逆行性荧光染料标记神经、传导束和脊神经根

摘要

我们介绍一种简单且低成本的技术，利用聚乙烯吸液移液管将高浓度的荧光染料和钙敏感染料引入神经元或任何神经纤维束中。

摘要

逆行标记神经元是一种标准的解剖学方法^1,2，也已被用于将钙离子和电压敏感性染料导入神经元^3-6。通常，这些染料以固体晶体形式应用，或通过玻璃移液管进行局部加压注射。然而，当染料扩散需要数小时时，这种方法可能导致染料稀释和标记强度降低。本文我们展示了一种简单且低成本的技术，使用充满染料溶液的聚乙烯吸液移液管将荧光染料和离子敏感性染料导入神经元。该方法可在整个染料加载过程中持续保持染料与轴突接触的高浓度，具有良好的可靠性。

方案

荧光葡聚糖已被用作解剖学工具以及神经元活动成像^1-4菲尔兹等人 al., (2009)⁴ 发表了一种将离子和电压敏感性染料应用于轴突束的实验方案，重点以脊髓作为模型系统。本文中，我们描述了一种更为详细的程序，用于将荧光染料和/或离子敏感性染料施加于脊髓的切断腹根、背根或任何神经束 体外 光生理学与形态学研究。

1. I 型和 II 型移液管

首先，将两段较短的聚乙烯导管（PE90，Clay Adams 品牌）在酒精灯火焰上加热拉制，制成具有锥形尖端的移液管⁷。其中一根移液管（I 型）应较短（3–7 mm），尖端细小，可紧密固定目标根或通路（外径：0.2–0.4 mm；内径：0.1–0.3 mm）。然后拉制第二根移液管（II 型），其杆部更长（8–12 cm）、更细，尖端极细（外径：0.2–0.3 mm；内径：0.1–0.2 mm），可插入至 I 型移液管的尖端。第二根较细的移液管将用于从 I 型移液管中抽吸并注入人工脑脊液（aCSF）和染料溶液。

2. I 型移液管的放置

解剖并分离脊髓^8,9，将其置于灌流有冷aCSF（约16 °C）的浴槽中，整个加载过程中持续灌流。将I型移液管放置在电极夹持器（....

讨论

我们在此介绍一种简单且经济高效的将染料导入神经元、神经和脊髓束的方案。该方法通过将特定解剖通路暴露于高浓度染料溶液中，持续至完成染料加载过程。与显微注射、浴式给药和电穿孔技术相比，该方法可实现目标区域的逆行标记，且背景信号较低。然而，该方法仅适用于神经系统中可分离出轴突束的部位。此外，由于染料似乎沿轴突扩散以到达细胞体，染料加载时间将取决于染料施加部位与神经元胞体之间的距离。至少在以下条件下 体外 该条件限制了该方法仅适用于长度为几毫米的轴突纤维束。

此类染料标记的应用包括对正常和突变小鼠的运动神经元进行逆行标记，以及对感觉传入纤维进行顺行标记^10,11。此外，该技术已被用于证明感觉传入纤维直接与投射至腰段的脊髓中继中间神经元形成接触¹²，用于界定新生小鼠运动神经元的激活模式¹³，以及记录脊髓运动神经元¹⁴和中间神经元¹⁵对下行输入的反应。

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