聚合酶链式反应（PCR）已成为许多分子生物学实验室中常用的技术。本文提供若干常规PCR方案的快速指南。由于每个反应都是一个独特的实验，因此生成产物所需的最适条件各不相同。理解反应中的各种变量将极大提高故障排除的效率，从而增加获得预期结果的可能性。
本文内容
摘要
摘要
在生物科学领域，技术进步推动该学科进入发现的黄金时代。例如，随着安东尼·范·列文虎克（Anton van Leeuwenhoek）发明显微镜，微生物学领域发生了根本性变革，科学家首次得以观察原核生物。聚合酶链式反应（PCR）的发展正是此类改变分子科学进程的重大创新之一，其影响遍及生物学众多分支学科。该反应的理论构想最早由凯佩（Keppe）及其同事于1971年提出；然而，直到14年后的1985年，凯利·穆利斯（Kary Mullis）在塞图斯公司（Cetus Corporation）工作期间才首次完整描述并实验应用了完整的PCR技术。随着从细菌Thermus aquaticus中分离出耐热DNA聚合酶，这一技术得以实现自动化和优化，因此该酶被命名为Taq DNA聚合酶。
聚合酶链式反应（PCR）是一种强大的扩增技术，仅需少量起始材料（即DNA模板或目标序列），即可生成大量特定的DNA片段（即扩增子）。尽管该技术操作简单且通常顺利，但仍存在一些可能导致产生错误结果的陷阱。当PCR失败时，可能会产生多种非特异性DNA产物，其大小不一，在琼脂糖凝胶上表现为梯状或弥散的条带；有时甚至完全不产生任何产物。另一个潜在问题是在扩增子中意外引入突变，导致PCR产物群体具有异质性。除非耐心地进行仔细排查并解决相关问题，否则PCR失败可能令人沮丧。本实验方案概述了PCR的基本原理，提供了一种适用于大多数目标序列扩增的方法，并提出了反应优化的策略。通过遵循本PCR指南，学生应能够：
● 设置常规PCR实验的反应体系和热循环条件
● 理解各种反应组分的功能及其对PCR实验的整体影响
● 针对任意DNA模板设计并优化PCR实验
● 对失败的PCR实验进行故障排查
方案
1. 设计引物
设计合适的引物对于PCR实验的成功至关重要。在针对特定DNA区域设计引物时，其中一个引物应与正链（即通常所称的5' → 3'方向，也称为有义链或非模板链）互补结合，而另一个引物则应与负链（即3' → 5'方向，也称为反义链或模板链）互补结合。引物设计过程中常出现以下几类问题：1）引物自身退火，导致形成发夹环等二级结构（图1a）；2）引物之间相互退火而非与DNA模板结合，从而形成引物二聚体（图1b）；3）两个引物的熔解温度（Tm）差异过大，使得难以选择一个合适的退火温度，以保证在热循环过程中两个引物均能高效地结合到目标序列上（图1c）（有关Tm的更多信息，请参见“熔解温度（Tm）的计算”和“循环条件的调整”部分）。
- 以下是在设计引物时应考虑的一系列特征。
- 引物长度应为15-30个核苷酸残基（碱基）。
- 最佳G-C含量应在40-60%之间。
- 引物的3'端应包含G或C，以稳定引物结合并防止末端“呼吸”现象，从而提高引物效率。DNA“呼吸”是指引物末端未能保持退火状态而发生松动或分离。GC碱基对之间的三个氢键有助于防止“呼吸”现象，同时也会提高引物的熔解温度。
- 一对引物（包括正链引物和负链引物）的3'端不应彼此互补，且单个引物的3'端也不能与其他引物序列中的部分区域互补。这两种情况分别会导致引物二聚体和发夹环结构的形成。
- 引物的最佳熔解温度（Tm）范围为52-58 °C，尽管该范围可扩展至45-65 °C。一对引物之间的最终Tm差异不应超过5 °C。
- 应避免使用二核苷酸重复序列（例如GCGCGCGCGC或ATATATATAT）或单碱基连续序列（例如AAAAA或CCCCC），因为它们可能导致引物在DNA模板上滑动，或形成发夹环结构。如果因DNA模板本身的特性而无法避免，则最多只能包含长度不超过4个碱基的重复序列或单碱基连续序列。
注意事项：
- 有许多计算机程序可用于辅助设计引物对。推荐使用 NCBI 引物设计工具 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 和 Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ 进行此项工作。
- 为避免扩增相关的假基因或同源序列，可在 NCBI 上运行 BLAST 以验证引物的靶标特异性。
2. 材料与试剂
- 进行 PCR 实验前，充分准备至关重要。佩戴手套以避免污染反应体系或试剂。实验中应包含阴性对照，若条件允许，还应设置阳性对照。
- 将 PCR 实验所需的所有试剂置于新装的冰桶中，待其完全解冻后再开始配制反应体系（图 2）。整个实验过程中应始终保持试剂处于冰上。
- 标准 PCR 试剂包括针对目标基因或待扩增 DNA 片段设计的一对特异性引物、DNA 聚合酶、适用于该 DNA 聚合酶的缓冲液、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、DNA 模板以及无菌水。
- 其他可能添加的试剂包括镁盐 Mg2+（终浓度为 0.5 至 5.0 mM）、钾盐 K+（终浓度为 35 至 100 mM）、二甲基亚砜（DMSO；终浓度为 1–10%）、甲酰胺（终浓度为 1.25–10%）、牛血清白蛋白（终浓度为 10–100 μg/ml）以及甜菜碱（终浓度为 0.5 M 至 2.5 M）。这些添加剂的使用将在故障排除部分进一步讨论。
- 在实验台上合理摆放实验仪器和设备。
- 所需材料包括 PCR 管及管盖、PCR 管架、耐乙醇标记笔、一套可分别移取 1–10 μl（P10）、2–20 μl（P20）、20–200 μl（P200）和 200–1000 μl（P1000）的微量移液器，以及一台热循环仪。
- 若同时进行多个使用相同试剂的 PCR 实验，可将各反应所需试剂按比例放大后混合配制成总反应体系（主混合液，Master Mix）。此步骤可在无菌的 1.8 ml 微量离心管中进行（见备注）。
- 为分析 PCR 实验所得扩增产物，需准备琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备。为估算 PCR 产物的大小，还需使用合适的商业化分子量标准品。
3. 反应混合物的配制
- 首先制作一个表格，列出将要加入反应混合物中的试剂（参见 表1).
- 接下来，使用耐乙醇标记笔标记PCR管。
- 反应体系的体积将根据储备试剂的浓度而变化。一个典型的50 μl反应体系的终浓度（CF）如下。
- X缓冲液（通常由DNA聚合酶生产商提供；可能含有15 mM MgCl₂）2加入 5 μl 10X 缓冲液至每个反应。
- 200 μM dNTP（每种四种核苷酸各50 μM）。每个反应加入1 μl 10 mM dNTP（dATP、dCTP、dTTP和dGTP浓度均为2.5 mM）。
- 1.5 mM Mg2+仅在10X缓冲液中不含或根据PCR优化需要时添加。例如，为获得4.0 mM Mg2+ 为获得最佳扩增效果，针对未表征的分枝杆菌噬菌体中一段保守的566 bp DNA片段，需添加8 μl的25 mM MgCl₂2 加入反应体系（图3).
- 每种引物 20 至 50 pmol。加入 1 μl 的每种 20 μM 引物。
- 加入104 至 107 分子（或约1至1000纳克）DNA模板。加入0.5微升浓度为2纳克/微升的基因组分枝杆菌噬菌体DNA。
- 每50 μl反应体系中加入0.5至2.5单位的DNA聚合酶（参见生产商说明书）。例如，加入0.5 μl的Sigma DNA聚合酶（0.5 Units/μl） Taq DNA聚合酶
- 加入无菌去离子水至每反应终体积为 50 μl，具体加样量参见试剂配制表（Q.S. 为拉丁文缩写 quantum satis，意为“所需量”）。因此，每反应需加入 33 μl 水以补足至 50 μl。但需注意，水虽最后加入，但必须首先制定试剂配制表，并确定反应中其他所有试剂的加入体积。
4. 基本PCR实验方案
- 将一个96孔板放入装有冰的冰桶中，用作0.2 ml薄壁PCR管的支架。将PCR试剂加入冰冷的0.2 ml薄壁PCR管中，有助于防止核酸酶活性和非特异性引物结合。
- 按照以下顺序，用移液器将下列PCR试剂加入一个0.2 ml薄壁PCR管中（图4）：无菌水、10X PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、引物和模板DNA（见表1）。由于实验至少应包含一个阴性对照，可能还需要阳性对照，因此建议在1.8 ml微量离心管中配制总反应混合液（Master Mix）（参见注释中的说明）。
- 在另一个0.2 ml薄壁PCR管中（图4），加入除模板DNA以外的所有试剂作为阴性对照（增加无菌水体积以补偿缺失的模板体积）。此外，若试剂允许，还应设置一个阳性对照反应，使用已知在相同条件下可扩增的模板DNA和/或引物。
- Taq DNA聚合酶通常保存在50%甘油溶液中，为了使其在反应体系中充分分散，需通过反复吹打至少20次来轻柔混匀PCR试剂。混匀时，移液器应设定为总反应混合液体积的一半左右，并注意避免产生气泡。
- 盖紧0.2 ml薄壁PCR管的管盖，并将其放入热循环仪中（图5）。待热循环仪盖子牢固关闭后，启动程序（见表2）。
- 程序结束后，可取出0.2 ml薄壁PCR管并置于4 °C保存。通过将各反应体系的等分试样加入琼脂糖凝胶的加样孔中，经电泳后用溴化乙锭染色，即可检测PCR产物。若存在PCR扩增产物，溴化乙锭会嵌入DNA双链的碱基之间，在紫外灯下可观察到清晰条带。
注意事项：
- 在设置多个 PCR 实验时，建议配制所有反应共用的试剂混合液（即主混合液，Master Mix）。通常该混合液包含 DNA 聚合酶溶液、dNTPs、反应缓冲液和水，配制于 1.8 ml 微量离心管中。加入主混合液中的每种试剂的量应等于总反应数加 10%，并向上取整至最接近的整数反应数。例如，若有 10 × 0.1 = 1 个反应，则 (10 + 1) × 5 μl 10X 缓冲液等于主混合液中需加入 55 μl 的 10X 缓冲液。主混合液中的试剂通过移液器枪头轻柔地反复吹打约 20 次，使其充分混匀（如上所述）。每个 PCR 管中加入一份主混合液，随后再加入 DNA 模板、所需引物及其他实验特异性试剂（见 表 1 和表 7）。
- 以下网站提供用于计算模板 DNA 拷贝数的计算器（http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html）。双链 DNA 的总拷贝数可通过以下公式计算：
DNA 拷贝数 = (DNA 量 (ng) × 6.022×1023) / (DNA 长度 × 1×109 ng/ml × 650 道尔顿)
计算 DNA 拷贝数可用于确定每个反应所需的模板量。 - 假阳性结果可能由其他 PCR 反应的残留污染引起，在电泳后的琼脂糖凝胶上表现为多个非预期条带。因此，应采用规范操作技术，并设置阴性对照（在可能的情况下同时设置阳性对照）。
- 尽管溴化乙锭是最常用的核酸染料，但已有多种更安全、毒性更低的替代品。以下网站介绍了包括亚甲蓝、结晶紫、SYBR Safe 和 Gel Red 在内的多种替代染料，并提供了使用方法及产物检测方式的说明（http://bitesizebio.com/articles/ethidium-bromide-the-alternatives/）。
- 尽管大多数现代 PCR 仪使用 0.2 ml 管，但某些型号可能需要使用 0.5 ml 管。请查阅您的热循环仪说明书以确定适用的管型。
5. 计算熔解温度（Tm）
- 了解引物的熔解温度（Tm）对于成功进行PCR实验至关重要。尽管目前有多种Tm计算器可供使用，但需要注意的是，由于缺乏针对特定反应的详细信息以及Tm计算器算法本身所作的假设，这些计算结果仅是对实际Tm的估算。然而，相较于传统的计算方法 Tm ≈ 4(G-C) + 2(A-T)，更推荐使用基于最近邻热力学模型的计算方法。前者因考虑了相邻碱基对的堆积能，可提供更准确的Tm估算值；而后者因计算简单、可快速手算，使用更为广泛。有关不同PCR条件和添加剂如何影响熔解温度的详细信息，请参见“故障排除”部分。
推荐使用以下任一计算器，通过最近邻热力学模型计算Tm值：
http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/
http://www.cnr.berkeley.edu/~zimmer/oligoTMcalc.html
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
http://www.finnzymes.com/tm_determination.html
http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms::melting
6. 设置热循环条件
- PCR热循环仪可快速加热和冷却反应混合物，从而实现双链DNA的热变性（链分离）、引物与DNA模板正负链的退火，以及PCR产物的延伸。循环时间根据模板大小和DNA的GC含量计算。通用程序通常以初始变性步骤开始，温度范围为94 °C至98 °C，具体取决于DNA聚合酶活性的最适温度以及模板DNA的G-C含量。典型的反应通常在94 °C下进行一分钟的初始变性。若时间超过3分钟，可能会使DNA聚合酶失活，破坏其酶活性。一种称为“热启动PCR”的方法将初始变性时间显著延长至3分钟以上，最长可达9分钟。在热启动PCR中，DNA聚合酶是在初始延长的变性步骤完成后才加入的。这种对实验方案的修改可避免DNA聚合酶可能发生的失活。有关热启动PCR及其他替代方法的更多信息，请参见本实验方案的“问题排查”部分。
- 下一步是设置热循环仪，启动25至35轮的三步温度循环（表2）。虽然将循环次数增加到35轮以上可产生更多的PCR产物，但过多的循环常会导致非特异性副产物的富集。单个循环中的三个温度步骤分别完成三项任务：第一步使模板DNA（在后续循环中还包括扩增子）变性，第二步实现引物的最佳退火，第三步允许DNA聚合酶结合到DNA模板并合成PCR产物。每个步骤的持续时间和温度可根据需要进行调整，以优化目标扩增子的产量。
变性步骤的时间应尽可能缩短。通常，大多数DNA模板只需10至60秒即可完成变性。变性时间和温度可能因模板DNA的G-C含量以及热循环仪的升降温速率（ramp rate，即热循环仪从一个温度转换到下一个温度所需的时间）而有所不同。该步骤的温度通常与初始变性阶段所用温度相同（如上文步骤#1，例如94 °C）。
在循环中，退火步骤通常持续30秒，温度设定为比引物的表观Tm低约5 °C（理想范围为52 °C至58 °C）。
循环以延伸步骤结束。延伸温度取决于实验所选用的DNA聚合酶。例如，Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度为70 °C至80 °C，每延伸前2 kb需要1分钟，之后每额外扩增1 kb需增加1分钟。Pfu DNA聚合酶是另一种具有高热稳定性的酶，其最佳延伸温度为75 °C。Pfu DNA聚合酶适用于需要高保真度的PCR和引物延伸反应，每扩增1 kb需要2分钟。有关每种特定DNA聚合酶的精确延伸温度和延伸时间，请参考制造商的推荐说明。 - 热循环的最后阶段包含一个5分钟或更长时间的延伸步骤。此最终步骤可使大量未完成的扩增子完成合成；对于Taq DNA聚合酶而言，还可在其所有PCR产物的3'末端添加一个腺苷酸残基。该修饰由Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性介导，适用于后续需要3'-突出端的分子克隆操作。
- 反应终止可通过将混合物冷却至4 °C和/或加入EDTA至终浓度10 mM来实现。
7. PCR 故障排除时的重要注意事项
如果标准PCR条件未能扩增出目标产物，则需要对PCR进行优化以获得更好的结果。可通过调节影响扩增产物谱型的变量（如试剂浓度、循环条件）来改变反应的严谨性，从而调整特异性。例如，若反应严谨性不足，则会产生大量长度不一的非特异性扩增产物；若反应过于严谨，则无法产生任何产物。PCR反应的故障排查有时可能令人沮丧，但通过仔细分析并充分理解PCR实验中所用试剂的性质，可减少获得理想结果所需的时间和重复次数。在所有影响PCR严谨性的因素中，滴定Mg2+浓度和/或调整退火温度很可能可解决大多数问题。然而，在进行任何调整之前，务必确认异常结果并非由人为操作失误所致。首先应确认所有试剂均已加入反应体系，并排除试剂污染的可能性。同时应记录异常结果，并思考以下问题：电泳后凝胶上是否可见引物二聚体（这些为迁移至泳道底部附近的小片段条带，<100 bp）？是否存在非特异性产物（迁移位置与目标产物大小不同的条带）？是否完全没有扩增产物？目标DNA是位于质粒上还是基因组DNA提取物中？此外，分析目标扩增片段的G-C含量也是明智之举。
- 首先确定PCR试剂中是否有对反应具有严重不利影响的成分。可通过配制新的试剂（例如新鲜的工作液、新稀释的溶液），然后依次将每种新试剂逐一加入反应体系中来实现排查。该过程可确定导致PCR实验失败的具体试剂。对于非常陈旧的DNA，其常积累抑制物，已有研究表明添加牛血清白蛋白可能有助于缓解该问题。
- 当引物优先发生自身退火或相互退火时，可能形成引物二聚体。若发生此情况，琼脂糖凝胶上会出现小于100 bp的小片段产物。可首先调整模板与引物的比例；若引物浓度远高于模板浓度，则引物更倾向于彼此退火而非与DNA模板结合。添加DMSO或采用热启动热循环方法可能解决该问题。最终可能需要重新设计引物。
- 当PCR严谨性过低时，会产生非特异性产物，表现为长度不一的非特异性PCR条带，在琼脂糖凝胶上呈现梯状条带（ladder effect）。此时建议选择可提高严谨性的PCR条件。当扩增基因组DNA时，若引物设计针对高度重复序列，也可能产生不同大小片段的弥散条带（smear）。然而，相同的引物在扩增质粒上的靶序列时可能不会出现该问题。
- 缺乏PCR产物可能是由于反应条件过于严谨所致。引物自身或变性后的模板DNA形成的引物二聚体和发夹环结构也可能阻碍PCR产物的扩增，因为这些分子可能无法再与目标DNA序列进行碱基配对。
- 若尚未分析G-C含量，此时应进行分析。扩增G-C富集区域（GC含量 >60%）是PCR中最具挑战性的问题之一。然而，已有多种添加剂被用于缓解此类挑战。
8. 操作 PCR 试剂
在首次决定如何最佳调整常规PCR反应条件以获得目标产物时，理解所用试剂的功能至关重要。成功可能仅仅依赖于改变MgCl2、KCl、dNTPs、引物、模板DNA或DNA聚合酶的浓度。然而，这些试剂浓度过高或过低可能导致非特异性结果，降低反应的严谨性。在进行PCR问题排查时，应每次仅调整一种试剂，但建议对该试剂进行梯度浓度优化。
- 镁盐 Mg2+ （终反应浓度为 0.5 至 5.0 mM）
耐热DNA聚合酶在反应过程中需要镁作为辅因子。改变镁离子浓度是最容易操作且可能对PCR严谨性影响最大的试剂调节手段之一。通常情况下，随着Mg²⁺浓度的增加，PCR产物的产量也会提高2+。然而，Mg浓度的增加2+ 也会降低DNA聚合酶的特异性和保真度。大多数制造商都会提供氯化镁（MgCl₂）溶液2）以及DNA聚合酶和10× PCR缓冲液。10× PCR缓冲液中可能含有15 mM MgCl₂2，这已足够用于典型的PCR反应，或者可根据特定反应优化的浓度单独添加。Mg2+ 实际上并未在反应中被消耗，但反应若无其存在则无法进行。当 Mg 过量时2+，可能会通过稳定双链结构而阻碍DNA模板的完全变性。过多的Mg2+ 还能稳定引物与错误模板位点的非特异性结合，降低特异性，导致产生不需要的PCR产物。当Mg不足时2+反应将无法进行，导致无PCR产物生成。 - 钾盐 K+ （终反应浓度为 35 至 100 mM）
较长的PCR产物（10至40 kb）可通过降低氯化钾（KCl）浓度至低于常规的50 mM反应浓度而获益，通常还需联合添加DMSO和/或甘油。若目标扩增片段小于1000 bp且出现较长的非特异性产物，可通过滴定KCl提高特异性，以10 mM为增量逐步提高浓度至最高100 mM。提高盐浓度可使较短的DNA分子相较于较长的DNA分子更优先变性。 - 脱氧核苷5'-三磷酸（每种终反应浓度分别为20和200 μM）
脱氧核苷酸5'-三磷酸（dNTPs）如果浓度不相等（即[A] = [T] = [C] = [G]）或因反复冻融导致不稳定，可能会对PCR造成问题。通常每种dNTP的浓度为50 μM。然而，PCR可耐受每种dNTP浓度在20至200 μM之间的范围。较低的dNTP浓度可能提高反应的特异性和保真度，而过高的dNTP浓度反而可能抑制PCR。但对于较长的PCR扩增片段，可能需要更高的dNTP浓度。dNTP浓度的显著变化可能需要相应调整Mg²⁺的浓度。2+. - 热稳定DNA聚合酶
自最初以来，与PCR酶相关的酶和缓冲液已取得了长足发展 Taq 首先使用了DNA聚合酶。因此，选择合适的酶有助于获得目标扩增产物。例如，使用 Taq 如果需要更高的过程性或在PCR产物的3'端添加腺嘌呤残基，则可能优先选择DNA聚合酶而非Pfu DNA聚合酶。在3'端添加腺嘌呤已成为将PCR产物克隆至具有3'胸腺嘧啶突出端的TA载体的有效策略。然而，若保真度更为重要，则Pfu等酶可能是更佳选择。多家厂商提供多种专用于特定需求的DNA聚合酶。请仔细分析目标扩增子的反应条件及其特性，并据此为PCR实验选择合适的DNA聚合酶。大多数厂商提供的表格均列出了各类DNA聚合酶的特性，如保真度、产量、反应速度、最佳扩增长度、是否适用于高G-C含量模板扩增或热启动PCR，有助于聚合酶的筛选与选择。 - 模板DNA
DNA 质量和纯度将显著影响 PCR 实验成功的可能性。DNA 和 RNA 浓度可通过其在 260 nm 处的光密度（OD）测量值来确定260）。溶液中纯化核酸的质量按双链DNA为50 μg/ml，或RNA及单链DNA为40 μg/ml，在OD260 1.0. DNA 提取过程中的污染物是 PCR 常见的抑制剂，应谨慎避免。常见的 DNA 提取 PCR 抑制剂包括蛋白质、RNA、有机溶剂和去污剂。利用核酸的最大吸收波长 OD260 与蛋白质的OD280（OD260/280)，可以估算提取的DNA纯度。理想情况下，OD比值260/280 在1.8到2.0之间。较低的OD260/280 表明存在蛋白质和/或溶剂污染，这极有可能对PCR造成影响。
除了模板DNA的质量外，优化DNA的用量也可能极大地影响PCR实验的结果。尽管以ng/μl为单位进行定量较为方便（这通常是现代纳米分光光度计的输出结果），但对于成功的PCR实验而言，相关单位应为分子数量，即：有多少拷贝的DNA模板含有与PCR引物互补的序列？最佳的目标分子数量范围为104 至 107 分子的计算方法如上文注释所述。
9. 添加试剂
当其他方法均无效时，添加试剂可能取得理想结果。了解各种试剂及其用途，对于确定哪种试剂在获得目标PCR产物过程中最为有效至关重要。由于调整一种试剂可能会影响另一种试剂的可用浓度，因此向反应体系中添加试剂的过程较为复杂。除下述试剂外，许多生物技术公司还提供商业化的 proprietary 添加剂。
10. 有利于G-C丰富模板的添加剂
- 二甲基亚砜（DMSO，终反应浓度为 1–10%）
在模板 DNA 富含 G-C 碱基（GC 含量 >60%）的 PCR 实验中，添加 DMSO 可通过破坏碱基配对、有效降低 Tm 值来增强反应。一些 Tm 计算工具包含用于输入 PCR 实验中所需 DMSO 浓度的变量选项。然而，当 DMSO 浓度超过 2% 时，可能需要增加 DNA 聚合酶的用量，因为高浓度 DMSO 已被证明会抑制 Taq DNA 聚合酶活性。 - 甲酰胺（终反应浓度为 1.25–10%）
与 DMSO 类似，甲酰胺也可破坏碱基配对，同时提高引物退火的严谨性，从而减少非特异性结合并提高扩增效率。甲酰胺还被证实对富含 G-C 的模板具有增强作用。 - 7-脱氮-2'-脱氧鸟苷-5'-三磷酸（终反应浓度为 dc7GTP；3 份 dc7GTP : 1 份 dGTP，共 50 μM）
在反应中使用 3 份（即 37.5 μM）鸟苷类似物 dc7GTP 与 1 份（即 12.5 μM）dGTP，可破坏扩增产物中二级结构的形成。当扩增子或模板 DNA 变性时，常会形成发夹环等二级结构。将 dc7GTP 掺入 DNA 扩增子中，可阻止这些异常结构的形成。
注意：
dc7GTP 会减弱溴化乙锭染色的信号，因此它与 dGTP 以 3:1 的比例使用。
- 甜菜碱（终反应浓度为 0.5 M 至 2.5 M）
甜菜碱（N,N,N-三甲基甘氨酸）是一种两性离子型氨基酸类似物，可降低甚至消除DNA熔解温度对核苷酸组成的依赖性。它常作为添加剂用于辅助扩增富含G-C序列的PCR目标片段。甜菜碱通常与DMSO联合使用，可显著提高扩增高G-C含量目标DNA的成功率。
11. 在存在抑制剂的情况下有助于 PCR 的添加剂
- 非离子型去污剂可抑制二级结构的形成，并有助于稳定DNA聚合酶。在扩增反应中可使用浓度为0.1%至1%的非离子型去污剂（如Triton X-100、Tween 20或NP-40），以提高扩增产物的产量。然而，浓度超过1%时可能对PCR产生抑制作用。非离子型去污剂的存在会降低PCR的严谨性，可能导致非特异性产物的生成。但它们的使用也可中和SDS（某些DNA提取方案中常见的污染物）的抑制作用。
- 添加特定蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）（使用浓度为400 ng/μl）和/或T4基因32蛋白（使用浓度为150 ng/μl），可在存在FeCl3、血红素、腐殖酸、胡敏酸、单宁酸或粪便、淡水及海水提取物等抑制物的情况下促进PCR反应。然而，某些PCR抑制物（包括胆盐、胆红素、EDTA、NaCl、SDS或Triton X-100）无法通过添加BSA或T4基因32蛋白得以缓解。
12. 循环条件的修改
- 优化退火温度可提高任何PCR反应的效率，应结合其他添加剂或其他循环条件的修改一并考虑。因此，为计算最佳退火温度，需采用以下公式：
TaOPT = 0.3 Tm引物 + 0.7 Tm产品 -14.9
Tm引物 的计算方法为 Tm 使用以下公式计算较不稳定配对的
Tm引物 = ((ΔH/(ΔS + R × ln(c/4))) - 273.15 + 16.6 log[K+] 其中，ΔH 是杂交体最近邻焓变的总和；ΔS 是最近邻熵变的总和；R 为气体常数（1.99 cal K⁻¹ mol⁻¹）；C 为引物浓度；[K+] 是钾离子浓度。
后一个方程可使用其中一个 Tm 以下网站列出的计算器：
http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/melting/sup_mat/servers_list.html
Tm产品 计算方法如下：
Tm产品 = 0.41(%G-C) + 16.6 log [K+] - 675 产物长度
对于大多数PCR反应，钾离子（[K+]) 将为 50 mM。 - 热启动PCR是一种多功能的改良方法，其中初始变性时间被显著延长（表4）。该修饰可单独使用，也可与其他循环条件的修改结合使用。此外，它常与添加剂联用，以改善难以扩增的片段的生成。事实上，热启动PCR正日益成为常规循环条件的组成部分。研究表明，热启动能够提高扩增产物的产量，同时增强反应的特异性和保真度。热启动PCR的原理在于消除在低于引物退火温度下配制反应体系时可能产生的引物二聚体及非特异性引物结合m因此，典型的热启动反应会将样品加热至高于最适T的温度m，至少达到60°C后才能开始任何扩增反应。通常情况下，在初始变性阶段的延长期间，DNA聚合酶被排除在反应体系之外。尽管有时也可选择性地省略反应中的其他组分而非DNA聚合酶，但本文将重点讨论DNA聚合酶。目前有多种方法可使DNA聚合酶在初始变性阶段结束前保持失活状态或物理隔离，包括使用固态石蜡屏障、抗DNA聚合酶抗体以及辅助蛋白等。此外，也可在初始变性循环完成后，再将DNA聚合酶加入反应体系。
- 降落PCR（TD-PCR）旨在减少对退火温度（Tm 通过限定计算出的退火温度范围来克服计算局限性。该方法的理念是设计两个阶段的循环条件（表5）。第一阶段采用每两个循环降低一次退火温度的方法（传统上每次降低1.0 °C），起始温度高于计算所得Tm 或略低。第二阶段采用标准的三步法程序，退火温度设定为低于计算所得Tm值5 °C。m 再进行20到25个循环。第一阶段的功能应减轻错误引物结合，使正确产物获得4倍的优势。因此，经过10个循环后，正确产物相对于任何非特异性引物结合将获得4^10倍（即4096倍）的优势。
- 降落PCR（Stepdown PCR）与梯度递减PCR（TD-PCR）类似，但在初始引物结合阶段的温度递减步数较少。例如，第一阶段每两个循环降低退火温度3 °C，起始温度比计算所得Tm值高10 °C，终止于比Tm值低2 °C。m与TD-PCR类似，第二阶段采用标准的三步法程序，退火温度设定为比计算得到的Tm值低5 °Cm 再进行20到25个循环。这将使正确产物相对于错误引物结合产物具有256倍的优势。
- 慢速PCR只是温度递减PCR的一种改良方法，已成功用于扩增极高G-C含量（超过83%）的序列。表6）。该概念考虑了现代热循环仪的一个相对较新的特性，即可调节升降温速率以及冷却速度。该方案还利用了直流7GTP 以减少可能抑制反应的二级结构形成。降温速率降低至 2.5 °C/s-1 冷却速率为1.5 °C/s-1 用于退火循环。第一阶段从70 °C退火温度开始，每3轮降低1 °C，直至达到58 °C。第二阶段随后在58 °C退火温度下继续进行额外15个循环。
- 巢式PCR是一种用于消除非特异性扩增产物的有力工具。当单个基因组中存在多个旁系同源基因，或在异质性的直系同源序列群体中目标序列拷贝数较低时，使用巢式引物尤为有效。该方法的基本流程包括两对引物，用于扩增DNA的同一区域。第一对外侧引物跨越目标片段区域，经过20至30个循环扩增后通常产生非特异性PCR产物。随后，取第一次50 μl反应体系中的少量等分样本（通常约为5 μl），作为模板DNA，利用第二对位于内侧区域的引物进行另一次20至30轮的扩增，第二对引物的结合位点位于第一对引物结合区域的内部。
其他PCR方案更为专业，已超出本文范围。例如RACE-PCR、多重PCR（Multiplex-PCR）、载体PCR（Vectorette-PCR）、定量PCR（Quantitative-PCR）和逆转录PCR（RT-PCR）。
13. 代表性结果
通过遵循上述基本PCR方案，获得了具有代表性的PCR结果。这些结果结合了多种故障排除策略，用以展示不同试剂和反应条件对PCR反应的影响。实验中扩增了出芽酵母Saccharomyces cerevisiae以及一种未表征的分枝杆菌噬菌体的基因。以下描述的三个实验均采用了表2中列出的标准三步PCR方案。
在设置 PCR 实验之前，对 S. cerevisiae 和分枝杆菌噬菌体的基因组 DNA 进行了定量，并稀释至每反应含有 104 到 107 个 DNA 分子的浓度。工作储备液的制备方法如下：酵母基因组 DNA 制备物的浓度为 104 ng/μl。通过将 48 μl 样品加入 452 μl 的 TE pH 8.0 缓冲液中，将其稀释至 10 ng/μl。由于 S. cerevisiae 基因组大小约为 12.5 Mb，因此 10 ng DNA 含有 7.41 × 105 个分子。分枝杆菌噬菌体基因组 DNA 制备物的浓度为 313 ng/μl。通过将 6.4 μl 样品加入 993.6 μl 的 TE pH 8.0 缓冲液中，将其稀释至 2 ng/μl。该噬菌体 DNA 大小约为 67 Kb，因此 1 ng 含有 2.73 × 107 个分子，处于 PCR 实验通常使用的 DNA 用量上限。随后使用这些工作储备液制备 表 7 中列出的主混合溶液。实验的循环条件根据下文所述进行调整。
在图3a中，以S. cerevisiae的基因组DNA为模板，扩增编码参与半乳糖代谢蛋白的GAL3基因。本实验的目的是确定该组试剂的最佳Mg2+浓度。原始PCR缓冲液中不含MgCl2，需按所示浓度补充，测试范围为0.0 mM至5.0 mM。如图所示，从Mg2+浓度为2.5 mM（第6泳道）开始出现预期大小（2098 bp）的PCR产物，最佳浓度为4.0 mM（第9泳道）。制造商推荐的浓度为1.5 mM，这也是典型PCR缓冲液中所含的量。或许令人意外的是，本实验中产物生成所需的浓度超过了该推荐值。
在图3b所示实验中使用了不同的DNA模板。采用分枝杆菌噬菌体的基因组DNA来扩增一段保守的566 bp DNA片段。与之前的实验类似，需要确定最佳的Mg2+浓度。如图3b所示，目标PCR产物的扩增至少需要2.0 mM Mg2+（第5泳道）。尽管随着MgCl2浓度的增加，产物量存在较大波动，但在4 mM Mg2+时观察到的PCR产物最多（第9泳道），这与酵母GAL3基因所需的最佳浓度相同。
请注意，在图3A和3B所示的实验中，根据引物退火温度确定的最优循环条件下，获得了清晰的单一条带。具体而言，变性温度为95 °C，退火温度为61 °C，延伸在72 °C下进行1分钟，共30个循环。最后在72 °C下进行5分钟的最终延伸。对于图3C所示的第三次实验，对用于扩增酵母GAL3基因的循环条件进行了三项修改：首先，将退火温度降低至次优温度58 °C；其次，将延伸时间延长至1分30秒；第三，将循环次数从30次增加至35次。其目的是展示次优扩增条件（即降低反应严谨性）对PCR实验的影响。如图3C所示，在图3A中原本清晰的单一条带，在这些次优循环条件下变成了非特异性产物的弥散条带。此外，随着反应整体严谨性的降低，形成扩增产物所需的Mg2+浓度也相应减少。
三项实验均表明，当 Mg2+ 浓度过低时，无法产生扩增产物。这些结果还证明，当循环条件设计正确且试剂浓度处于最佳水平时，PCR 实验可产生与预期大小相符的清晰扩增片段。结果凸显了在足够高的严谨性条件下进行 PCR 实验的重要性（例如，产生清晰条带而非弥散条带）。此外，实验表明，改变一个参数可能会影响另一个参数，从而影响反应结果。
| 试剂 | 贮存液浓度 | 体积 | 13X ** 主混合液 | 终浓度 |
| 无菌 H2O | 加至 50 μl | 加至 650 μl | ||
| PCR 缓冲液 | 10X | 5 μl | 65 μl | 1X |
| dNTPs | 10 mM | 1 μl | 13 μl | 200 μM |
| MgCl2 | 25 mM | 3 μl | 39 μl | 1.5 mM |
| 正向引物 | 20 μM = 20 pmol/μl | 1 μl | 13 μl | 20 pmol |
| 反向引物 | 20 μM = 20 pmol/μl | 1 μl | 13 μl | 20 pmol |
| 模板 DNA | 可变 | 可变 | 可变 | ~105 个分子 |
| Taq DNA 聚合酶 | 5 单位/μl* | 0.5 μl | 6.5 μl | 2.5 单位 |
| 50 μl/反应 |
表1. PCR试剂的添加顺序。
*不同制造商的单位可能有所不同
** 将所有无需滴定或反应中可能变化的试剂加入主混合液。上表所示主混合液的用量按11个反应计，另加2个额外反应量，以补偿移液过程中的损耗，确保有足够的液体分装至每个反应管中。
| 标准三步PCR循环 | |||
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环次数 |
| 初始变性 | 94 °C 至 98 °C | 1分钟 | 1 |
| 变性 退火 延伸 | 94 °C Tm 以下 5 °C 70 °C 至 80 °C | 10 至 60 秒 30 秒 依赖扩增片段和DNA聚合酶 | 25-35 |
| 最终延伸 | 70 °C 至 80 °C | 5分钟 | 1 |
| 保存* | 4 °C | ∞ | 1 |
表2. 标准三步PCR扩增循环。
* 大多数热循环仪在循环结束后能够无限期地在 4°C 条件下暂停。
| 两步法 PCR 循环 | |||
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环次数 |
| 初始变性 | 94 °C 至 98 °C | 1 分钟 | 1 |
| 变性 退火/延伸 | 94 °C 70 °C 至 80 °C | 10 至 60 秒 取决于扩增片段和DNA聚合酶 | 25-35 |
| 最终延伸 | 70 °C 至 80 °C | 5 分钟 | 1 |
表 3. 两步 PCR 扩增程序。
| 热启动 PCR 循环 | |||
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 初始变性 | 60 °C 至 95 °C | 5 分钟，然后加入 DNA 聚合酶 | 1 |
| 变性 退火 延伸 | 94 °C 比 Tm 低 5 °C 70 °C 至 80 °C | 10 至 60 秒 30 秒 依赖扩增片段和 DNA 聚合酶 | 25–35 |
| 最终延伸 | 70 °C 至 80 °C | 5 分钟 | 1 |
表4. 热启动PCR循环。
| 降落式 PCR 循环程序 | |||
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环次数 |
| 初始变性 | 94 °C 至 98 °C | 1 分钟 | 1 |
| 变性 退火 延伸 | 94 °C X = Tm + 10 °C 70 °C 至 80 °C | 10 至 60 秒 30 秒 依赖扩增片段和 DNA 聚合酶 | 2 |
| 变性 退火 延伸 | 94 °C X-1 °C，每隔一个循环降低 1 °C 70 °C 至 80 °C | 10 至 60 秒 30 秒 依赖扩增片段和聚合酶 | 28 |
| 变性 退火 延伸 | 94 °C Tm - 5 °C 70 °C 至 80 °C | 10 至 60 秒 30 秒 依赖扩增片段和 DNA 聚合酶 | 20-25 |
| 最终延伸 | 70 °C 至 80 °C | 5 分钟 | 1 |
表5. 降落PCR循环程序。
| 减缓 PCR 循环 | |||
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环次数 |
| 初始变性 | 94 °C 至 98 °C | 1 分钟 | 1 |
| 变性 退火 延伸 | 94 °C X °C = 比 Tm 高 10 °C 70 °C 至 80 °C | 10 至 60 秒 30 秒 依赖扩增子和聚合酶 | 2 |
| 变性 退火 延伸 | 94 °C X-1 °C 每隔一个循环降低 1 °C 70 °C 至 80 °C* | 10 至 60 秒 30 秒 依赖扩增子和聚合酶 | 28 |
| 变性 退火 延伸 | 94 °C 比 Tm 低 5 °C 70 °C 至 80 °C | 10 至 60 秒 30 秒 依赖扩增子和聚合酶 | 20-25 |
| 最终延伸 | 70 °C 至 80 °C | 5 分钟 | 1 |
表6. 减缓PCR循环。
*对于慢速PCR，退火循环的升降温速率降低至2.5 °C s-1，冷却速率为1.5 °C s-1。
| 储存液 | 加入 50 μl 反应体系的体积 | 13 X 酵母 主混合液 | 13 X 噬菌体 主混合液 | 终浓度 | |||||||
| 无菌 H2O | 补至 50 μl = 31 μl 或 30.5 | 补至 650 μl = 396.5 | 补至 520 μl = 403 μl | ||||||||
| PCR 缓冲液 | 10X | 5 μl | 65 μl | 65 μl | 1X | ||||||
| dNTPs | 10 mM | 1 μl | 13 μl | 13 μl | 200 μM | ||||||
| MgCl2 | 梯度优化 | 加入每个反应 | 加入每个反应 | 加入每个反应 | 可变，见梯度优化 | ||||||
| 正向引物 | 20 μM = 20 pmol/μl | 1 μl | 13 μl | 13 μl | 20 pmol | ||||||
| 反向引物 | 20 μM = 20 pmol/μl | 1 μl | 13 μl | 13 μl | 20 pmol | ||||||
| 模板 DNA | 2 ng/μl 噬菌体 或 10 ng/μl 酵母 | 0.5 μl 噬菌体 或 1 μl 酵母 | 6.5 μl | 13 μl | ~107 分子 噬菌体 或 ~105 分子 酵母 | ||||||
| 聚合酶 | 0.5 单位/μl** | 0.5 μl | 6.5 μl | 6.5 μl | 0.5 单位/反应 | ||||||
| 40 μl + 10(梯度优化) μl/ 反应 | |||||||||||
| 梯度优化 | |||||||||||
| [MgCl2] | 0.00 mM | 0.5 mM | 1.0 mM | 1.5mM | 2.0 mM | 2.5 mM | 3.0 mM | 3.5 mM | 4.0 mM | 4.5 mM | 5.0 mM |
| MgCl2 | 0.00 μl | 1.00 μl | 2.00 μl | 3.0 μl | 4.00 μl | 5.00 μl | 6.00 μl | 7.00 μl | 8.00 μl | 9.00 μl | 10.00 μl |
| H2O | 10.00 μl | 9.00 μl | 8.00 μl | 7.00 μl | 6.00 μl | 5.00 μl | 4.00 μl | 3.00 μl | 2.00 μl | 1.00 μl | 0.00 μl |
表7. 用于图3的 Mg2+ 滴定。
图1. 引物设计及三步PCR扩增目标DNA过程中常见的问题。（a）引物自身退火，导致形成发夹状二级结构。需注意，引物并不总是在最末端退火，可能形成较小的环状结构。（b）引物之间相互退火而非与DNA模板结合，从而形成引物二聚体。一旦引物彼此退火，DNA聚合酶将从引物末端开始延伸。（c）PCR循环生成特异性扩增产物（amplicon）。标准的三步PCR循环包括模板DNA的变性、引物退火以及DNA聚合酶介导的目标DNA（扩增子）延伸。
图 2. 用于 PCR 的冰桶、移液器及所需试剂架。(1.) P-200 移液器，(2.) P-1000 移液器，(3.) P-20 移液器，(4.) P-10 移液器，(5.) 96 孔板和 0.2 ml 薄壁 PCR 管，(6.) 试剂，包括 Taq 聚合酶、10X PCR 缓冲液、MgCl2、无菌水、dNTPs、引物和模板 DNA，(7.) 1.8 ml 离心管及管架。
图3. 使用标准三步PCR程序优化PCR实验时，Mg2+滴定示例。（a）以S. cerevisiae酵母基因组DNA为模板扩增一段2098 bp的GAL3基因。在1–6泳道中，由于Mg2+浓度过低，未产生扩增产物（1–5泳道）或仅产生极少量产物（6泳道）。7–11泳道显示出该PCR实验中Mg2+的最佳浓度，表现为出现2098 bp的目标扩增片段。（b）使用一种未表征的分枝杆菌噬菌体基因组DNA为模板扩增一段566 bp的扩增子。1–4泳道中Mg2+浓度过低，无扩增产物生成。5–11泳道显示出该PCR反应中Mg2+的最佳浓度，表现为出现566 bp的扩增产物。（c）使用S. cerevisiae酵母基因组DNA为模板扩增2098 bp的GAL3基因（如a图所示），但退火温度从61 °C降低至58 °C，导致出现长度不一的非特异性PCR条带，在琼脂糖凝胶上呈现拖尾现象。1–4泳道中Mg2+浓度过低，无产物生成。5–8泳道中Mg2+浓度处于最佳范围，表现为在2098 bp扩增子大小附近出现拖尾和条带。9–11泳道表明反应条件过于严格，无产物生成。（a–c）12泳道为阴性对照，不含任何模板DNA。M泳道（marker）加入NEB 1kb Ladder。
图4. 用于PCR的无菌管。(1.) 1.8 ml管，(2.) 0.2 ml单个薄壁PCR管，(3.) 0.2 ml薄壁PCR条管及管盖。
图5. 热循环仪。左图为关闭状态的热循环仪。右图显示0.2 ml薄壁PCR管放置在打开状态的热循环仪加热块中。
讨论
聚合酶链式反应（PCR）已成为生物科学研究工具中不可或缺的一部分。PCR 改变了科学的发展进程，使生物学家能够操控基因组，构建具有新功能的杂合基因，实现特异且准确的临床检测，深入理解基因组与多样性，以及简单地克隆基因以进行后续的生物化学分析。PCR 的应用范围仅受限于使用其技术的科学家的想象力。已有大量书籍和论文描述了 PCR 的新型专门用途，而在下一代生物科学研究中还将开发出更多应用。然而，无论预期采用何种方法，其基本框架始终未变。PCR 无论形式如何，本质上都是一种在体外（in vitro）扩增特定 DNA 片段以获得大量拷贝的技术。
设计 PCR 实验需要周密的思考与耐心。图 3 所示结果体现了在设计 PCR 优化策略时面临的主要挑战之一：当改变 PCR 的一个参数时，可能会影响其他参数。例如，若初始 PCR 在次优的退火温度（58°C）下进行，尽管 Mg2+ 浓度处于最佳的 2.0 mM，结果仍会产生如图 3c 所示的弥散条带。为消除弥散条带，可能尝试设置包含 2.0 mM MgCl2 的 PCR 体系，并将退火温度调整至 61°C。然而，如图 3a 所示，这将导致无任何扩增产物生成。因此，在排查非特异性结果时，建议对试剂进行梯度滴定，而不是仅在单个反应中加入某一固定浓度。此外，优化 PCR 实验最常需要的调整是改变 Mg2+ 浓度和校正退火温度。然而，如果这些调整仍无法减少或消除异常结果，则可尝试对添加剂进行滴定，和/或如表 2-6 所述改变循环条件方案，以缓解问题。如果所有方法均无效，则需重新设计引物，并再次尝试、反复尝试。
致谢
特别感谢加州大学洛杉矶分校的Kris Reddi协助准备试剂和灌胶，感谢加州大学洛杉矶分校的Erin Sanders在本研究中的启发、指导与支持，并对稿件进行了校对。同时感谢Giancarlo Costaguta和Gregory S. Payne提供用于扩增GAL3基因的酵母基因组DNA及引物。还感谢Bhairav Shah拍摄了用于制作图2至图4的实验仪器和试剂照片。本项目经费由霍华德·休斯医学研究所（HHMI）提供（HHMI资助号：52006944）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Taq 聚合酶 | Sigma-Aldrich | D4545-25UN | |
| dNTPs | Qiagen | 201225 | |
| 0.2 ml 薄壁管 PCR 管 | Bio-Rad | 223-9469 | |
| 0.2 ml 薄壁管管盖 | Bio-Rad | 223-9472 | |
| EDTA 二钠盐二水合物 | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Trizma-HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| 定制噬菌体引物 | Invitrogen | 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG | |
| 定制噬菌体引物 | Invitrogen | 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT | |
| 定制酵母引物 | Integrated DNA Technologies | SacI-Gal3(-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG | |
| 定制酵母引物 | Integrated DNA Technologies | Gal3(1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG | |
| PCR 扩增仪 | Bio-Rad | 170-9703 | My Cycler |
| 琼脂糖 | ISC BioExpress | E-3120-500 | |
| 凝胶电泳装置 | Hoeffer Scientific Instruments | Model HE33 | |
| 1 kb DNA 标准分子量标记 | New England Biolabs | N3232S | |
| Bio-Rad 电源装置 | Bio-Rad | 164-5050 | PowerPac Basic |
| 凝胶成像系统 | Fotodyne Incorporated | FOTO/Analyst Investigator FX Workstation |
参考文献
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