从化学分层的南极湖泊中建立真核微生物富集培养物并评估其碳固定潜力

摘要

微生物真核生物既是南极常年冰封湖泊中光合作用来源碳的重要生产者，也是顶级捕食性物种。本报告描述了一种富集培养方法，用于从南极博尼湖（Lake Bonney）中分离具有多种代谢能力的微生物真核生物，并利用放射性同位素测定核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）活性的方法评估其无机碳固定潜力。

摘要

邦尼湖是位于南极洲麦克默多干谷地区的众多常年冰封湖泊之一。常年存在的冰盖使水体形成化学性质分层的水柱，且与其他内陆水体不同，它在很大程度上阻止了来自溪流的碳和营养物质的外部输入。生物群面临多种环境胁迫，包括全年严重的营养缺乏、低温、极度遮荫、高盐度，以及冬季持续24小时的黑暗¹。这些极端环境条件使得邦尼湖中的生物群几乎仅限于微生物²。

单细胞微生物真核生物（称为“原生生物”）在全球生物地球化学循环中发挥着重要作用³，并在干谷湖泊碳循环中承担重要的生态功能，在水生食物网中占据初级和三级营养级地位。在干谷湖泊的水生食物网中，能够固定无机碳的原生生物（自养型）是有机碳的主要生产者，为异养生物提供碳源^{4, 2}。能够摄食细菌和更小型原生生物的吞噬型或异养型原生生物则在食物网中充当顶级捕食者⁵。最后，尚不清楚具体比例的一部分原生生物种群具备混合营养代谢能力^{6, 7}。原生生物的混合营养是指其同时具备光合作用能力和吞噬捕食微生物的能力。这种混合营养形式不同于细菌物种中的混合营养代谢，后者通常涉及吸收溶解态的有机碳分子。目前，从永久冰封的极地湖泊中分离得到的原生生物株系极为稀少，针对这一极端环境中原生生物多样性与生态学的研究仍十分有限^{8, 4, 9, 10, 5}。深入理解干谷湖泊这一简单食物网中原生生物的代谢多样性，将有助于建立模型，阐明原生生物在全球碳循环中的作用。

我们采用富集培养法，从邦尼湖中分离潜在的光能自养和混合营养型原生生物。水体采样深度的选择依据包括初级生产力峰值的位置、原生生物的系统发育多样性^{4, 11}，以及影响原生生物营养模式的主要非生物因子的变化情况：浅层采样深度主要受限于营养盐的缺乏，而深层采样深度则受限于光照的可利用性。此外，湖水样品中添加了多种类型的培养基，以促进多种光能自养生物的生长。

RubisCO 催化卡尔文-本森-巴沙姆（CBB）循环中的限速步骤，该循环是自养生物固定无机碳并为水生和陆地食物网中较高营养级提供有机碳的主要途径¹²。在本研究中，我们采用了一种经改良的、适用于过滤样品的放射性同位素测定法¹³，以监测最大羧化酶活性，作为博尼湖富集培养物中碳固定潜力和代谢多样性的替代指标。

方案

1. 样本获取

1. 在采样水柱前一日选择并准备采样点。这将使因钻孔和冰孔融化而受到扰动的水柱分层结构得以重新形成。使用 GPS 确定钻孔位置。
2. 为进入水柱，首先使用连接在 4 英寸 Jiffy 延长钻杆和切削钻头上的 Jiffy 冰钻在冰层上钻孔。为防止钻具在孔中冻结，钻孔时应避免进入液态水层，建议在水柱顶部上方约 4–6 英寸处停止钻进。
3. 在采样前，需将钻孔直径从 15 cm 扩大至 60 cm。此过程通过使用孔洞融化装置（Hotsy 型号）实现，该装置将加热的聚乙二醇在铜管中循环。孔洞融化通常需要长达 18 小时。
4. 在采样水柱前，确保所有所需设备和样品储存容器已在采样点准备就绪。采样材料包括：Niskin 采水器（5–10 L 容量）、带深度校准缆线的绞车、触发器、每个采样深度所需的足够样品瓶，以及用于样品运输的保温箱。
5. 应在当天尽早开始采样（约上午 5 点），因为湖水过滤应在采样当天完成。使用连接在已校准手动绞车上的 Niskin 采样器，从目标深度（本研究中为从冰孔内测压水位起算的 6 m、15 m 和 18 m 深度）采集水样（1–5 L）。为防止扰动水柱，应先采集较浅深度，再采集较深深度。
6. 将湖水样品存放在保温箱中，并通过连接在全地形车（ATV）上的雪橇从采样点运送到野外实验室。样品应在采样后立即于野外实验室进行处理或稳定化（例如：在液氮中快速冷冻）。

2. 富集培养物的建立

1. 为了富集培养物的培养，使用温和过滤（< 0.3 atm）将0.5–1 L湖水浓缩至47 mm、孔径0.45 μm的聚醚砜滤膜上。若需研究自然群落的多样性，另取一份样品过滤至47 mm、孔径0.45 μm的聚醚砜滤膜上，并根据Bielewicz et al. ⁴ 的方案分析真核生物的系统发育多样性。
2. 将滤膜转移至含有约20 mL无菌离心管（50 mL）中，其中湖水为从与滤膜相同采样深度收集并经过滤的水样。使用无菌移液器轻轻冲洗滤膜以洗脱细胞。
3. 将细胞悬液转移至25 cm²无菌细胞培养瓶中。加入从各采样深度收集的过滤湖水，使培养体积增至45 mL。若需在不同培养基上进行富集培养，应为每个采样深度设置多个重复。
4. 向培养瓶中添加50倍浓度的无菌溶液，使其最终浓度为1倍的以下培养基：Bold基础培养基、BG11和F/2。若需培养混合营养型生物，设置两个添加F/2的培养容器，并向其中一个培养瓶中加入2–3粒无菌稻米。
5. 将培养瓶置于温度可控的培养箱中，在低温（4 °C）和低光照强度（20 μmol 光子 m^-2 s^-1）条件下培养至少4周（在运往美国实验室前于南极洲进行）。若需获得纯培养物，可在培养2周后取250 μL富集培养物接种于含适宜培养基的琼脂平板上。
6. 运往美国时，将富集培养物转移至无菌50 mL离心管中。在运输申请中注明“禁止冷冻”和“保持低温”。尽管从南极洲运输的过程相对较快（通过商业航空约需2周）且高度可靠，但在运输过程中仍有可能导致某些苛养生物丢失。因此，建议研究人员在运输前保留一份子样品，以便评估运输过程中特定物种的损失情况。
7. 到达美国后，取5 mL富集培养物转移至125 mL无菌锥形瓶中，瓶内含45 mL适宜的培养基，并用无菌海绵塞封口。富集培养物应在温度可控的环境培养室（Diurnal Growth Chamber, VWR）中以静置培养方式维持，条件为4 °C和20 μmol 光子 m^-2 s^-1。培养物应每隔30天转移至新鲜培养基中一次。

3. 从滤膜富集样品中提取细胞裂解液

1. 使用温和的真空（<10 psi）将5 mL富集培养物过滤至25 mm的Whatman GF/F滤膜上。在测定RubisCO活性之前，滤膜可在-80 °C下保存数周。
2. 用无菌钢制剪刀将滤膜剪成4–5段，并用无菌镊子将片段转移至装有直径为0.1 mm的氧化锆/二氧化硅珠的2 mL螺口管中，珠子填充至管体积的五分之一。
3. 加入1.25 mL滤膜提取缓冲液（50 mM bicine、10 mM MgCl₂、1 mM EDTA、5 mg/mL BSA和0.1% Triton X-100；使用前新鲜添加：10 mM NaHCO₃、10 mM DTT、3.3 mM氨基己酸、0.7 mM苯甲脒，pH 7.8）¹³，使用Minibeadbeater以48号速度设置进行三次、每次30秒的细胞破碎。为防止样品过热，每次珠磨后交替进行1分钟冰上孵育。
4. 将滤膜悬液在4 °C下以3000 × g离心2分钟，形成由GF/F滤膜纤维和细胞壁碎片组成的松散沉淀。
5. 取200 μL等分试样，浸入800 μL预冷的90%丙酮中。在分光光度计上于664 nm和647 nm波长处测定可提取的叶绿素（chl）a¹⁴。将上清液转移至1.5 mL微量离心管中。
6. 将剩余上清液在4 °C下以15,000 × g离心2分钟，并将上清液（避免不溶性细胞膜沉淀和残留的GF/F滤膜纤维）转移至洁净的1.5 mL微量离心管中。此可溶性细胞裂解液现在可用于RubisCO羧化酶活性测定。
7. 在加入12.5%甘油并用液氮速冻后，裂解液可在-80 °C下保存。由于裂解液中酶的敏感性不同，多次冻融循环可能导致活性下降。因此，在大规模制备细胞裂解液之前，应测试新鲜裂解液与冻存裂解液的活性差异。

4. RubisCO 加氧酶活性滤纸检测法

1. 将125 μL可溶性裂解液转移至已预冷在冰上的15 mL螺口微量离心管中（无需盖盖）。对于阴性对照样品，将125 μL可溶性裂解液加入15 mL螺口微量离心管中，但不添加底物（见步骤4.7）。所有样品和阴性对照均需设置重复反应。
2. 新鲜配制10 mL测定缓冲液（50 mM Bicine-NaOH，pH 8.0，50 mM NaHCO₃，25 mM MgCl₂），并在冰上预冷。将足够量的测定缓冲液（每份样品/对照100 μL，另加100 μL余量）分装至5 mL离心管中。后续所有操作均需在通风橱内进行。
3. 向分装好的缓冲液中每毫升加入40 μL NaH¹⁴CO₃（500 μCi/mL），并将缓冲液保持在冰上。
4. 取含¹⁴C的测定缓冲液10 μL，用1 mL测定缓冲液稀释。颠倒混匀后，取100 μL该1:100稀释液加入含3 mL Bio-Safe II闪烁计数液的闪烁瓶中。颠倒混匀。在继续进行测定前，闪烁计数（Beckman LS6500）应超过18,000 cpm。
5. 当测定缓冲液中已加入足量NaH¹⁴CO₃后，将反应管转移至预设为25 °C的干浴中，孵育3–5分钟。
6. 向裂解液中加入100 μL测定缓冲液，在25 °C孵育5分钟。
7. 向样品中加入20 μL 15 mM核酮糖-1,5-二磷酸，使反应在25 °C继续进行5–10分钟。
8. 加入100 μL丙酸（100%）（Fisher）以终止反应。在2,000 × g离心1小时，以去除未掺入的¹⁴C。
9. 将样品的全部体积转移至含有3 mL Bio-Safe II闪烁计数液的闪烁瓶中。通过闪烁计数测定酸稳定终产物的cpm值（B. Witte，R. Tabita 个人交流）。
10. 以叶绿素a为基础计算RubisCO活性速率¹⁴。

5. 代表性结果

我们采用富集培养法分离南极邦尼湖中栖息的嗜冷光合及混合营养型原生生物。为了获得更丰富的生物多样性，我们测试了三种培养基类型：Bold基础培养基（BBM）¹⁵、F/2-Si海水培养基^{16, 17}以及BG11培养基¹⁸。通过光学显微镜对富集培养物进行肉眼观察发现，培养物以光合原生生物为主（多数细胞含有叶绿素色素），其细胞形态多样，具体形态特征取决于接种样品的采样深度以及培养过程中所使用的培养基类型（图1）。

我们测定了RubisCO酶催化的羧化酶活性最大速率，以此作为碳固定潜力的指标。同时监测叶绿素a（Chl a）丰度，以估算光合原生生物的生物量。图 2）。尽管所有培养物均在相同的温度/光照条件下培养（即 4 °C/20 μmol m^-2 s^-1），不同富集培养物之间的碳固定潜力和光合生物量差异显著。在BBM（富集物4和6）或BG11（富集物13和14）培养基中培养的富集物中，RubisCO活性达到最高；而在F/2培养基中富集的培养物（富集物19、21、23）其最大羧化酶活性则低4至34倍。这些差异并非由于F/2培养物的生物量较低所致，因为羧化酶活性是以叶绿素a（Chl a）为基础表示的。此外，RubisCO活性与chl a 浓度（r = -0.023，p>0.1; 图 2，插图）。接种了6 m和15 m湖水的BBM培养物（富集培养4和5）具有最高的叶绿素 a 水平，而所有其他培养物均表现出相对较低的 chl a，无论RubisCO酶活性如何（图 2).

图1. 代表性微生物真核生物富集培养物，用于选择不同生物的生长。培养物的身份信息显示在各图左下角。所有图像均为使用油浸物镜在1000倍放大下获得的光学显微照片。

图 2. 来自邦尼湖并分离自南极微生物真核生物富集培养物的潜在碳固定能力与可提取叶绿素 a 水平，在不同培养基中培养的结果。培养详情见表 1。插图： 南极微生物真核生物富集培养物中叶绿素 a 含量与碳固定潜力之间的皮尔逊相关性。

讨论

近期的分子研究表明，在多种环境中单细胞真核生物具有高度多样性^{3, 19, 20}；然而，由于在原生生物栖息地的全范围内缺乏分离株，这些物种在食物网中的功能角色在很大程度上仍不清楚。在本研究中，我们描述了一种方法，用于从一个采样较少的环境——常年冰封的南极湖泊——富集具有代谢多功能性的微生物真核生物物种。从邦尼湖不同采样深度富集的培养物表现出依赖于培养基的差异性碳固定速率。例如，在F/2培养基中富集的培养物相较于BBM或BG 11培养基表现出较低的碳固定潜力，这可能反映了原生生物多样性和代谢能力的差异。BBM培养基用于选择绿藻类群（或称绿藻门），而我们的培养物似乎为单一绿藻物种的纯培养（图1A, B）。这类生物已知主要依赖光能自养代谢。来自邦尼湖的一个分离株表现出完全的光能自养代谢，严格依赖光作为其唯一的能量来源¹。相比之下，F/2培养基旨在富集广泛的海洋原生生物，包括潜在的混合营养型生物¹²。尽管我们尚未全面探究F/2培养物的多样性，但显微观察清楚显示这些富集培养物包含多种细胞形态的原生生物群落（图1C, D

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BBM	西格玛-奥德里奇	B5282
BG11	西格玛-奥德里奇	C3061
F/2	西格玛-奥德里奇	G9903
GF/F 滤膜，25 mm	费舍尔科技	09-874-64
GF/F 滤膜，47 mm	费舍尔科技	09-874-71
聚醚砜滤膜，0.45 μm 孔径，47 mm	颇尔公司	61854
无菌细胞培养瓶，25 cm2	康宁	430639
昼夜生长培养箱	VWR 国际公司	35960-076
氧化锆/二氧化硅珠，0.1 mm 直径	Biospec 产品公司	11079101z
微型珠磨机	Biospec 产品公司	3110BX
螺口微量离心管（1.5 μL）	USA Scientific 公司	1415-8700
NaH14CO3	ViTrax	VC 194	分装为 400 μL 一份，于 -20°C 保存
RuBP	西格玛-奥德里奇	R0878-100mg	溶于 10 mM Tris-丙酸（pH 6.5）中