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方法文章

分子机制的表征 体内 UVR 诱导的白内障

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DOI：

10.3791/4016

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2012年11月28日

 ,  , 
1St. Erik's Eye Hospital, Karolinska Institutet, 2Gullstrand lab, Section for Ophthalmology, Department of Neuroscience, Uppsala University

本文内容

摘要

白内障是全球致盲的首要原因。太阳紫外线辐射（UVR）是白内障发生的主要危险因素。目前已建立远紫外B波段（UVR-B）诱导白内障的动物模型。本文介绍白内障形成的研究方法：紫外线辐射暴露、定量RT-PCR和免疫组织化学。

摘要

白内障是全球致盲的首要原因1。世界卫生组织将白内障定义为眼睛晶状体混浊，阻碍光线传递。白内障是一种多因素疾病，与糖尿病、吸烟、紫外线辐射（UVR）、酒精、电离辐射、类固醇和高血压相关。已有大量实验证据2-4和流行病学证据5,6表明，UVR可导致白内障。我们建立了适用于麻醉7和非麻醉动物8的UVR B诱导白内障动物模型。

目前白内障的唯一治愈方法是手术，但这种治疗并非所有人都能获得。据估计，若能将白内障的发病时间延迟10年，对白内障手术的需求可减少50%9。为了延缓白内障的发生，有必要深入了解白内障形成的机制，并找到有效的预防策略。在白内障发展的诸多机制中，细胞凋亡在人类和动物白内障的起始过程中起着关键作用10。我们近期的研究重点是晶状体中的细胞凋亡作为白内障发展的机制8,11,12。预计对紫外线辐射（UVR）对细胞凋亡通路影响的更深入理解，将有助于发现新的药物以预防白内障。

本文中，我们描述了如何通过实验方法诱导白内障 体内 暴露于UVR-B。进一步介绍RT-PCR和免疫组织化学作为研究UVR-B诱导白内障分子机制的工具。

方案

1. 紫外辐射暴露

  1. 照射前15分钟，通过腹腔注射给予雌性Sprague-Dawley大鼠90 mg/kg Ketalar（氯胺酮）和10 mg/kg Rompun（赛拉嗪）混合物进行麻醉。
  2. 将动物置于大鼠固定器中，并收紧绑带，直至大鼠固定不动但未造成躯干受压13。
  3. 在大鼠双眼滴加Mydriacyl（托吡卡胺），浓度为10 mg/ml，以诱导散瞳。
  4. 将动物放置妥当，使其一只眼睛对准波长为300 nm14、半高全宽为10 nm的窄束UVR照射，另一只眼睛用黑色胶带遮蔽。
  5. 对大鼠单侧眼睛以300 nm波长、1 kJ/m2的亚阈值剂量UVR-B照射15分钟15。

2. 解剖

  1. 在预定的暴露后时间点（1、5、24 和 120 小时），通过二氧化碳窒息法处死六周龄大鼠（体重 < 200 g），并辅以颈椎脱位。
  2. 摘除眼球，随后将眼球角膜朝下、后部朝上放置。用27号套管针刺出一个微小孔洞，并沿巩膜表面切向推进，以避免损伤紧邻巩膜的晶状体。然后使用眼科手术剪在角膜缘后方作环形剪切，直至可将巩膜后部掀起。接着用钝性弯镊轻轻提起晶状体。
  3. 在显微镜下清除晶状体赤道部残留的睫状体组织，晶状体在平衡盐溶液中存放时间不得超过5–10分钟。

3. 定量 RT-PCR

  1. 将晶状体放入含有 350 μl RA1 裂解缓冲液（NucleoSpin RNA II 总 RNA 分离试剂盒）和 3.5 μl β-巯基乙醇的混合液中，置于 2 ml Eppendorf 管内。
  2. 在室温下使晶状体在此混合液中保持 30 分钟。
  3. 用针头匀浆晶状体，直至仅剩晶状体的硬核部分（晶状体的皮质和囊膜已在裂解缓冲液中裂解），然后将核从混合液中移除。
  4. 立即将样品储存在 -70 °C 条件下。
  5. 解冻样品，并按照“培养细胞和组织的总 RNA 纯化”方案（NucleoSpin RNA II 总 RNA 分离试剂盒）进行操作。
  6. 将 RNA 样品储存在 -70 °C 条件下。
  7. 为验证各样品中 DNA 是否已充分去除，使用 p53 DNA 特异性引物（上游引物：5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3'，下游引物：5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3'）和 Taq DNA 聚合酶（dNTPack），按制造商说明书进行 PCR 扩增，反应条件如下：步骤 1：95 °C 预变性 2 分钟；步骤 2 进行 40 个循环：95 °C 变性 20 秒，55 °C 退火 20 秒，72 °C 延伸 20 秒；步骤 3：72 °C 最终延伸 7 分钟。预期扩增产物为 243 个碱基对。
  8. 进行 1.5 % 琼脂糖凝胶电泳，以检测 243 个碱基对的 DNA 特异性 PCR 产物。配制 1.5 % 琼脂糖凝胶时，取 3.75 g 琼脂糖溶于 250 ml TBE 缓冲液中。在 500 ml 1.5 % 琼脂糖凝胶溶液中加入 500 μl 溴化乙锭（0.5 mg/ml）。将混合物放入微波炉加热并搅拌，直至琼脂糖完全溶解。

所有样品在1.5%琼脂糖凝胶电泳中均不应显示出任何DNA特异性PCR产物。

  1. 使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计测定 RNA 样品（1 μl）的浓度以及样品在 260 nm（RNA）和 280 nm（蛋白质）处的吸光度比值。若 RNA 样品的 RNA 与蛋白质吸光度比值为 2.0 或更高，则表明 RNA 样品纯度合格；若比值低于 2.0，则需重复 RNA 纯化步骤 3.5。
  2. 取相当于 1 μg 的 RNA 样品体积，按照 1st Strand cDNA 合成试剂盒（用于 RT-PCR 的 1st Strand cDNA 合成试剂盒）的操作说明合成 cDNA。
  3. 将 cDNA 样品储存在 -20 °C（若需保存一年以上，请储存在 -70 °C）。
  4. 在 iCycler MyiQ 单色实时 PCR 检测系统上进行定量实时 PCR。根据制造商说明书，在 96 孔板中每孔加入 1 μl cDNA 样品、TaqMan 基因表达主混合液和针对 caspase 3 的 TaqMan 基因表达检测探针，每个样本设三个复孔。另取一个 96 孔板，同样根据制造商说明书（TaqMan 基因表达检测方案），每孔加入 1 μl cDNA 样品、TaqMan 基因表达主混合液和针对 18s 的 TaqMan 基因表达检测探针，每个样本设三个复孔。从三个随机选取的未暴露处理的晶状体中提取部分 cDNA 进行系列稀释，并将这些稀释样品与待测样本的 cDNA 一同上样至 96 孔板中进行扩增。
  5. 采用标准曲线法对结果进行定量分析。在 MyiQ 软件中，以达到阈值荧光所需的循环数作为测量值。对每块 96 孔板中的系列稀释样品建立标准曲线，该曲线以阈值循环数为因变量，相对校准品浓度为自变量。使用三个未经处理的晶状体样本的 cDNA 作为校准品。将每个样本的阈值循环数与标准曲线比对，计算出该样本 cDNA 的相对浓度。最后，通过将目标基因 cDNA 的相对浓度与内参基因 18s cDNA 的相对浓度进行比较，获得目标基因的表达水平。

4. 免疫组织化学染色

  1. 固定
    1. 在 PBS（磷酸盐缓冲液；pH 7.4）中解剖眼球。
    2. 将眼球放入含有 4% 多聚甲醛（PFA）的离心管中，置于冰上固定 20 分钟。前一天配制 4% PFA 溶液，储存于 +4 °C 备用。PFA 溶液新鲜配制后约可保存一周。
    3. 用移液器吸除 PFA，然后用预冷的 PBS 洗涤 20 分钟。
    4. 将眼球置于含 30% 蔗糖的溶液中，+4 °C 过夜。
    5. 将眼球放入盛有最佳切割温度（OCT）包埋剂（Tissue-Tek）的小杯中，并调整眼球位置以利于切片。
    6. 在干冰上将 OCT 包埋剂中的样本速冻。
    7. 储存于 -70 °C，待用。
  2. 切片
    1. 将眼球置于适当角度，进行冷冻切片。
    2. 从每只晶状体中央区域切取三张 5 μm 厚的正中矢状切片。连续切片之间至少弃去 6 张切片，以避免不同切片中染色到相同的细胞核。
    3. 切下切片后，轻轻将载玻片覆盖其上，使切片自然黏附于载玻片。
    4. 切片在使用前自然风干。载玻片可储存于 -20 °C 备用。
  3. 荧光免疫组织化学
    1. 让样本恢复至室温（5–10 分钟）。
    2. 用 PAP 笔（Invitrogen）在样本周围画圈。
    3. 待画好的圈自然干燥一段时间（10 分钟）。
    4. 标记载玻片。
    5. 在 1 × PBS 中再水化 15 分钟。
    6. 用标准封闭液透化处理 30 分钟。
    7. 加入一抗（兔多克隆抗体，cleaved caspase-3 抗体 Asp175 9661；Cell Signalling Technology, Inc），按 1:3,000 比例稀释于标准封闭液中。
    8. 置于湿盒中，+4 °C 过夜孵育。
    9. 用移液方式在 PBS 中洗涤（3 × 5 分钟），或浸入大量缓冲液中洗涤（>15 分钟，换液 1–2 次）。
    10. 加入二抗（抗兔二抗，具有特定吸收/发射光谱），按 1:300 比例稀释于标准封闭液中。
    11. 用移液方式在 PBS 中洗涤（3 × 5 分钟），或浸入大量缓冲液中洗涤（>15 分钟，换液 1–2 次）。
    12. 擦除 PAP 笔痕迹。
    13. 置于湿盒中，室温避光孵育 3 小时。
    14. 滴加一滴 Vectashield 封片剂，盖上盖玻片，避免产生气泡。
    15. 等待 Vectashield 固化（约 20 分钟）。
    16. 切片在分析前需避光保存。
    17. 所有对照切片均在不加一抗的条件下进行处理。
    18. 数小时内使用荧光显微镜观察结果。
    19. 从每张晶状体一侧核弓至另一侧核弓之间的上皮细胞核进行计数。使用标准蓝色滤光片观察所有晶状体上皮细胞核（呈蓝色），使用与二抗发射波长匹配的标准滤光片观察 caspase-3 阳性细胞核（呈绿色）。
    20. 记录所有晶状体上皮细胞核数量及阳性细胞核数量。每张切片重复计数三次。

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结果

通过方差分析估算了测量过程中各种变异来源，结果发现，若每只动物进行三次测量，则测量间的方差约为动物间方差的15%。因此，在进行全晶状体分析时，无法进一步提高精度。正交检验揭示了在120小时潜伏期与其他较短潜伏期之间，caspase-3 mRNA水平存在统计学上显著的差异。

体内 紫外辐射暴露可诱导半胱天冬酶-3的表达。

大鼠实验示意图：氯胺酮麻醉，托吡卡胺应用，紫外线辐射暴露。
图1. 紫外线辐射暴露流程示意图。

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讨论

本文描述了可用于研究UVR-B诱导白内障过程中发生的分子事件的方法。

考虑到，目前可获得的大部分信息 体内 由对白化Sprague-Dawley大鼠进行的实验得出紫外线辐射诱发的白内障 7, 16, 17, 18, 19因此，本研究决定采用白化Sprague-Dawley大鼠，大鼠年龄为6周，性别选择雌性，因为与雄性相比，雌性大鼠的尿液致敏性较低。此外，在UVR诱导白内障的严重程度方面，性别之间无显著差异。 20.

所有动物的饲养和处理均遵循眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明。伦理许可由乌普萨拉动物实验伦理委员会批准，批准号为C 29/10。大鼠购自商业养殖场（Taconic，丹麦）。

选择窄带紫外辐射（UVR）光源是为了使UVR光谱分布明确。大鼠晶状体对UVR-B的最大敏感波长约为300 nm。照射剂量选择为1 kJ/m2，低于阈值剂量15。照射时间设定为15分钟...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到了卡罗林斯卡学院KID基金、瑞典辐射防护局、卡罗林斯卡学院眼科研究基金会、Gun och Bertil Stohnes基金会、圣埃里克眼科医院研究基金会、Ögonfonden以及古斯塔夫五世国王与维多利亚王后共济会基金会的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂名称公司目录号备注（可选）
KetalarPfizer15008650 mg/ml
RompunBayer02254520 mg/ml
Oculentum SimplexApoteket, Sweden3361645 g
MydriacylAlcon0035210 mg/ml
平衡盐溶液Alcon0007950055
3.5 µL β-巯基乙醇
NucleoSpin RNA II 总RNA提取试剂盒Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany740955.50
p53 DNA 特异性引物biomers.net GmbH定制
Taq DNA 聚合酶，dNTPackRoche04 728 866 001
琼脂糖SigmaA5093
溴化乙锭溶液 0.5 mg/mlSigmaE1385
Nano-Drop ND-1000 分光光度计NanoDrop Products
1st 链 cDNA 合成试剂盒（用于 RT-PCR，AMV）Roche Diagnostics GmbH11 483 188 001
iCycler MyiQ 单色实时 PCR 检测系统Bio-Rad Laboratories
96 孔板Sarstedt72.1979.202
TaqMan 基因表达主混合液Applied Biosystems4369016
TaqMan 基因表达检测 - Caspase 3Applied BiosystemsRn00563902_m1
TaqMan 基因表达检测 - 18SApplied BiosystemsHs99999901_s1
MyiQ 软件Bio-Rad Laboratories
裂解型 Caspase-3（Asp175）Cell Signaling Technology9661
抗兔 IgGAbcamAb6798
蔗糖Sigma Aldrich84097
VectashieldVector Laboratories
通用显微镜 Axioplan 2 ImagingCarl Zeiss
多聚甲醛Sigma Aldrich441244
TBE 缓冲液 10×PromegaV4251

参考文献

  1. Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
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