从化学分层的南极湖泊中建立真核微生物富集培养物并评估其碳固定潜力

摘要

微生物真核生物既是南极常年冰封湖泊中光合作用来源碳的重要生产者，也是顶级捕食性物种。本报告描述了一种富集培养方法，用于从南极博尼湖（Lake Bonney）中分离具有多种代谢能力的微生物真核生物，并利用放射性同位素测定核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）活性的方法评估其无机碳固定潜力。

摘要

邦尼湖是位于南极洲麦克默多干谷地区的众多常年冰封湖泊之一。常年存在的冰盖使水体形成化学性质分层的水柱，且与其他内陆水体不同，它在很大程度上阻止了来自溪流的碳和营养物质的外部输入。生物群面临多种环境胁迫，包括全年严重的营养缺乏、低温、极度遮荫、高盐度，以及冬季持续24小时的黑暗¹。这些极端环境条件使得邦尼湖中的生物群几乎仅限于微生物²。

单细胞微生物真核生物（称为“原生生物”）在全球生物地球化学循环中发挥着重要作用³，并在干谷湖泊碳循环中承担重要的生态功能，在水生食物网中占据初级和三级营养级地位。在干谷湖泊的水生食物网中，能够固定无机碳的原生生物（自养型）是有机碳的主要生产者，为异养生物提供碳源^{4, 2}。能够摄食细菌和更小型原生生物的吞噬型或异养型原生生物则在食物网中充当顶级捕食者⁵。最后，尚不清楚具体比例的一部分原生生物种群具备混合营养代谢能力^{6, 7}。原生生物的混合营养是指其同时具备光合作用能力和吞噬捕食微生物的能力。这种混合营养形式不同于细菌物种中的混合营养代谢，后者通常涉及吸收溶解态的有机碳分子。目前，从永久冰封的极地湖泊中分离得到的原生生物株系极为稀少，针对这一极端环境中原生生物多样性与生态学的研究仍十分有限^{8, 4, 9, 10, 5}。深入理解干谷湖泊这一简单食物网中原生生物的代谢多样性，将有助于建立模型，阐明原生生物在全球碳循环中的作用。

我们采用富集培养法，从邦尼湖中分离潜在的光能自养和混合营养型原生生物。水体采样深度的选择依据包括初级生产力峰值的位置、原生生物的系统发育多样性^{4, 11}，以及影响原生生物营养模式的主要非生物因子的变化情况：浅层采样深度主要受限于营养盐的缺乏，而深层采样深度则受限于光照的可利用性。此外，湖水样品中添加了多种类型的培养基，以促进多种光能自养生物的生长。

RubisCO 催化卡尔文-本森-巴沙姆（CBB）循环中的限速步骤，该循环是自养生物固定无机碳并为水生和陆地食物网中较高营养级提供有机碳的主要途径¹²。在本研究中，我们采用了一种经改良的、适用于过滤样品的放射性同位素测定法¹³，以监测最大羧化酶活性，作为博尼湖富集培养物中碳固定潜力和代谢多样性的替代指标。

方案

1. 样本获取

1. 在采样水柱前一日选择并准备采样点。这将使因钻孔和冰孔融化而受到扰动的水柱分层结构得以重新形成。使用 GPS 确定钻孔位置。
2. 为进入水柱，首先使用连接在 4 英寸 Jiffy 延长钻杆和切削钻头上的 Jiffy 冰钻在冰层上钻孔。为防止钻具在孔中冻结，钻孔时应避免进入液态水层，建议在水柱顶部上方约 4–6 英寸处停止钻进。
3. 在采样前，需将钻孔直径从 15 cm 扩大至 60 cm。此过程通过使用孔洞融化装置（Hotsy 型号）实现，该装置将加热的聚乙二醇在铜管中循环。孔洞融化通常需要长达 18 小时。
4. 在采样水柱前，确保所有所需设备和样品储存容器已在采样点准备就绪。采样材料包括：Niskin 采水器（5–10 L 容量）、带深度校准缆线的绞车、触发器、每个采样深度所需的足够样品瓶，以及用于样品运输的保温箱。
5. 应在当天尽早开始采样（约上午 5 点），因为湖水过滤应在采样当天完成。使用连接在已校准手动绞车上的 Niskin 采样器，从目标深度（本研究中为从冰孔内测压水位起算的 6 m、15 m 和 18 m 深度）采集水样（1–5 L）。为防止扰动水柱，应先采集较浅深度，再采集较深深度。
6. 将湖水样品存放在保温箱中，并通过连接在全地形车（ATV）上的雪橇从采样点运送到野外实验室。样品应在采样后立即于野外实验室进行处理或稳定化（例如：在液氮中快速冷冻）。

讨论

近期的分子研究表明，在多种环境中单细胞真核生物具有高度多样性^{3, 19, 20}；然而，由于在原生生物栖息地的全范围内缺乏分离株，这些物种在食物网中的功能角色在很大程度上仍不清楚。在本研究中，我们描述了一种方法，用于从一个采样较少的环境——常年冰封的南极湖泊——富集具有代谢多功能性的微生物真核生物物种。从邦尼湖不同采样深度富集的培养物表现出依赖于培养基的差异性碳固定速率。例如，在F/2培养基中富集的培养物相较于BBM或BG 11培养基表现出较低的碳固定潜力，这可能反映了原生生物多样性和代谢能力的差异。BBM培养基用于选择绿藻类群（或称绿藻门），而我们的培养物似乎为单一绿藻物种的纯培养（图1A, B）。这类生物已知主要依赖光能自养代谢。来自邦尼湖的一个分离株表现出完全的光能自养代谢，严格依赖光作为其唯一的能量来源¹。相比之下，F/2培养基旨在富集广泛的海洋原生生物，包括潜在的混合营养型生物¹²。尽管我们尚未全面探究F/2培养物的多样性，但显微观察清楚显示这些富集培养物包含多种细胞形态的原生生物群落（图1C, D

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BBM	西格玛-奥德里奇	B5282
BG11	西格玛-奥德里奇	C3061
F/2	西格玛-奥德里奇	G9903
GF/F 滤膜，25 mm	费舍尔科技	09-874-64
GF/F 滤膜，47 mm	费舍尔科技	09-874-71
聚醚砜滤膜，0.45 μm 孔径，47 mm	颇尔公司	61854
无菌细胞培养瓶，25 cm2	康宁	430639
昼夜生长培养箱	VWR 国际公司	35960-076
氧化锆/二氧化硅珠，0.1 mm 直径	Biospec 产品公司	11079101z
微型珠磨机	Biospec 产品公司	3110BX
螺口微量离心管（1.5 μL）	USA Scientific 公司	1415-8700
NaH14CO3	ViTrax	VC 194	分装为 400 μL 一份，于 -20°C 保存
RuBP	西格玛-奥德里奇	R0878-100mg	溶于 10 mM Tris-丙酸（pH 6.5）中