荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）方法被开发用于通过荧光显微镜直观检测病毒基因组RNA。该方法通过制备特异性针对病毒RNA的探针，再结合杂交与免疫荧光技术进行识别。该技术的优势在于能够确定病毒RNA或DNA在稳态条件下的定位，从而提供有关细胞内病毒转运过程调控的信息。
本文内容
摘要
摘要
感染细胞的病毒会引发细胞正常功能的特异性改变，从而将能量和资源转向病毒复制所需。病毒通常通过表达病毒基因产物来招募宿主细胞的蛋白质和分子机器，进而劫持宿主细胞的多种功能。此外，病毒还会构建特定的膜性细胞器，或附着于可移动的囊泡及马达蛋白，以靶向细胞内的特定区域（在 从头合成 感染过程中，病毒会劫持分子马达蛋白以靶向细胞核；随后在病毒组装阶段，它们会进一步利用宿主细胞的多种机制来促进病毒颗粒的组装。目前对病毒（尤其是RNA病毒）如何协调其蛋白质与RNA组分在细胞内的运输，以及如何在细胞特定区域完成具有感染性病毒颗粒的组装，仍了解有限。RNA定位的研究始于早期工作，低等真核生物胚胎及神经元细胞的发育为RNA定位在基因表达级联调控中的重要性提供了关键生物学信息。在其他生物体和细胞系统中的研究也获得了类似的重要发现。病毒是专性寄生体，必须依赖宿主细胞进行复制。因此，深入理解RNA病毒如何将其RNA基因组从细胞核经核孔转运至细胞质，并最终定位到子代病毒颗粒中的过程至关重要。 1.
荧光原位杂交（FISH）是一种用于鉴定病毒RNA稳态定位变化的有用工具。当与免疫荧光（IF）分析22相结合时，FISH/IF共分析可提供病毒RNA与蛋白质共定位的信息3。因此，该分析为通过其他生物化学或生物物理实验检测RNA-蛋白质相互作用提供了一个良好的起点4,5，因为仅凭共定位本身尚不足以确证存在相互作用。在利用此类方法研究病毒RNA定位的过程中，已获得了大量关于病毒和细胞RNA转运过程的信息6。例如，HIV-1在感染细胞的细胞核内产生RNA，但该RNA仅在细胞质中被翻译。当缺失一个关键的病毒蛋白（Rev）时7，对病毒RNA的FISH分析揭示出病毒复制受阻的原因在于HIV-1基因组RNA在细胞核内的滞留8。
此处，我们介绍一种对病毒基因组RNA进行可视化分析的方法 原位该方法利用一条带有标记的RNA探针。该探针设计为与病毒基因组RNA互补。在杂交过程中， 体外 合成反义RNA探针时，将用地高辛（DIG）修饰的核糖核苷酸加入反应体系中 体外 转录反应。一旦探针与细胞中的靶mRNA杂交，随后的抗体标记步骤（图1) 在进行FISH/IF时，将揭示目标mRNA及蛋白质的定位。
方案
1. 探针制备
- 消化 1 μg 的 体外 转录载体，pKS(+)pol 236nt 9 使用 Kpn1 酶在 37 °C 孵育1小时，将线性化的DNA产物在琼脂糖凝胶上电泳。该片段长度应约为2500 bp。
- 从凝胶中切下目标片段，并使用 Roche Micro Elute 凝胶回收试剂盒进行纯化（所用全部试剂均列于 表1）。在最终洗脱中执行 30 μl 洗脱缓冲液。运行 5 μl 在琼脂糖凝胶上对产物进行电泳，以验证纯化效果。
- 混合 体外 使用罗氏 DIG RNA 标记试剂盒进行转录反应（见下文配方），并在 37 °C 2小时。
体外转录反应：
| 线性化DNA | 23 μl |
| 1X DIG RNA标记混合液 (Roche) | 4 μl |
| 1X 转录缓冲液 | 8 μl |
| 20U RNase OUT | 1 μl |
| 80U T7 RNA聚合酶 | 4 μl |
| 总量 | 40 μl |
- 加入 228 U 的 DNase I，在 37 °C 下孵育 15 分钟。
- 加入 EDTA（pH 8.0）至终浓度为 20 mM，以终止反应。
- 按照制造商说明，使用罗氏（Roche）的 Quick Spin Columns 对反应产物进行纯化。
- 通过沉淀法纯化探针：加入 1/10 体积经 DEPC 处理的 3 M NaOAc（pH 5.2）和 2.5 体积冰浴的 95% 乙醇，混匀后在 -80 °C 下孵育 30 分钟至过夜。
- 在 4 °C、15,000 × g 条件下离心 15 分钟，收集探针沉淀。
- 弃去上清液，用冰浴的 70% 乙醇洗涤沉淀，随后在 4 °C、15,000 × g 条件下再次离心 5 分钟。
- 弃去上清液，干燥沉淀，并将沉淀重悬于 50 μl 无 DNase/RNase 的水中，水中含 10 U Invitrogen RNase OUT。
- 通过分光光度法测定探针浓度（在 260 nm 处测定 RNA 吸光度），并稀释至 5 ng/μl。短期使用可分装后于 -20 °C 保存，长期储存则应置于 -80 °C。建议保留一份分装样品用于不同实验间的比较分析。
2. 细胞固定
- 首先，需将贴壁细胞接种于未经处理的无菌玻璃盖玻片上，使收获时的汇合度约为 70–80%。对于非贴壁细胞，按常规方法培养，待收集时，将其与经 0.01% w/v 多聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich, Inc.）处理 1 小时的盖玻片共同孵育。对于典型的 12 孔聚苯乙烯组织培养板（3.8 cm2），通常在转染前 24 小时接种 150,000 个细胞（例如 HeLa）。非贴壁细胞可按常规方法进行感染或转染，待其贴附于玻璃盖玻片后，再进行固定 3。
- 弃去培养基，用双蒸水配制的 1X 磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞 1 分钟。也可使用经焦碳酸二乙酯（DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.）处理的 1X PBS，但不可使用未经处理的 PBS，因其可能含有 RNase 酶。
- 弃去 PBS，加入 4% 多聚甲醛，用量以完全覆盖细胞为宜。孵育 15–20 分钟。
- 弃去多聚甲醛，用 1X DPBS 洗涤细胞 1 分钟。
- 弃去 DPBS，加入 0.1 M 甘氨酸（溶于 1X DPBS）。孵育 10 分钟。
- 弃去甘氨酸，用 1X DPBS 洗涤细胞 1 分钟。
- 弃去 DPBS，加入 0.2% Triton-X（溶于 1X DPBS）。孵育 5–10 分钟。若用于检测核仁或核膜蛋白，Triton X-100 的通透时间不得超过 5 分钟，否则蛋白定位将变得弥散。
- 弃去 Triton X-100，用 1X DPBS 洗涤一次，持续 1 分钟。
- 如需长期保存，可用 70% 乙醇替换 PBS，并在 4 °C 下保存不超过四个月。或者，再用 1X DPBS 洗涤一次，直接进行 FISH 实验。
3. 荧光 in situ 杂交（FISH）
- 如果盖玻片保存在乙醇中，需将乙醇替换为1X DPBS，并让细胞在其中复水30分钟。若将盖玻片置于4 °C保存，复水过程可过夜进行。
- 用1X DPBS清洗盖玻片1分钟。
- 准备用于孵育盖玻片的载玻片，注意将其清洁并清晰标记。
- 对于18 mm的盖玻片，向载玻片上加入50 μl DNase溶液（每张盖玻片25单位，市售产品）。将盖玻片轻轻放置于溶液上，确保细胞面朝下，于室温孵育15分钟。
- 用1X DPBS清洗盖玻片1分钟。
- 每张盖玻片加入50 μl杂交混合液（见下方配方），将盖玻片细胞面朝下置于载玻片上，在42 °C孵育16–18小时。孵育应在盛有50%甲酰胺、2X SSPE混合液的托盘中进行（12.5 ml去离子甲酰胺，2.5 ml 20X SSPE，10 ml水）。
杂交混合液（每张盖玻片50 μl）：
| 储存液用量 | 材料（终浓度） |
| 25 μl | 甲酰胺，50%（去离子；任意来源） |
| 5 μl (10 mg/ml 溶液) | tRNA，1 mg/ml（Sigma-Aldrich, Inc） |
| 5 μl (20X 溶液) | SSPE，2X |
| 5 μl (50X 溶液) | Denhardt's，5X |
| 0.125 μl (5 units 溶液) | RNase OUT |
| 5 μl (5 ng/μl 溶液中含 25 ng) | 探针 |
| 5 μl | DEPC 处理水 H2O，用于将终体积调至 50 μl |
- 将盖玻片细胞面向下放入50 μl 50%甲酰胺（用1X DPBS稀释）中，在42 °C下孵育15分钟。
- 用2X SSPE洗涤盖玻片两次：每次将盖玻片细胞面向下放入50 μl 2X SSPE（将20X SSPE用1X DPBS稀释）中，在42 °C下孵育5分钟。
- 将盖玻片在1X DPBS中洗涤1分钟。
4. 免疫荧光染色
- 将盖玻片细胞面向下置于50 μl 1X Roche封闭液（用1X DPBS稀释的10X Roche封闭液）中，封闭30分钟。
- 将盖玻片细胞面向下置于50 μl一抗溶液中，在37 °C孵育1小时。Anti-DIG抗体应按照生产商说明书用1X封闭液稀释。若同时使用其他抗体对蛋白质进行染色，可在适当浓度下添加这些抗体，前提是所用所有抗体来源于不同宿主物种。
- 用1X DPBS洗涤盖玻片10分钟。
- 将盖玻片细胞面向下置于50 μl二抗溶液中，在37 °C孵育1小时。可使用Alexa Fluor标记的二抗（Invitrogen），以产生多种荧光颜色，使用时按1:500比例溶于1X封闭液和1X DPBS中。
- 用1X DPBS洗涤盖玻片两次，每次10分钟。
- 将盖玻片细胞面向上干燥于Whatman滤纸上。务必遮盖盖玻片以避免光照导致荧光淬灭。
- 待所有液体完全蒸发后，使用8 μl ImmunoMount（Thermo Scientific, Inc.）将盖玻片封固于新鲜载玻片上。轻轻按压盖玻片以排除气泡。
- 在盖玻片边缘涂抹指甲油以固定其位置。
- 通过显微镜技术对RNA和蛋白质进行可视化观察对该实验的成功至关重要。所用显微镜的设置可能促进或阻碍观察效果，因此关键在于正确设置显微镜参数，并在同一批实验的不同样本之间保持一致。有关详细的显微镜设置、光学系统及抗体组合信息，请参见参考文献1,10。
5. 代表性结果
HIV-1病毒RNA染色的一个示例如图2所示。病毒RNA在细胞质中广泛分布，大部分呈弥散状，尽管也常见少量细胞质内的点状聚集。通过比较显示荧光的阳性细胞与周围无荧光信号的细胞，可验证染色的特异性。如引言中所述，缺乏调控蛋白Rev的HIV-1所产生的RNA会滞留在细胞核内：这在细胞核中表现为明亮的信号，而在细胞质中则无RNA荧光信号。细胞内蛋白的过表达也可改变HIV-1病毒RNA的分布。在图2中，过表达参与内体囊泡运输的蛋白（例如Rab7相互作用溶酶体蛋白（RILP）11或N端缺失的RILP（RILPN）11），以及干扰驱动蛋白（dynein）功能的蛋白（如p50/dynamitin1,12），会干扰病毒基因组RNA在稳态下的正常定位，该结果由FISH分析确定。RILP的表达导致病毒基因组RNA重定位至微管组织中心（MTOC）13；RILPN因无法与驱动蛋白复合物中的p150Glued结合，导致晚期内体在细胞质中弥散14；而p50/dynamitin则阻断驱动蛋白的大亚基，促使晚期内体、病毒基因组RNA以及HIV-1结构蛋白释放至细胞周边区域1（图2）。调控病毒基因组RNA在稳态下的定位——这一影响病毒颗粒感染性的关键因素——对于最终开发治疗手段至关重要。据我们观察，病毒RNA在转染和感染后3小时即可在细胞内出现10，至12小时时即可通过本FISH技术清晰观察到。
图1. FISH/IF共分析实验方案流程图。 细胞在盖玻片上培养后，用多聚甲醛固定。在进行FISH/IF实验或储存于70%乙醇之前，细胞需经过甘氨酸和Triton-X处理。用于储存而脱水的细胞在继续进行FISH/IF前，需用1X DPBS（DEPC处理的PBS）重新水化。细胞经DNase I处理后，与探针在4°C下过夜杂交。杂交完成后，依次使用甲酰胺、SSPE缓冲液洗涤细胞，最后用1X DPBS冲洗。随后向细胞加入封闭液，并孵育一抗。洗涤后加入二抗。最后用1X DPBS洗涤两次，完成染色流程。之后将盖玻片干燥并封片，用于成像。
图2. FISH/IF共分析的代表性结果。 A) 将HIV-1转染至HeLa细胞中，部分情况下同时转染导致细胞蛋白过表达的构建体（RILP、p50/Dynamitin以及RILPΔN（一种氨基端缺失突变体））。通过FISH/IF共分析检测：RNA以绿色显示，G3BP或LAMP1以红色显示，用于区分不同信号。B) 在HeLa细胞中表达HIV-1，并在不同时间点收集样本。病毒RNA以绿色追踪，而细胞蛋白hnRNP A1以红色染色。标尺为10 μm。图像经修改自参考文献1（A部分部分图；RILP、p50/Dynamitin和RILP deltaN）和17（B部分）。
讨论
FISH/IF 共分析是一种用于在细胞中可视化病毒RNA的可靠方法，目前该方法已得到优化 9,15,16。经过数年的研究，我们开发出一种改进的RNA染色方法。只要探针针对目标RNA具有特异性，该技术可适用于多种细胞类型17。通过使用DIG标记探针，我们能够通过简单的染色步骤实现RNA的可视化。当RNA染色与其他蛋白质染色相结合时，FISH/IF共分析便成为观察细胞结构以及蛋白质与RNA定位的有力工具。
RNA检测的特异性非常高，这一点在图2中得到了说明。在早期一些专注于病毒基因组RNA定位的研究中，FISH技术证实，Rev蛋白的缺失会导致病毒RNA滞留在细胞核内18。自此之后，利用本文所述技术已获得了大量关于病毒基因组RNA定位的新信息。通过过表达特定的细胞蛋白，可以迫使特定亚群（而非全部）的病毒RNA定位于细胞的不同区域。例如，RILP的过表达会导致RNA明显聚集于微管组织中心（MTOC），这一表型与在HIV-1表达细胞中通过siRNA耗竭hnRNP A2所获得的表型相似13。通过抑制负端马达蛋白dynein的功能，可将病毒基因组RNA推向细胞外周：过表达p50/Dynamitin或敲低dynein重链1，均可导致病毒基因组RNA从细胞内结构域释放至细胞边缘（图2）。RILP的一个突变体RILPΔN无法再结合dynein马达蛋白，导致内体（由LAMP1标记）在细胞质中弥散分布，因为它们不再被主动运输并定位于核周区域。这些结果提示，HIV-1基因组RNA具有可塑性，并且特别表明，存在不同亚群的HIV-1基因组RNA，它们在病毒复制周期中有时具有可识别的功能。这一观点此前已在该mRNA所编码的Gag蛋白中得到证实19。
FISH/IF 共分析的应用存在一些局限性，这些局限性与抗体的选择和可获得性相关。优化最佳的一抗和二抗组合及其浓度需要花费时间进行摸索（参见表1和表2）。由杂交瘤制备或由主要公司生产的抗体，其浓度可能在1:2至1:2000之间广泛变化，但为获得最佳结果，务必遵循生产商提供的使用说明。还必须考虑抗体的宿主来源。应避免在一抗和二抗中混用绵羊和山羊来源的抗体，因为这种组合会导致较高的背景信号，原因是存在交叉物种识别（数据未显示）。对于Alexa Fluor标记的二抗，几乎所有抗体均可使用1:500的浓度。本报告所述FISH/IF共分析的另一局限性在于，该方法仅能捕获细胞经多聚甲醛和去垢剂固定与通透处理后，RNA在稳态下的定位情况（图1）。
然而，活细胞中的RNA成像已通过多种方法实现20-22，其中大多数方法使用带有荧光蛋白（如GFP）标记的病毒RNA基因组变体。然而，仍不断有新的方法被开发出来用于识别活细胞中RNA的定位。这些新方法包括利用Spinach23、SNAP24或MTRIP2对RNA进行标记。这些技术也存在一些局限性，例如需要在添加底物前对细胞进行通透化处理，或必须对mRNA进行工程化修饰以实现显微镜下的检测。事实上，本报告中所述FISH分析的主要优势在于其无需对内源RNA进行任何修饰，从而获得最具生理相关性的结果。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢实验室过去和现在的成员对本文所述方法开发所做出的贡献，并感谢 Alan Cochrane 提供的建议。L.A. 获得了加拿大卫生研究院（CIHR）博士奖学金资助，AJM 获得了 Fraser、Monat 和 MacPherson 职业奖的支持。本研究工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）资助项目（项目编号 #MOP-56974）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 mm 盖玻片 | VWR 国际公司 | 48380 046 | |
| 16% 甲醛 | Polysciences, Inc. | 18814 | 用1× DPBS稀释至4%（质量/体积） |
| Triton-X | OmniPur，EMD Millipore | 9400 | |
| Micro Elute 胶回收试剂盒 | 罗氏集团 | D6294-02 | |
| DIG RNA标记混合物 | 罗氏集团 | 11277073910 | |
| T7 RNA聚合酶转录 | Invitrogen | 18033-019 | |
| 快速旋转柱 | 罗氏集团 | 11814427001 | |
| DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
| 1X DPBS | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 14190-250 | |
| 甲酰胺 | EMD Millipore | FX0420-8 | |
| tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
| RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| 用于DIG检测的荧光抗体增强试剂盒 #4（封闭液） | 罗氏集团 | 1768506 | |
| Alexa Fluor 二抗 | Invitrogen | 见表2 | |
| 杂交炉 | Boekel Scientific | Model 24100 | |
| 显微载片 | VWR 国际公司 | 48300-047 | |
| ImmunoMount | 赛默飞世尔科技公司 | 9990402 | |
| <强>表1. 特异性试剂与设备的鉴定 | |||
| <表格 边框="1"> | |||
| <强>抗DIG抗体的物种（稀释比例；公司，目录号） | <强>颜色 | <强>Alexa Fluor（1:500） | |
| 小鼠（1:500；Sigma，B7405） | 绿色 | Alexa Fluor 488 驴抗小鼠（Invitrogen，A21202） | |
| 红色 | Alexa Fluor 594 驴抗小鼠抗体（Invitrogen，A21203） | ||
| 蓝色 | Alexa Fluor 647 驴抗小鼠抗体（Invitrogen，A31571） | ||
| 绵羊（1:200；Roche，11376623） | 绿色 | Alexa Fluor 488 驴抗羊抗体（Invitrogen，A11015） | |
| 红色 | Alexa Fluor 594 驴抗羊抗体（Invitrogen，A11016） | ||
| 蓝色 | Alexa Fluor 647 驴抗羊抗体（Invitrogen，A21448） |
参考文献
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