所有实验均为侧重于基础研究的原理验证性研究；然而，我们的总体目标是将拉曼光谱技术应用于临床领域，包括再生医学（例如组织工程产品的质量控制）、移植前移植物监测以及癌症诊断。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢 Steffen Koch 提供的技术支持，以及 Shannon Lee Layland（均来自斯图加特弗劳恩霍夫界面工程与生物技术研究所）对本文稿提出的宝贵建议。本工作得到了弗劳恩霍夫协会的 Attract 计划和德国联邦教育与研究部（BMBF）的经费支持（均授予 K.S.-L.）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 弹性蛋白酶 | Worthington Biochemical | LS006363 | |
| 抗弹性蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | HPA018111 | 1:75；柠檬酸盐缓冲液 |
| PBS | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 玻璃底培养皿 | Greiner Bio-One | 627860 | |
| The Unscrambler | CAMO | ||
| Opus | 布鲁克公司 |
参考文献
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重印与许可
