我们介绍一种简单且低成本的技术，利用聚乙烯吸液移液管将高浓度的荧光染料和钙敏感染料引入神经元或任何神经纤维束中。
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摘要
摘要
逆行标记神经元是一种标准的解剖学方法1,2，也已被用于将钙离子和电压敏感性染料导入神经元3-6。通常，这些染料以固体晶体形式应用，或通过玻璃移液管进行局部加压注射。然而，当染料扩散需要数小时时，这种方法可能导致染料稀释和标记强度降低。本文我们展示了一种简单且低成本的技术，使用充满染料溶液的聚乙烯吸液移液管将荧光染料和离子敏感性染料导入神经元。该方法可在整个染料加载过程中持续保持染料与轴突接触的高浓度，具有良好的可靠性。
方案
荧光葡聚糖已被用作解剖学工具以及神经元活动成像1-4菲尔兹等人 al., (2009)4 发表了一种将离子和电压敏感性染料应用于轴突束的实验方案，重点以脊髓作为模型系统。本文中，我们描述了一种更为详细的程序，用于将荧光染料和/或离子敏感性染料施加于脊髓的切断腹根、背根或任何神经束 体外 光生理学与形态学研究。
1. I 型和 II 型移液管
首先，将两段较短的聚乙烯导管（PE90，Clay Adams 品牌）在酒精灯火焰上加热拉制，制成具有锥形尖端的移液管7。其中一根移液管（I 型）应较短（3–7 mm），尖端细小，可紧密固定目标根或通路（外径：0.2–0.4 mm；内径：0.1–0.3 mm）。然后拉制第二根移液管（II 型），其杆部更长（8–12 cm）、更细，尖端极细（外径：0.2–0.3 mm；内径：0.1–0.2 mm），可插入至 I 型移液管的尖端。第二根较细的移液管将用于从 I 型移液管中抽吸并注入人工脑脊液（aCSF）和染料溶液。
2. I 型移液管的放置
解剖并分离脊髓8,9，将其置于灌流有冷aCSF（约16 °C）的浴槽中，整个加载过程中持续灌流。将I型移液管放置在电极夹持器（H1/12电极夹持器，Narishige）上，使其后端开口可通过一段柔性管（PharMed BPT，Cole-Parmer，#AY242002；10 cm）轻松连接至注射器（1 ml U-100胰岛素注射器，Becton Dickinson或同类产品）（图1A-B）。
3. 染料应用
- 使用注射器，首先将 aCSF 吸入 I 型移液管（图 1B；2A），然后吸入待填充的轴突束或神经根（图 2B）。随后应从后端开口处移除柔性导管。将 II 型移液管连接至另一支注射器，并插入已装载轴突束或神经根的 I 型移液管中。使用连接 II 型移液管的注射器抽吸 aCSF，使残留的 aCSF 刚好覆盖轴突束（图 1C；2C-D）。然后将 II 型移液管从 I 型移液管中撤出。监测 aCSF 液面数分钟，以确认轴突束或神经的密封良好（参见“故障排除”部分第 3 节中的“良好密封”说明）。
- 将染料溶解于 aCSF 或含 0.2% Triton X-100 的双蒸水中，小心避免产生气泡，将溶液吸入 II 型移液管。将含有染料的 II 型移液管插入 I 型移液管，并进入残留的 aCSF 溶液中（图 2E）。通过轻微的正压缓慢将染料释放至 aCSF 中（图 2F）。注意避免引入气泡，或导致目标组织从移液管尖端移位。在释放足够量的染料后（3–5 μL 染料溶液），撤出 II 型移液管。
4. 孵育
根据实验类型，将组织在避光条件下孵育6至20小时。待充分填充后，轻柔地将电极从组织上移开，使组织处于可用于成像或组织学分析的状态。
故障排除
- 如果目标组织难以进入 I 型移液管尖端，或进入后松动，则说明尖端直径不合适。若发生此情况，应重新拉制并使用另一根移液管。
- 在将染料加入 I 型移液管的 aCSF 前，需确保管内留有足够量的 aCSF，以便 II 型移液管尖端能够触及（图 2D）。否则，加入染料后会形成气隙。若发生此情况，不应添加染料，而应将轴突束从移液管中取出，再重新吸入并确保含有足够量的 aCSF，以便 II 型移液管能够触及。
- 若在用 II 型移液管吸液后，I 型移液管中的 aCSF 液面升高，表明组织密封性不佳。此时应更换电极，否则在标记过程中染料会被稀释。
- 若在注射染料时有气泡进入 I 型移液管，可通过将 II 型移液管尖端靠近气泡，并使用连接的注射器施加轻微负压，将气泡排出。
5. 代表性结果
为了说明该方法的应用，我们同时使用三种不同的葡聚糖偶联荧光染料对运动神经元、感觉传入纤维和脊髓中间神经元进行标记（图3A）。如图3B所示，三类神经元被标记出来：感觉传入纤维（红色）、投射至腹侧索的中间神经元（绿色）和运动神经元（蓝色）。
图 1. 移液管 Type-I 与 Type-II 组装示意图。(A) 将 Type-I 移液管（浅蓝色）放置于电极夹持器上，使其后端开口可方便地连接柔性弹性体管路（B），并可插入 Type-II 移液管（C）。
图 2. 运动神经元加载荧光染料过程的示意图。(A) 将I型移液管置于待填充的腹根附近。(B) 对移液管施加负压，先将aCSF吸入移液管，随后吸入神经根。(C-D) 断开连接在I型移液管后端的柔性弹性体导管，并通过对II型移液管施加负压减少aCSF的量。(E) 将含有溶解染料的II型移液管尖端插入I型移液管中残留的aCSF内。(E-F) 缓慢用染料填充I型移液管，然后移除II型移液管。
图3. 填充法在离体小鼠脊髓中的应用。（A）示意图，显示用于填充脊髓中不同类型神经元的三根I型移液管。运动神经元（蓝色；Cascade Blue葡聚糖）和骶部感觉传入纤维（红色；Texas-Red葡聚糖）分别通过腹根和背根进行逆向填充。使用荧光素葡聚糖标记轴突经由腹索（VF）上行的脊髓中间神经元（绿色）。每种葡聚糖染料（10,000MW；Molecular Probes）各取1 mg，溶于6 μL含0.2% Triton X-100的蒸馏水中（B）。对一段经上述A方法进行神经元逆向标记的脊髓骶段组织切片进行共聚焦成像。注意，被标记的感觉传入纤维主要位于同侧，仅有少量投射至对侧。被标记的运动神经元位于填充腹根的同侧，而被标记的中间神经元则位于填充侧的对侧（箭头所示）。标尺：200 μm。
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讨论
我们在此介绍一种简单且经济高效的将染料导入神经元、神经和脊髓束的方案。该方法通过将特定解剖通路暴露于高浓度染料溶液中，持续至完成染料加载过程。与显微注射、浴式给药和电穿孔技术相比，该方法可实现目标区域的逆行标记，且背景信号较低。然而，该方法仅适用于神经系统中可分离出轴突束的部位。此外，由于染料似乎沿轴突扩散以到达细胞体，染料加载时间将取决于染料施加部位与神经元胞体之间的距离。至少在以下条件下 体外 该条件限制了该方法仅适用于长度为几毫米的轴突纤维束。
此类染料标记的应用包括对正常和突变小鼠的运动神经元进行逆行标记，以及对感觉传入纤维进行顺行标记10,11。此外，该技术已被用于证明感觉传入纤维直接与投射至腰段的脊髓中继中间神经元形成接触12，用于界定新生小鼠运动神经元的激活模式13，以及记录脊髓运动神经元14和中间神经元15对下行输入的反应。
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披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院国家神经疾病与卒中研究所内部项目的支持。我们还要感谢George Mentis博士在本方法的早期开发以及图3数据方面所做的贡献。
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