过敏性气道炎症期间肺树突状细胞成熟与迁移的分析

摘要

我们描述了一种在卵清蛋白诱导的过敏性气道炎症条件下，监测肺树突状细胞对卵清蛋白刺激的成熟与迁移的策略。该策略可经修改后用于评估感染条件下肺树突状细胞的迁移情况。

摘要

树突状细胞（DCs）是通过激活抗原特异性T细胞来启动适应性免疫应答的关键参与者。在稳态下，树突状细胞存在于外周组织中；然而，在抗原刺激下，树突状细胞摄取抗原并迅速迁移至引流淋巴结，在此启动针对该抗原的T细胞应答^1,2。此外，树突状细胞还在启动自身免疫和过敏性免疫应答中发挥关键作用³。

在肺部环境中，树突状细胞（DCs）在启动免疫反应和诱导免疫耐受方面均发挥着至关重要的作用⁴。由于持续暴露于大量环境抗原，肺部环境通常具有较强的耐受性⁵。然而，在部分个体中，这种耐受状态被打破，从而导致过敏和哮喘的发生。在本研究中，我们描述了一种可用于监测致敏抗原诱导的气道DC成熟与迁移的策略。对气道DC成熟和迁移的检测，有助于评估气道过敏性炎症过程中免疫反应的动力学特征，同时也有助于理解后续免疫反应的强度及其潜在机制。

我们的策略基于使用卵清蛋白作为致敏剂。由卵清蛋白诱导的过敏性哮喘是一种广泛应用的模型，可重现哮喘过程中出现的气道嗜酸性粒细胞增多、肺部炎症以及IgE水平升高等特征^6,7。致敏后，通过鼻内给予荧光素FITC标记的卵清蛋白对小鼠进行激发，从而特异性地标记摄取卵清蛋白的气道树突状细胞（DCs）。随后，利用多种树突状细胞特异性标记物，我们可通过流式细胞术评估这些树突状细胞的成熟状态及其向引流淋巴结的迁移情况。

方案

1. 卵清蛋白致敏小鼠

1. 将OVA（V型；Sigma，MO）溶于无菌PBS中，配制成1 mg/ml的溶液（该溶液可保存于-80 °C）。
2. 为制备OVA-Alum混合物，取Alum置于离心管中，在涡旋振荡条件下按1:1比例逐滴加入OVA溶液。混合后持续搅拌30分钟，配制完成后立即使用。
3. 使用1 ml注射器，向小鼠腹腔内注射0.2 ml该混合物，并在2周后重复注射一次。

2. 使用FITC标记的卵清蛋白对小鼠进行鼻内激发

1. 在第二次注射 OVA-Alum 后 7 天，小鼠即可通过鼻内途径进行 OVA-FITC 激发。
2. 使用无菌 PBS 配制 OVA-FITC（Sigma）溶液，浓度为 1 mg/ml，并分装后于 -80 °C 保存。
3. 在 50 ml 离心管底部放置无菌纱布，在通风橱内将 5 ml Aerrane 加入纱布上。为麻醉小鼠，将小鼠放入管中约 5–10 秒，使其吸入麻醉气体。
4. 将麻醉后的小鼠保持直立姿势，使用无菌移液器吸头以逐滴方式向小鼠鼻孔滴加 100 μl OVA-FITC 溶液。
5. 在接下来的两天中，继续每天重复一次鼻内 OVA-FITC 激发。

3. 肺脏及引流淋巴结单细胞悬液的制备

1. 使用戊巴比妥钠腹腔注射处死小鼠。
2. 为了减少可能干扰树突状细胞（DC）分析的巨噬细胞污染，需进行肺灌洗。进行肺灌洗时，短暂暴露小鼠气管并插入导管和注射器；使用含5 mM EDTA的冰冻PBS冲洗下呼吸道3次，以清除肺泡腔中的细胞。
3. 通过右心室灌注10 ml含10 U/ml肝素的PBS，以去除肺血管中的血细胞。持续灌注直至肺组织变为白色，表明大部分血细胞已被清除。此步骤对去除外周血中的污染细胞尤为重要。
4. 解剖取出肺组织，分离纵隔淋巴结（MLN），并将淋巴结置于另一培养皿中。（尽量减少组织暴露于光照下，以防止FITC荧光淬灭。）
5. 将肺组织置于培养皿中，用剪刀剪碎。随后在37 °C条件下使用250 U/ml Collagenase D（Roche）消化25分钟，并加入EDTA（终浓度10 mM）继续孵育5分钟以终止胶原酶活性。
6. 将消化后的肺组织碎片通过100 μm细胞筛网过滤，并进行低渗裂解以去除红细胞。所得单细胞悬液可用于后续树突状细胞的分析。
7. 为制备MLN的单细胞悬液，使用细针轻轻研磨MLN，并按上述方法用胶原酶消化，随后通过细胞筛网过滤。

4. 染色检测树突状细胞标志物以评估成熟/迁移

1. 为了鉴定肺部的树突状细胞（DCs），需进行 CD11c 和 CD11b 染色。此外，为评估其成熟状态，还需进行 CD86 和 CD80 染色，这两种分子在树突状细胞成熟过程中表达上调。在纵隔淋巴结（MLN）中鉴定出的 CD11c⁺CD11b⁺OVA-FITC⁺ 细胞，被认为是响应 OVA 气道刺激后从肺部迁移至 MLN 的肺源性树突状细胞。
2. 将细胞重悬于 FACS 缓冲液（含 1% FBS 和 1 mM EDTA 的 PBS）中，浓度为 10 × 10⁶ 个细胞/ml，并每管分装 150 μl 细胞悬液用于流式染色。为鉴定肺部树突状细胞，需设置以下染色对照：未染色对照（未接触 OVA-FITC 的小鼠肺细胞）、OVA-FITC 单染对照、CD11c 单染对照、CD11b 单染对照、CD11b⁺CD11c⁺ 双染对照、CD11b⁺OVA-FITC⁺ 双染对照、CD11c⁺OVA-FITC⁺ 双染对照、MHC II 单染对照、CD86 单染对照、CD80 单染对照，以及待测样本：OVA-FITC⁺CD11c⁺CD11b⁺MHCII⁺、OVA-FITC⁺CD11c⁺CD11b⁺CD86⁺ 和 OVA-FITC⁺CD11c⁺CD11b⁺CD80⁺。
3. 为评估树突状细胞迁移情况，需对来自纵隔淋巴结（MLN）的单细胞悬液进行绝对细胞计数，随后准备以下检测管：未染色对照（未接触 OVA-FITC 的小鼠 MLN 细胞）、OVA-FITC 单染对照、CD11c⁺ 单染对照、CD11b⁺ 双染对照、CD11b⁺OVA-FITC⁺ 双染对照、CD11c⁺OVA-FITC⁺ 双染对照，以及 CD11c⁺CD11b⁺OVA-FITC⁺ 样本。

5. 典型结果

腹腔致敏诱导气道过敏性炎症所需的时间点至关重要，应按照图1所示进行操作。在腹腔致敏及气道OVA激发后，为确认气道过敏性炎症的建立，可处死部分小鼠，并对肺组织切片进行组织学分析，如图2所示。可通过苏木精-伊红染色（图2A）确认炎性细胞的存在，通过过碘酸-希夫染色（图2B）评估黏液分泌情况。综合上述结果可证实，在OVA致敏小鼠经OVA激发后成功诱导了气道过敏性炎症⁸。相比之下，经生理盐水处理的小鼠肺组织切片应无任何炎症表现，且无黏液分泌。此外，在OVA激发后，肺部树突状细胞（DCs）会发生成熟并迁移至引流淋巴结。对经OVA致敏和激发小鼠的纵隔淋巴结（MLN）中CD11c⁺细胞进行分析，预期显示其CD11c⁺细胞比例高于生理盐水处理小鼠（图3A）。此外，对OVA致敏并激发小鼠MLN中CD11c⁺CD11b⁺OVA-FITC⁺细胞的绝对细胞数量进行分析，预期显示其数量显著高于生理盐水处理小鼠（即高出数倍）（图3B）。

图1. 诱导小鼠卵清蛋白（OVA）致敏性气道炎症的实验方案，以及使用荧光素异硫氰酸酯标记的卵清蛋白（OVA-FITC）进行气道激发的流程。

图 2. OVA致敏后经OVA气道激发可诱导气道过敏性炎症，通过肺组织切片的苏木精和伊红（Hematoxylin & Eosin）染色结果（见图A）可识别；同时可导致气道黏液分泌增加，通过肺组织切片的过碘酸雪夫（Periodic Acid Schiff）染色结果（见图B）可识别。

图 3. OVA-FITC激发诱导树突状细胞（DC）从肺部迁移至纵隔淋巴结（MLN）。(A) 流式细胞术图显示对照组或OVA致敏小鼠MLN中CD11c⁺细胞的比例。(B) 生理盐水组或OVA致敏小鼠MLN中CD11c⁺CD11b⁺OVA-FITC⁺细胞的绝对计数。*p<0.05。 点击此处查看高清大图。

讨论

本文所述方法基于气道激发OVA-FITC，提供了一种基于流式细胞术分析肺树突状细胞（DCs）的技术。该方法可选择性地监测摄取OVA-FITC的肺DCs，因此所检测的DC群体实际上正是参与OVA诱导的过敏性气道炎症过程中气道免疫应答的细胞群体。在对照组小鼠中，由于不存在过敏性气道炎症，引流淋巴结（MLN）中检测到的迁移型DCs（OVA-FITC+ DCs）数量反映了DC迁移的基础速率；而在过敏性气道炎症发生时，DC迁移速率加快，导致MLN中OVA-FITC+ DCs的绝对数量显著增加。与传统的基于免疫组织化学或免疫染色的分析方法相比，该策略具有明显优势，因其可在更短的时间内完成分析，且效率和灵敏度更高。因此，在进行流式细胞术分析时，必须严格按照方法中所述设置适当的对照组。另一个可能影响实验结果的因素是肺组织单细胞悬液的制备过程。因此，在操作过程中需注意避免组织长时间暴露于光照下，以免影响OVA-FITC的荧光信号；同时在肺组织酶解过程中也需格外小心，过度消化可能导致细胞表面标志物的裂解，从而影响后续分析。肺泡巨噬细胞与DCs具有相似的表面标志物谱，这进一步增加了肺DC群体分析的复杂性⁹。因此，必须对肺进行灌洗以清除可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卵清蛋白	Sigma-Aldrich	A5503
氢氧化铝佐剂	Thermo Scientific	77161
OVA-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
胶原酶D	Roche	11088858001
抗体	e-Bioscience