在此，我们介绍一种小鼠胚胎胰腺的分离、培养与操作方法。该方法是一种极佳的 离体 用于研究胰腺发育的多种方面，包括形态发生、分化和生长。胰腺芽外植体可培养数天，并适用于多种不同应用，包括整体免疫荧光染色和活体成像。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
胰腺控制着人体的重要功能，包括消化酶的产生和血糖水平的调节1。尽管在过去十年中，许多研究为理解胰腺器官发生奠定了坚实的基础，但我们对胰腺早期形成过程的认识仍存在重要空白2。全面理解这些早期事件不仅有助于揭示该器官的发育机制，也有助于深入了解以胰腺为靶点的难治性疾病，例如糖尿病或胰腺癌。最后，这些信息将为糖尿病背景下的细胞替代疗法提供设计蓝图。
在胚胎发育过程中，小鼠胚胎于胚胎第9.5天（E9.5）时，胰腺起源于前肠内胚层背侧和腹侧两个独立的胚胎突起3,4。这两个突起以实心上皮芽的形式向外突出至周围的间充质中，并通过增殖、分支和分化最终形成一个完全成熟的器官2,5,6。最近的研究证据表明，包括胰岛素生成细胞（β细胞）在内的胰腺细胞谱系的生长与分化，依赖于正确的组织结构、上皮重塑以及细胞在分支状胰腺上皮内的精确定位7,8。然而，胰腺中分支形态发生如何发生，并如何与细胞增殖和分化相协调，目前仍知之甚少。部分原因在于，目前对这些发育过程的认识几乎完全依赖于对固定样本的分析，而形态发生事件本身具有高度动态性。
此处，我们报道一种分离和培养小鼠胚胎胰腺芽的方法 离体 在玻璃底培养皿中，可直接观察胰腺的发育过程（图1）。该培养系统特别适用于共聚焦激光扫描显微镜，尤其是活细胞成像。胰腺外植体不仅可以取自野生型小鼠胚胎，也可取自基因工程小鼠品系。例如 转基因或基因敲除），从而实现对突变表型的实时研究。此外，该方法 离体 培养系统对于研究化学化合物对胰腺发育的影响具有重要价值，能够获得有关细胞增殖与生长、伸长、分支、管状结构形成及分化的定量数据。综上所述，一种用于研究胰腺发育的 离体 胰腺外植体培养方法结合高分辨率成像技术，为观察小鼠胚胎发育过程中发生的形态发生和分化事件提供了强有力的平台。
方案
本方案改编自Percival和Slack最初描述的技术9，并针对共聚焦显微镜进行了优化。
1. 玻璃底培养皿的包被
以下步骤应在超净工作台内的无菌条件下进行。
- 胰腺外植体在直径35 mm、底部带有直径20 mm玻璃微孔的培养皿中培养（例如 MatTek 公司）。每个外植体培养使用一个玻璃底培养皿，并在整个培养期间持续使用。在胰腺芽分离和解剖的前一天，用纤连蛋白包被玻璃底微孔。
- 将无菌纤连蛋白用细胞培养级水稀释至 50 μg/ml 终浓度，并加入其最小体积（约150 μl) 加入 MatTek 培养板的 20 毫米微孔中，覆盖整个玻璃表面（图1E。将培养皿放入 4 °C 冰箱中孵育过夜。
- 在解剖当天，吸除纤连蛋白，用细胞培养级水清洗微孔，并加入最小体积的 150 μl 添加青霉素/链霉素（1%）、谷氨酰胺（1%）的BME（Basal Medium Eagle）培养基 50 μg/ml 庆大霉素 [解剖培养基]。将包被好的培养皿置于超净工作台中，直至准备接种组织块。
如果未使用全部纤维连接蛋白包被的培养皿，可将其在 4 °C 下保存最多 1 周。切勿让培养皿干燥，应将其充满解剖培养基后置于冰箱中。
除了纤维连接蛋白外，胰腺外植体还已在多种基质上成功培养，例如层粘连蛋白9，Matrigel10,11 或微孔膜12由于其对分支的影响，我们使用纤连蛋白9 作为底物。
2. 从小鼠 E11.5 至 E12.5 胚胎中分离背侧胰腺芽
- 在胚胎第 (E) 11.5 或 12.5 天处死妊娠母鼠，使用经 70% 乙醇清洗过的解剖器械收集胚胎。将解剖出的子宫置于含有冰上预冷的 PBS（添加 50 μg/ml 庆大霉素）的 10 cm 培养皿中。
- 在上方照明的体视显微镜下，用小剪刀或杜蒙特镊子将子宫分离为单个胚胎节段，轻轻剥离子宫肌层并取出被蜕膜包裹的单个胚胎。采用标准胚胎解剖技术13暴露胚胎，并去除卵黄囊和羊膜。随后，切除胚胎上部（肝脏以上部分）及尾部区域，以暴露内脏器官（图 1B）。将胚胎中段转移至含有冰上预冷的 BME 解剖培养基的 10 cm 培养皿中。
- 此时仅使用下方透射照明，在体视显微镜下观察并解剖背胰芽。用镊子做侧向切口，轻轻打开胚胎中段，定位胃和脾脏。背胰芽位于胃后部外侧区域并与其相连（图 1C）。使用杜蒙特镊子将背胰芽从邻近结构（如胃和脾脏）中分离，但保留围绕上皮的部分间充质组织（图 1D）。用玻璃巴斯德吸管将分离的胰芽转移至含有冷 BME 解剖培养基（添加 10% 胎牛血清 [培养基]）的 35 mm 培养皿中。重复上述步骤，直至完成所有胰芽的分离。若需分离不同基因型的胰芽，应使用 Nunc 4 孔板分别存放。
3. 胰腺外植体的铺板与培养
组织块的最终铺板操作在组织培养室中进行，和/或在靠近组织培养孵育箱的区域进行，以尽量减少培养物的物理移动。
- 在超净台内的无菌条件下，用约 150 μl 预热至 37 °C 的 BME 培养基替换纤维连接蛋白包被的 MatTek 培养皿中的 BME 解剖培养基。
- 使用玻璃巴斯德吸管小心地将胰腺外植体转移至包被的 MatTek 培养皿中（每皿一个外植体），用于长期培养。为确保培养过程中外植体充分铺展，必要时可用细针轻微撕除其周围间充质组织。
- 将培养物轻柔地放入组织培养孵箱（37 °C；5% CO2）中孵育数小时，使外植体贴附于玻璃底微孔板底部。一旦外植体贴壁，加入预热至 37 °C 的 BME 培养基至终体积 1.5 ml 至 2 ml。解剖当日记为第 0 天。
- 胰腺外植体培养物的操作均在超净台内无菌条件下进行。BME 培养基每隔一天更换一次，除非实验需求另有规定（e.g. 外植体与化学试剂共孵育）。外植体在此条件下可培养 5 天至一周。
4. 胰腺外植体全组织免疫荧光染色方案
免疫荧光实验的全部步骤（从固定到成像）均在同一 MatTek 培养皿中进行，其成像效果优于塑料底培养皿。固定后，胰腺外植体培养物无需维持无菌条件。
- 吸去 BME 培养基，并用 2 ml 1× PBS 洗涤组织块一次。
- 固定组织块时，将 PBS 替换为 2 ml 冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA），将培养皿置于冰上固定 20 分钟。期间轻轻晃动培养皿，但避免使用摇床，以防组织块脱落。
- 移除 PFA，用 2 ml 1× PBS 在室温下洗涤组织块三次，每次 10 分钟。
- 用 2 ml 封闭液（1× PBS + 0.1% Triton-X + 3% 驴血清）在室温下封闭至少 30 分钟。
- 将一抗用封闭液稀释后，取约 150 μl 稀释液直接加入 MatTek 培养板的 20 mm 微孔中，确保完全覆盖组织块表面，于 4 °C 过夜孵育。为减少物理扰动，应在低温冰箱（4 °C）内直接向组织块中加入一抗。为防止蒸发，在加入抗体前，将 MatTek 培养板置于湿盒中。
- 次日，移除抗体溶液，并用 2 ml 1× PBS + 0.1% Tween-20（PBT）在室温下洗涤三次，每次 30 分钟。
- 根据生产商推荐浓度，将二抗用封闭液稀释（本实验采用驴抗 Alexa Fluor 荧光染料二抗，稀释比例为 1:750），取约 150 μl 稀释液直接加入 MatTek 培养板的 20 mm 微孔中，完全覆盖组织块表面，在室温避光孵育 1–2 小时。如需进行细胞核复染，可将 Hoechst 与二抗稀释液一同加入。为防止蒸发，在加入抗体前，将 MatTek 培养板置于湿盒中。
- 用 2 ml 1× PBS + 0.1% Tween-20（PBT）在室温下洗涤三次，每次 30 分钟。
- 封片前，用 1× PBS 洗涤一次，以去除 Tween-20。向 MatTek 培养板的 20 mm 微孔中加入一滴含抗荧光淬灭剂的水性封片剂，轻轻盖上盖玻片，覆盖组织块，避免产生气泡。
- MatTek 培养板上的组织块可根据实验目的，使用标准相差显微镜或共聚焦显微镜观察。在共聚焦显微镜分析中，我们采用 Zeiss LSM 700 倒置系统。根据所用荧光染料设置合适的激光器，选择可成像胰腺组织块目标区域的物镜。10X 水浸物镜适用于将整个组织块保留在视野内；40X 水浸或油浸物镜则适用于更高分辨率下观察胰腺组织块的特定区域。可通过光学切片获取 Z 轴层扫图像，并利用相应软件将获得的 Z 轴图像堆栈重建为三维图像。
5. 胰腺外植体的活细胞成像方案
- 环境舱设置：使用环境封闭装置和小型培养舱（具备温度和CO2 对照] 置于显微镜载物台上。胚胎胰腺的正常培养需要稳定的温度 37 °C 以及含有加湿的5% CO的可控大气环境2合适的培养室可从多家供应商处获得 (例如，蔡司、尼康、奥林巴斯）。组装加热箱并至少在成像开始前1小时开启，以使设备预热并使CO₂平衡2 含量至5%。
- 对于胰腺外植体培养物的延时成像，我们使用蔡司 LSM 700 倒置显微镜。关于激光器和物镜的选择，请参见第 4.10 步。
- 让胰腺外植体充分贴附于玻璃底培养皿后，再开始活体成像。[我们通常从第1天开始进行活体成像]。
在超净工作台中，吸除组织块培养基，并更换为新鲜的 BME 培养基，以确保起始培养处于最佳营养条件。 - 轻轻地将外植体转移至显微镜室，并将MatTek培养皿放入共聚焦显微镜样品 holder 的孵育 chamber 中。
- 准备物镜（例如 根据浸没物镜的选择加入油或水介质，并聚焦于外植体中感兴趣的区域。正确关闭环境舱。为防止使用水浸物镜进行延时成像时发生蒸发，建议使用市售的黏稠浸没液替代水例如 Zeiss Immersol W
- 设置激光强度、Z轴层扫采集参数和时间间隔（问题排查参见讨论部分）。启动实验。
- 成像后，导出Z轴层扫图像和所有时间点，并使用适当的软件进行分析（例如 ImageJ、Volocity、Imaris、Huygens
6. 代表性结果
背侧胰芽（连同周围间充质）从 E11.5 至 E12.5 的小鼠胚胎中分离，并直接接种于玻璃底培养皿中图1）。血管存在于上皮周围间充质中，可通过针对内皮标志物Pecam的免疫染色进行观察。12 （数据未显示）。培养两天后，胰腺外植体出现显著生长，并开始自组织形成分支状上皮结构，其细胞核对胰腺转录因子 Pdx1 呈阳性反应。图2A-C). 培养第3天胰腺外植体的平均z轴厚度为60-80 μm. 可使用适当的软件测量外植体的表面积和体积（例如 Huygens)。形态学与免疫荧光分析显示，采用本方案培养的胰腺外植体 recapitulated 体内 早期胰腺分化与形态发生事件5,10,11,14 (图2). 培养第4天的胰腺外植体发生了上皮典型的“顶端与主干”区隔化8，显示上皮分支末端的 cpa1+ 祖细胞（图 2C）以及在主干内以簇状排列的、已分化的胰岛素阳性（insulin+）和胰高血糖素阳性（glucagon+）细胞图 2D）。此外，胰腺上皮在 离体 培养物显示出正常的细胞骨架排列和细胞极性，F-actin 位于顶端图 2E，绿色）以及基底膜处的b1-整合素（b1-integrin）图2E，用红色标出。
为了实时研究胰腺的分支过程，从双色荧光报告小鼠品系膜-番茄红/膜-绿色15（mT/mG；小鼠品系可从杰克逊实验室获得）中分离出胚胎胰腺外植体（图3）。图3展示了在培养中生长的mT/mG胰腺外植体延时录像的若干静态帧。mT荧光蛋白定位于膜结构，可勾勒出细胞形态，并能够分辨细微的细胞过程，从而实现对细胞形态重塑和迁移的长时间追踪。
经过12小时的延时实验，mT荧光信号仍然保持活性并可被检测到，尽管其强度有所降低，这很可能是由于光损伤所致（图3）。有关避免或减少光损伤和光毒性的技术解决方案在“讨论”部分中进行了阐述。
图 1. 从小鼠 E12.5 胚胎中解剖背胰芽的示意图。（A）E12.5 小鼠胚胎的明场图像。移除胚胎的上部（肝脏以上部分）和尾部区域，以分离中段躯体（B）。红色虚线表示切口位置。（C）进一步解剖暴露胃和十二指肠区域（由虚线框标示）。背胰芽位于胃基部，紧邻脾原基（见红色虚线圆圈）。解剖得到的背胰芽（D）用巴斯德吸管转移至含 BME 培养基的玻璃底培养皿的微孔中（E，F）。缩写：sto（胃），sp（脾），dp（背胰芽），duo（十二指肠）。比例尺：1000 μm（A，C）。
图2. 胰腺外植体培养的全组织共聚焦免疫荧光分析。（A）胰腺外植体在培养第1天和第2天的明场图像 离体 培养。红色虚线表示上皮分支的起始。 (B) 第3天胰腺培养中Pdx1的全装免疫荧光染色三维重建。胰腺外植体在培养48小时后显示出Pdx1+细胞形成的管状结构，并发生广泛分支。 (C) 第3天胰腺外植体的全装免疫荧光染色，使用针对基底外侧膜标志物E-钙黏蛋白（Ecad）、尖端祖细胞标志物羧肽酶1（Cpa1）以及磷酸化组蛋白H3（pHH3）的抗体。大多数有丝分裂活跃的pHH3+细胞与Cpa1+细胞共定位于分支的外围尖端。虚线表示分支的尖端。 (D) 第3天胰腺外植体内分泌谱系标志物胰岛素（Ins）和胰高血糖素（Gluca）的全装免疫荧光染色。黄色箭头指示Ins+和Gluca+细胞的簇状结构。插图（D'）为其中一个内分泌细胞簇的高倍放大图像。 (E) 第3天胰腺外植体Pdx1、β1整合素（β1int）和F-肌动蛋白（Fact）的全装免疫荧光染色。Pdx1阳性上皮细胞间散布着间充质细胞（星号）。图C、D和E所示图像均为Z轴序列的单个共聚焦光学切片。比例尺， 100 μm （A，B）； 50 μm （C-E）。
图 3. 体外培养胰腺外植体的代表性活细胞成像。（A-D）来自 mT/mG 转基因小鼠胚胎胰腺外植体的延时录像中的帧图像。成像时间以小时:分钟表示。外植体从第 1 天开始成像。使用 40X 油浸物镜每 12 分钟获取一次 Z 轴层扫图像，共持续 15 小时。虚线表示分支的顶端以及上皮与间充质之间的边界。比例尺，50 μm。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
一旦确定胰腺命运，胰腺前体细胞将经历广泛的增殖、分化和形态发生，最终形成一个成熟且具有功能的器官2,4目前，胰腺分支形成的机制及其与前体细胞增殖和分化的关联在很大程度上尚不清楚。胰腺外植体培养是阐明这些过程的理想体系。 离体5,9,11结合活细胞成像与 离体 早期胰腺芽外植体可清晰展示胚胎发育过程中胰腺形态发生的各项事件。本文视频展示了一种建立 离体 在玻璃载体上培养的胚胎胰腺组织，非常适合进行整体免疫荧光染色和活体成像。
大量使用实例 离体 用于成像细胞形态、生长和分化的胰腺外植体在此展示。重要的是，这些实例表明，培养的胚胎胰腺 离体 使用本方案模拟早期阶段 在体 胚胎胰腺发育2,3例如，E11.5 胰腺在接种后约 24 小时开始分支，符合预期 在体 （图2A）。尽管培养物中的形态发生和细胞分化过程与所观察到的相似 体内，外植体的整体生长情况无法与正在发育的胚胎相比较，且...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
科学研究 Spagnoli 实验室由德国亥姆霍兹联合会、FP7-IRG-2008-ENDOPANC 项目资助以及 ERC-2009-起始资助 HEPATOPANCREATIC 项目提供资金支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗体： 羧肽酶 E-cadherin F-actin 胰高血糖素 胰岛素 β1-整合素 Pdx1 Pdx1 磷酸化组蛋白 H3 | AbD Serotec Invitrogen 分子探针 ImmunoStar Millipore 默克密理博 Abcam 杂交瘤库 细胞信号传导 | 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 | |
| 基础伊格尔培养基（BME） | Sigma | B1522-500ML | 在无菌条件下保存 |
| 细胞培养级水 | 聚丙烯酸 | S15-012 | 在无菌条件下保存 |
| 培养皿（玻璃底），35 毫米 | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| 驴血清 | Chemicon | S30-100 毫升 | |
| 胎牛血清 Gold | 聚丙烯酸 | A15-151 | 在无菌条件下保存 |
| 纤连蛋白 | Invitrogen | 330100-8 | 储存液：1 mg/ml，溶于细胞培养级水 |
| 庆大霉素 | Invitrogen | 15750-037 | 在无菌条件下保存 |
| 谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030-024 | 在无菌条件下保存 |
| 4孔多孔培养皿 | Nunc | 176740 | |
| 显微镜： 倒置共聚焦显微镜（LSM 700） 体视显微镜（Discovery V12） | Zeiss Zeiss | 目标： C-Apochromat 10X / 0.45 W M27（工作距离 1.8 mm；成像深度约 100 mm）；C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27（工作距离 0.28 mm；成像深度约 50 mm） μm) 从下方透射照明并从上方进行光纤照明 | |
| 多聚甲醛 | Roth | 0335.3 | 20% 储存液 |
| 巴斯德吸管（玻璃），150 mm | VWR | HECH567/1 | |
| 青霉素/链霉素 | 聚丙烯酸 | P11-010 | 在无菌条件下保存 |
| 培养皿，60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| 培养皿，35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1× PBS，pH 7.4 | 聚丙烯酸 | H15-002 | 在无菌条件下保存 |
| 弹簧剪 8 mm 刀片 弯型 | 精细科学工具 | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 钟表匠镊子 Dumont #5 | Roth | K342.1 |
参考文献
- Slack, J. Developmental biology of the pancreas. Development. 121, 1569-1580 (1995).
- Pan, F., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).
- Puri, S., Hebrok, M. Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development. Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).
- Spagnoli, F. M. From endoderm to pancreas: a multistep journey. Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).
- Hick, A. -C. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).
- Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137, 4295-4305 (2010).
- Kesavan, G. Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification. Cell. 139, 791-801 (2009).
- Zhou, Q. A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis. Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).
- Percival, A., Slack, J. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Magenheim, J. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
- Horb, L. D., Slack, J. M. Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas. Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
