涡虫固定、局部照射与组织移植

摘要

本文描述了一种在涡虫之间移植大小明确且一致的组织的有效方法。此外，还介绍了如何将移植过程中使用的固定技术与铅屏蔽结合，用于活体动物的局部照射。

摘要

涡虫是一种淡水扁形虫，已被证明是研究后生动物再生和干细胞生物学的有力模型^1,2。涡虫能够再生任何缺失或受损的组织，这依赖于一类称为新胚细胞（neoblasts）的成体干细胞³。尽管已有确凿证据表明这些干细胞具有多能性，并且单个细胞即能重建整个生物体⁴，但干细胞群体内部的异质性及其细胞行为的动态变化在很大程度上仍未阐明。由于干细胞数量众多且广泛分布于整个涡虫体轴，因此迫切需要先进的方法来在活体（in vivo）条件下对干细胞亚群进行分子和功能层面的操作与研究。

组织移植和局部照射是分离涡虫干细胞亚群以进行进一步研究的两种方法。每种技术都有其独特的优势。组织移植能够将本质上具有遗传差异的干细胞或经药物处理过的干细胞引入到未经处理的宿主中。相比之下，局部照射能够在宿主体内实现干细胞的隔离，使其与无干细胞组织相邻，同时避免造成伤口或破坏组织完整性。利用这两种方法，可以研究调控干细胞功能（如增殖、分化和迁移）的细胞自主性与非自主性因素。

组织移植^5,6和部分照射⁷在历史上曾被用于阐明许多至今仍在研究中的涡虫再生相关问题。然而，由于以往方法繁琐且结果不稳定，这些技术一直未能得到广泛应用。本文所介绍的方案在显著减少所需时间和工作量方面迈出了重要一步，能够高效、可重复地产生大量移植或部分照射的动物，成功率接近100%。我们涵盖了大型涡虫的培养、固定、部分照射前准备、组织移植以及动物恢复的优化。此外，本文所述工作首次将部分照射方法成功应用于目前研究最广泛的涡虫物种Schmidtea mediterranea。同时，涡虫中高效的组织移植技术为功能验证未经处理或经处理的干细胞亚群在重群体化检测中的作用打开了大门，而重群体化检测长期以来一直是哺乳动物成体干细胞潜能检测的金标准方法⁸。这些技术的广泛采用无疑将促进人们对成体干细胞在组织稳态与再生过程中细胞行为的深入理解。

方案

注意：本方案建议使用可能具有危害性的材料（铅和氯酮）。请获取、阅读并遵循所有可能具有危害性材料的材料安全数据表（MSDS）。

1. 动物培养、筛选与准备

1. 动物培养和操作时使用涡虫水（1X Montjuïc 盐溶液⁹）和塑料移液管。
2. 在实验室常规培养条件下饲养的有性生殖型 Schmidtea mediterranea 可直接使用¹⁰。为获得所需大小的无性生殖型个体，应在正常培养条件⁹下于室温饲养 S. mediterranea，并在使用前一至两个月内以正常频率的两到三倍（每周 2–3 次）进行喂食。或者，以正常频率喂食的无性生殖型动物可在 10 摄氏度条件下长期饲养，以增加其平均体型。
3. 选择体长在 1 至 2 cm 之间、宽度超过 2 mm 的个体，并在使用前饥饿处理 3–7 天。
4. 若需对目标宿主、供体或部分辐照动物进行药理学或放射学处理，应在本步骤中实施相应处理。
5. 若此前进行的药理学处理需要喂食动物，则在使用前需额外饥饿 3 至 7 天。

2. 溶液与材料的准备

1. 通过将0.1-0.2% w/v的氯乙酮溶解于涡虫培养用水中，并将溶液置于冰上冷却，制备作为温和局部麻醉剂的氯乙酮溶液。
2. 若仅进行部分照射，则继续进行步骤2.7；若进行组织移植，则继续进行步骤2.3。
3. 使用本生灯，将内径为0.75 mm（用于切割移植物组织）和外径为0.7 mm（用于在宿主组织上打孔以接收移植物）的毛细管在距末端1-2 cm处弯曲成90°角。为节约材料，可将每根毛细管的两端均弯曲后折断成两半，从而制成两个工具。注意不要灼烧管子的最末端。
4. 将以下纸张裁剪至指定尺寸：
   • 黑色滤纸（裁成约2.5 cm × 1.5 cm的矩形）
   • Whatman #3滤纸（裁成约2 cm × 0.5 cm的矩形）
   • Kimwipe纸（折叠后裁成约3 cm × 0.5 cm × 4层的小块）
   • 卷烟纸（去除胶条后裁成约3 cm × 2 cm的矩形）
5. 制备改良的Holtfreter溶液（3.5 g/L NaCl、0.2 g/L NaHCO₃、0.05 g/L KCl、0.2 g/L MgSO₄、0.1 g/L CaCl₂，pH 7.0–7.5）和酪蛋白饱和的Holtfreter溶液，并将两者均冷却至4 °C。
6. 将一片折叠的Kimwipe纸固定在一块Parafilm膜上，置于体视显微镜下方的帕尔贴冷却板或其他冷却装置上。用预冷的Holtfreter溶液浸润Kimwipe纸，并在其上放置两片黑色滤纸矩形片。
7. 用Whatman #2滤纸衬垫培养皿。用Holtfreter溶液润湿滤纸，并将培养皿置于冰上冷却。对于部分照射实验，可使用较大的培养皿及相应尺寸的滤纸衬垫。

3. 麻醉与固定

1. 用冰冷的氯代酮溶液填充培养皿，并用移液器将蠕虫转移至皿中。进行移植时，每次仅麻醉一个宿主和一个供体。若需进行部分照射，可同时麻醉多个（n > 10）动物。
2. 让蠕虫在氯代酮溶液中浸泡至完全静止（5–10 分钟）。
3. 用移液器将蠕虫转移至盛有冰冷霍尔特弗雷特溶液的培养皿中，进行冲洗。
4. 用移液器将动物转移至已浸透冰冷霍尔特弗雷特溶液的黑色滤纸上，用镊子将其腹侧朝下固定。若动物仍能移动，可吸去多余的霍尔特弗雷特溶液，略微降低帕尔贴装置或冷板的温度，或延长氯代酮处理时间。

4. 局部照射

注意：请按照以下步骤准备用于部分照射的动物。如果进行移植实验，请转至第5节。

1. 将步骤 2.7 中预冷的培养皿放置在冰桶内的冰上，冰桶需可放入顶部放射源X射线辐照仪中。
2. 通过移动固定动物的黑色滤纸来调整麻醉后的动物在培养皿中的位置。直接使用镊子移动麻醉后的蠕虫可能会造成损伤。
3. 将排列好的动物转移至顶部放射源X射线辐照仪，并放置冰桶，使阴极管与动物之间的距离最小化，从而最大化有效剂量率。
4. 根据需要在动物与阴极管之间放置铅屏蔽板（图1）。屏蔽板厚度应为 4.5 至 6 mm，以实现对 325 kV X 射线束 97% 至 99% 的衰减¹¹。
5. 施加X射线剂量。若需完全消融未屏蔽区域的干细胞，应使用X射线辐照仪施加 30 Gy 或更高的剂量。作为参考，在 Precision X-Ray Inc. XRAD320 设备中，30 Gy 相当于在 320 千伏、10 毫安条件下照射 3.6 分钟，源-野距离为 30 厘米。
6. 完成照射后，立即通过黑色滤纸操作，将动物转移至预冷的涡虫培养用水中。让涡虫培养用水逐渐升至室温，并使动物自行从黑色滤纸上脱落。至此，部分照射程序已完成。

5. 组织移植

1. 使用移液管和镊子，在解剖显微镜下，将已麻醉的宿主和供体涡虫分别放置于冷却在帕尔帖或冷却板上的Kimwipe上的黑色滤纸小方块上。
2. 使用内径为0.75 mm的毛细管从供体中切取移植物小柱，并用镊子将其放置在宿主上不碍事的区域。若移植物卡在毛细管中，可用镊子将其取出。
3. 使用外径为0.7 mm的毛细管从宿主中取出一小柱组织，然后用镊子将移植物精确置入所留下的孔洞中。
4. 将带有黑色滤纸方块的已移植宿主转移至步骤2.7中准备好的培养皿中。
5. 用酪蛋白饱和的霍尔特弗雷特溶液润湿一张卷纸，并按图2A所示将其覆盖在已移植的宿主上方。
6. 将四片滤纸浸泡于酪蛋白饱和的霍尔特弗雷特溶液中，并按图2B所示将已移植的宿主包裹起来。
7. 将四团裁剪好的Kimwipe用酪蛋白饱和的霍尔特弗雷特溶液浸透，并覆盖在步骤5.6中的滤纸上（图2B）。盖上盖子，将培养皿置于冰上。
8. 将供体涡虫转移至涡虫培养用水中，使其恢复、愈合并再生。
9. 当所有移植操作完成后，将已移植的涡虫置于10 °C培养箱中过夜。
10. 次日早晨，小心不要扰动移植物，揭开覆盖物，将涡虫（连同其黑色滤纸）转移至盛有涡虫培养用水的培养皿中。
11. 可让涡虫自行从滤纸上脱落，或用镊子轻轻将其取下。
12. 每2–3天更换一次涡虫培养用水。

6. 代表性结果

部分照射后，涡虫会立即表现为正常且未受影响。根据所给予的剂量和所用屏蔽物的几何形状，被照射的组织可能会退化甚至解体⁷。屏蔽区域的组织应保持完整。在组织退化并丧失组织完整性之后，将形成再生芽基（blastema），缺失的结构将得以再生（图3A）。如果在部分照射区域内进行截肢操作，被照射的组织将被挽救（即阻止其退化或解体）（图3B）。无论是未受伤还是已截肢的情况，其再生过程均比未照射涡虫的截肢再生有所延迟（图3C）。若给予30 Gy的X射线剂量，并对部分照射后未受伤的动物，在照射后2至3天通过针对干细胞标志物Smed-piwi-1¹²（又称smedwi-1）的原位杂交（in situ hybridization）检测，可确认干细胞已成功按铅屏蔽物的形状被清除（图4）。

移植后的第二天早晨，移植组织成功植入宿主组织的情况应已清晰可见，移植物应已附着于宿主的背侧和腹侧表面图 5A）。有时，移植物仅会附着于宿主的腹侧或背侧表面。如果移植完全失败，则在宿主的背侧和腹侧表面均无法观察到移植物的任何迹象。图5B在将未经辐照的组织成功移植到因致死性辐照而清除干细胞的宿主后不久^13,14 , 原位 杂交用于 Smed-piwi-1 将揭示干细胞主要存在于移植物中（图5C此外，将未辐照的组织成功移植到致死剂量辐照的宿主体内，可实现宿主组织的挽救并使其长期存活。¹⁵.

图1. 局部照射基本组件的总体布置。 在具有顶部X射线源（阴极管）的X射线照射装置中，将麻醉后的涡虫置于X射线源正下方的照射区域内。为了最大化X射线剂量率，应尽量减小涡虫与X射线源之间的距离。应在阴极管与麻醉后的涡虫之间放置铅屏蔽，尽可能靠近涡虫。铅屏蔽的设计、制造和放置应确保其能够遮蔽目标组织，同时完全暴露涡虫的其余部分。许多商业制造商可根据您提供的简单设计图定制铅屏蔽；我们已成功使用Alpha Systems Corp.（Bluffdale, UT）的产品。铅材料应具有足够的厚度以实现所需的屏蔽效果。例如，若希望几乎完全屏蔽320 kV的X射线束，则铅厚度应在4.5至6 mm之间。涡虫和铅屏蔽应放置在铺有经霍尔特弗雷特液浸泡滤纸的培养皿中，该培养皿置于冰桶内。若X射线照射区域足够大，并配备多个相同的铅屏蔽，可同时对多个样本进行局部照射（图中未示出）。

图2. 构建恢复室。 （A）组织移植恢复室的分解示意图，显示了经酪蛋白饱和的霍尔特弗雷特溶液浸泡后，各组件依次叠加的结构。（B）一个接近完成的恢复室，展示了Whatman #3滤纸矩形片相互嵌合的放置方式，紧密包裹麻醉后的涡虫，防止其在愈合过程中移动。恢复室的精细构建可有效防止动物移动和干燥，促进快速愈合，提高组织移植的成功率。

图3. 简单的后部部分照射的代表性结果。 如 Dubois 所述⁷，(A) 当涡虫的后半部分用铅屏蔽后接受X射线照射时，观察到前部组织回缩至被照射与屏蔽组织之间的边界处，随后在此处形成无色素的芽基，动物开始再生。(B) 另一方面，当在(A)中所述相同的部分照射后对动物进行去头处理时，未观察到组织回缩现象，残留的被照射前部组织得以挽救。这些部分照射并去头的动物能够再生出头部（B），但与未照射的去头对照组（C）相比，再生过程显著延迟。

图4. 部分照射后部分干细胞消融的代表性结果。 整体装片 原位 原位杂交（WISH）检测干细胞标志物 Smed-piwi-1 显示野生型涡虫的干细胞分布于全身，但光感受器前的组织（箭头）和咽部本身（星号）除外¹⁴.（A）WISH 用于 Smed-piwi-1 在照射后三天固定、经完全屏蔽防护的对照组涡虫中，干细胞分布与野生型涡虫无明显差异。（B）另一方面，WISH检测显示 Smed-piwi-1 在仅部分屏蔽而前后端暴露的动物中，照射后三天进行固定，结果显示非屏蔽区域的干细胞已被消融。比例尺为500微米。

图5. 组织移植成功与失败的示例。 （A）移植后第三天成功移植涡虫的背侧和腹侧活体图像。移植物（已标注）在背侧和腹侧表面均清晰可见，并在移植物与宿主交界处周围出现特征性的无色素组织。（B）相应地，失败的移植在移植部位（已标注）未见明显移植物组织，仅表现为一处愈合的、无色素的侧向伤口，为移植失败所致。若移植物仅附着于背侧或腹侧表面，则从一侧观察时可能类似成功移植（A），而从另一侧观察时则类似失败移植（B）。（C）将野生型（wt）组织移植至经辐射处理、其内源性干细胞已被清除的宿主中，移植后两天通过WISH检测Smed-piwi-1以显示移植的干细胞，结果显示干细胞特异性地仅存在于移植物位置或其周围（箭头所示），从而明确反映移植成功。比例尺为500微米。

讨论

固定化的重要性

固定是成功完成这些过程中的任何一步最为关键的环节。如果在部分照射前涡虫固定不当，它们可能会移动到铅屏蔽下方，导致结果不一致且相互干扰。此外，如果在移植后动物固定不充分，宿主涡虫很可能会移离移植物组织，导致移植物无法正常愈合到宿主体上。适当的固定可通过调节氯醛糖（chloretone）处理的浓度或时长，以及涡虫所处滤纸的温度和湿度来实现。0.2%浓度的氯醛糖处理最长可达半小时似乎并无毒性，但如此时长的处理可能诱发咽部外翻。在此期间，涡虫保持静止，便于进行部分照射。我们的经验表明，湿度相较于氯醛糖处理是更为关键的因素——滤纸过湿则动物容易移动；过干则动物会脱水。在任何情况下，滤纸应完全浸透，但不应达到在容器内或表面形成积水的程度。可轻轻摇晃培养皿以去除多余液体。用于浸透滤纸的液体用量无疑需根据具体环境湿度进行调整。

移植速度

速度对于提高局部照射和移植的效率至关重要。局部照射后的动物固定时间越长，发生损伤或组织完整性受损的风险就越高，这可能会影响特定检测结果的准确性。移植...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
通用移液管	Samco	691
毛细管（内径 0.75 mm）	FHC	30-30-0
毛细管（外径 0.7 mm）	FHC	30-50-08
Parafilm M 封口膜	VWR	52858-076
Kimwipes 擦镜纸 34155	VWR	500029-891
黑色滤纸	Schleicher Schuell	10310809
Whatman #2 滤纸 1002-055	Fisher Scientific	09-810B
Whatman #3 滤纸 1003-185	Fisher Scientific	09-820E
卷烟纸	Zig-Zag, original	NA
培养皿	VWR	82050-544
杜蒙特不锈钢镊子 #5	FST	11251-20
Chloretone	Sigma Aldrich	112054
酪蛋白	Sigma Aldrich	C3400
铅屏蔽罩	Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT	定制设计
XRAD-320 生物辐照仪	Precision X-Ray, North Branford, CT	NA