一种系统 离体 胚胎胰腺的培养

摘要

在此，我们介绍一种小鼠胚胎胰腺的分离、培养与操作方法。该方法是一种极佳的 离体 用于研究胰腺发育的多种方面，包括形态发生、分化和生长。胰腺芽外植体可培养数天，并适用于多种不同应用，包括整体免疫荧光染色和活体成像。

摘要

胰腺控制着人体的重要功能，包括消化酶的产生和血糖水平的调节¹。尽管在过去十年中，许多研究为理解胰腺器官发生奠定了坚实的基础，但我们对胰腺早期形成过程的认识仍存在重要空白²。全面理解这些早期事件不仅有助于揭示该器官的发育机制，也有助于深入了解以胰腺为靶点的难治性疾病，例如糖尿病或胰腺癌。最后，这些信息将为糖尿病背景下的细胞替代疗法提供设计蓝图。

在胚胎发育过程中，小鼠胚胎于胚胎第9.5天（E9.5）时，胰腺起源于前肠内胚层背侧和腹侧两个独立的胚胎突起^3,4。这两个突起以实心上皮芽的形式向外突出至周围的间充质中，并通过增殖、分支和分化最终形成一个完全成熟的器官^2,5,6。最近的研究证据表明，包括胰岛素生成细胞（β细胞）在内的胰腺细胞谱系的生长与分化，依赖于正确的组织结构、上皮重塑以及细胞在分支状胰腺上皮内的精确定位^7,8。然而，胰腺中分支形态发生如何发生，并如何与细胞增殖和分化相协调，目前仍知之甚少。部分原因在于，目前对这些发育过程的认识几乎完全依赖于对固定样本的分析，而形态发生事件本身具有高度动态性。

此处，我们报道一种分离和培养小鼠胚胎胰腺芽的方法 离体 在玻璃底培养皿中，可直接观察胰腺的发育过程（图1）。该培养系统特别适用于共聚焦激光扫描显微镜，尤其是活细胞成像。胰腺外植体不仅可以取自野生型小鼠胚胎，也可取自基因工程小鼠品系。例如 转基因或基因敲除），从而实现对突变表型的实时研究。此外，该方法 离体 培养系统对于研究化学化合物对胰腺发育的影响具有重要价值，能够获得有关细胞增殖与生长、伸长、分支、管状结构形成及分化的定量数据。综上所述，一种用于研究胰腺发育的 离体 胰腺外植体培养方法结合高分辨率成像技术，为观察小鼠胚胎发育过程中发生的形态发生和分化事件提供了强有力的平台。

方案

本方案改编自Percival和Slack最初描述的技术⁹，并针对共聚焦显微镜进行了优化。

1. 玻璃底培养皿的包被

以下步骤应在超净工作台内的无菌条件下进行。

1. 胰腺外植体在直径35 mm、底部带有直径20 mm玻璃微孔的培养皿中培养（例如 MatTek 公司）。每个外植体培养使用一个玻璃底培养皿，并在整个培养期间持续使用。在胰腺芽分离和解剖的前一天，用纤连蛋白包被玻璃底微孔。
2. 将无菌纤连蛋白用细胞培养级水稀释至 50 μg/ml 终浓度，并加入其最小体积（约150 μl) 加入 MatTek 培养板的 20 毫米微孔中，覆盖整个玻璃表面（图1E。将培养皿放入 4 °C 冰箱中孵育过夜。
3. 在解剖当天，吸除纤连蛋白，用细胞培养级水清洗微孔，并加入最小体积的 150 μl 添加青霉素/链霉素（1%）、谷氨酰胺（1%）的BME（Basal Medium Eagle）培养基 50 μg/ml 庆大霉素 [解剖培养基]。将包被好的培养皿置于超净工作台中，直至准备接种组织块。

如果未使用全部纤维连接蛋白包被的培养皿，可将其在 4 °C 下保存最多 1 周。切勿让培养皿干燥，应将其充满解剖培养基后置于冰箱中。

讨论

一旦确定胰腺命运，胰腺前体细胞将经历广泛的增殖、分化和形态发生，最终形成一个成熟且具有功能的器官^2,4目前，胰腺分支形成的机制及其与前体细胞增殖和分化的关联在很大程度上尚不清楚。胰腺外植体培养是阐明这些过程的理想体系。 离体^5,9,11结合活细胞成像与 离体 早期胰腺芽外植体可清晰展示胚胎发育过程中胰腺形态发生的各项事件。本文视频展示了一种建立 离体 在玻璃载体上培养的胚胎胰腺组织，非常适合进行整体免疫荧光染色和活体成像。

大量使用实例 离体 用于成像细胞形态、生长和分化的胰腺外植体在此展示。重要的是，这些实例表明，培养的胚胎胰腺 离体 使用本方案模拟早期阶段 在体 胚胎胰腺发育^2,3例如，E11.5 胰腺在接种后约 24 小时开始分支，符合预期 在体 （图2A）。尽管培养物中的形态发生和细胞分化过程与所观察到的相似 体内，外植体的整体生长情况无法与正在发育的胚胎相比较，且.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体： 羧肽酶 E-cadherin F-actin 胰高血糖素 胰岛素 β1-整合素 Pdx1 Pdx1 磷酸化组蛋白 H3	AbD Serotec Invitrogen 分子探针 ImmunoStar Millipore 默克密理博 Abcam 杂交瘤库 细胞信号传导	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
基础伊格尔培养基（BME）	Sigma	B1522-500ML	在无菌条件下保存
细胞培养级水	聚丙烯酸	S15-012	在无菌条件下保存
培养皿（玻璃底），35 毫米	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
驴血清	Chemicon	S30-100 毫升
胎牛血清 Gold	聚丙烯酸	A15-151	在无菌条件下保存
纤连蛋白	Invitrogen	330100-8	储存液：1 mg/ml，溶于细胞培养级水
庆大霉素	Invitrogen	15750-037	在无菌条件下保存
谷氨酰胺	Invitrogen	25030-024	在无菌条件下保存
4孔多孔培养皿	Nunc	176740
显微镜： 倒置共聚焦显微镜（LSM 700） 体视显微镜（Discovery V12）	Zeiss Zeiss		目标： C-Apochromat 10X / 0.45 W M27（工作距离 1.8 mm；成像深度约 100 mm）；C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27（工作距离 0.28 mm；成像深度约 50 mm） μm) 从下方透射照明并从上方进行光纤照明
多聚甲醛	Roth	0335.3	20% 储存液
巴斯德吸管（玻璃），150 mm	VWR	HECH567/1
青霉素/链霉素	聚丙烯酸	P11-010	在无菌条件下保存
培养皿，60 mm	Greiner Bio-One	628102
培养皿，35 mm	Greiner Bio-One	627161
1× PBS，pH 7.4	聚丙烯酸	H15-002	在无菌条件下保存
弹簧剪 8 mm 刀片 弯型	精细科学工具	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
钟表匠镊子 Dumont #5	Roth	K342.1