本文描述了一种在涡虫之间移植大小明确且一致的组织的有效方法。此外，还介绍了如何将移植过程中使用的固定技术与铅屏蔽结合，用于活体动物的局部照射。
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本文内容
摘要
摘要
涡虫是一种淡水扁形虫，已被证明是研究后生动物再生和干细胞生物学的有力模型1,2。涡虫能够再生任何缺失或受损的组织，这依赖于一类称为新胚细胞（neoblasts）的成体干细胞3。尽管已有确凿证据表明这些干细胞具有多能性，并且单个细胞即能重建整个生物体4，但干细胞群体内部的异质性及其细胞行为的动态变化在很大程度上仍未阐明。由于干细胞数量众多且广泛分布于整个涡虫体轴，因此迫切需要先进的方法来在活体（in vivo）条件下对干细胞亚群进行分子和功能层面的操作与研究。
组织移植和局部照射是分离涡虫干细胞亚群以进行进一步研究的两种方法。每种技术都有其独特的优势。组织移植能够将本质上具有遗传差异的干细胞或经药物处理过的干细胞引入到未经处理的宿主中。相比之下，局部照射能够在宿主体内实现干细胞的隔离，使其与无干细胞组织相邻，同时避免造成伤口或破坏组织完整性。利用这两种方法，可以研究调控干细胞功能（如增殖、分化和迁移）的细胞自主性与非自主性因素。
组织移植5,6和部分照射7在历史上曾被用于阐明许多至今仍在研究中的涡虫再生相关问题。然而，由于以往方法繁琐且结果不稳定，这些技术一直未能得到广泛应用。本文所介绍的方案在显著减少所需时间和工作量方面迈出了重要一步，能够高效、可重复地产生大量移植或部分照射的动物，成功率接近100%。我们涵盖了大型涡虫的培养、固定、部分照射前准备、组织移植以及动物恢复的优化。此外，本文所述工作首次将部分照射方法成功应用于目前研究最广泛的涡虫物种Schmidtea mediterranea。同时，涡虫中高效的组织移植技术为功能验证未经处理或经处理的干细胞亚群在重群体化检测中的作用打开了大门，而重群体化检测长期以来一直是哺乳动物成体干细胞潜能检测的金标准方法8。这些技术的广泛采用无疑将促进人们对成体干细胞在组织稳态与再生过程中细胞行为的深入理解。
方案
注意：本方案建议使用可能具有危害性的材料（铅和氯酮）。请获取、阅读并遵循所有可能具有危害性材料的材料安全数据表（MSDS）。
1. 动物培养、筛选与准备
- 动物培养和操作时使用涡虫水（1X Montjuïc 盐溶液9）和塑料移液管。
- 在实验室常规培养条件下饲养时，可使用有性生殖型 Schmidtea mediterranea10。为获得所需大小的无性生殖型个体，应在正常培养条件9下于室温饲养 S. mediterranea，并在使用前一至两个月内以正常频率的两到三倍（每周 2–3 次）进行喂食。或者，以正常频率喂食的无性生殖型动物可在 10 摄氏度条件下长期饲养，以增加其平均体型。
- 选择体长在 1 至 2 cm 之间、宽度超过 2 mm 的个体，并在使用前饥饿处理 3–7 天。
- 如需对预定的宿主、供体或部分照射的动物进行任何药理学或放射学处理，应在本步骤中实施相应处理。
- 若所进行的药理学处理要求在处理期间喂食动物，则应在使用前额外饥饿 3 至 7 天。
2. 溶液与材料的准备
- 通过将0.1-0.2% w/v的氯醛酮（chloretone）溶解于涡虫养....
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讨论
固定化的重要性
固定是成功完成这些过程中的任何一步最为关键的环节。如果在部分照射前涡虫固定不当，它们可能会移动到铅屏蔽下方，导致结果不一致且相互干扰。此外，如果在移植后动物固定不充分，宿主涡虫很可能会移离移植物组织，导致移植物无法正常愈合到宿主体上。适当的固定可通过调节氯醛糖（chloretone）处理的浓度或时长，以及涡虫所处滤纸的温度和湿度来实现。0.2%浓度的氯醛糖处理最长可达半小时似乎并无毒性，但如此时长的处理可能诱发咽部外翻。在此期间，涡虫保持静止，便于进行部分照射。我们的经验表明，湿度相较于氯醛糖处理是更为关键的因素——滤纸过湿则动物容易移动；过干则动物会脱水。在任何情况下，滤纸应完全浸透，但不应达到在容器内或表面形成积水的程度。可轻轻摇晃培养皿以去除多余液体。用于浸透滤纸的液体用量无疑需根据具体环境湿度进行调整。
移植速度
速度对于提高局部照射和移植的效率至关重要。局部照射后的动物固定时间越长，发生损伤或组织完整性受损的风险就越高，这可能会影响特定检测结果的准确性。移植.......
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致谢
作者感谢小林千代子（Chiyoko Kobayashi）和赤田清一（Kiyokazu Agata）在涡虫移植技术方面提供的有益建议，同时也感谢Sánchez实验室过去和现在的成员在本技术开发过程中给予的宝贵讨论。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）培训项目基金（5T32 HD0791）对OCG的资助，以及NIH基金R37GM057260对ASA的支持。ASA是霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）的研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 通用移液管 | Samco | 691 | |
| 毛细管（内径 0.75 mm） | FHC | 30-30-0 | |
| 毛细管（外径 0.7 mm） | FHC | 30-50-08 | |
| Parafilm M 封口膜 | VWR | 52858-076 | |
| Kimwipes 擦镜纸 34155 | VWR | 500029-891 | |
| 黑色滤纸 | Schleicher Schuell | 10310809 | |
| Whatman #2 滤纸 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B | |
| Whatman #3 滤纸 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E | |
| 卷烟纸 | Zig-Zag, original | NA | |
| 培养皿 | VWR | 82050-544 | |
| 杜蒙特不锈钢镊子 #5 | FST | 11251-20 | |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 | |
| 酪蛋白 | Sigma Aldrich | C3400 | |
| 铅屏蔽罩 | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | 定制设计 | |
| XRAD-320 生物辐照仪 | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
参考文献
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 Forthcoming.
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Randolph, H.
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重印与许可
