分子机制的表征 体内 UVR 诱导的白内障

摘要

白内障是全球致盲的首要原因。太阳紫外线辐射（UVR）是白内障发生的主要危险因素。目前已建立远紫外B波段（UVR-B）诱导白内障的动物模型。本文介绍白内障形成的研究方法：紫外线辐射暴露、定量RT-PCR和免疫组织化学。

摘要

白内障是全球致盲的首要原因¹。世界卫生组织将白内障定义为眼睛晶状体混浊，阻碍光线传递。白内障是一种多因素疾病，与糖尿病、吸烟、紫外线辐射（UVR）、酒精、电离辐射、类固醇和高血压相关。已有大量实验证据^2-4和流行病学证据^5,6表明，UVR可导致白内障。我们建立了适用于麻醉⁷和非麻醉动物⁸的UVR B诱导白内障动物模型。

目前白内障的唯一治愈方法是手术，但这种治疗并非所有人都能获得。据估计，若能将白内障的发病时间延迟10年，对白内障手术的需求可减少50%⁹。为了延缓白内障的发生，有必要深入了解白内障形成的机制，并找到有效的预防策略。在白内障发展的诸多机制中，细胞凋亡在人类和动物白内障的起始过程中起着关键作用¹⁰。我们近期的研究重点是晶状体中的细胞凋亡作为白内障发展的机制^8,11,12。预计对紫外线辐射（UVR）对细胞凋亡通路影响的更深入理解，将有助于发现新的药物以预防白内障。

本文中，我们描述了如何通过实验方法诱导白内障 体内 暴露于UVR-B。进一步介绍RT-PCR和免疫组织化学作为研究UVR-B诱导白内障分子机制的工具。

方案

1. 紫外辐射暴露

1. 照射前15分钟，通过腹腔注射给予雌性Sprague-Dawley大鼠90 mg/kg Ketalar（氯胺酮）和10 mg/kg Rompun（赛拉嗪）混合物进行麻醉。
2. 将动物置于大鼠固定器中，并收紧绑带，直至大鼠固定不动但未造成躯干受压¹³。
3. 在大鼠双眼滴加Mydriacyl（托吡卡胺），浓度为10 mg/ml，以诱导散瞳。
4. 将动物放置妥当，使其一只眼睛对准波长为300 nm¹⁴、半高全宽为10 nm的窄束UVR照射，另一只眼睛用黑色胶带遮蔽。
5. 对大鼠单侧眼睛以300 nm波长、1 kJ/m²的亚阈值剂量UVR-B照射15分钟¹⁵。

2. 解剖

1. 在预定的暴露后时间点（1、5、24 和 120 小时），通过二氧化碳窒息法处死六周龄大鼠（体重 < 200 g），并辅以颈椎脱位。
2. 摘除眼球，随后将眼球角膜朝下、后部朝上放置。用27号套管针刺出一个微小孔洞，并沿巩膜表面切向推进，以避免损伤紧邻巩膜的晶状体。然后使用眼科手术剪在角膜缘后方作环形剪切，直至可将巩膜后部掀起。接着用钝性弯镊轻轻提起晶状体。
3. 在显微镜下清除晶状体赤道部残留的睫状体组织，晶状体在平衡盐溶液中存放时间不得超过5–10分钟。

结果

通过方差分析估算了测量过程中各种变异来源，结果发现，若每只动物进行三次测量，则测量间的方差约为动物间方差的15%。因此，在进行全晶状体分析时，无法进一步提高精度。正交检验揭示了在120小时潜伏期与其他较短潜伏期之间，caspase-3 mRNA水平存在统计学上显著的差异。

体内 紫外辐射暴露可诱导半胱天冬酶-3的表达。

图1. 紫外线辐射暴露流程示意图。

讨论

本文描述了可用于研究UVR-B诱导白内障过程中发生的分子事件的方法。

考虑到，目前可获得的大部分信息 体内 由对白化Sprague-Dawley大鼠进行的实验得出紫外线辐射诱发的白内障 ^{7, 16, 17, 18, 19}因此，本研究决定采用白化Sprague-Dawley大鼠，大鼠年龄为6周，性别选择雌性，因为与雄性相比，雌性大鼠的尿液致敏性较低。此外，在UVR诱导白内障的严重程度方面，性别之间无显著差异。 ²⁰.

所有动物的饲养和处理均遵循眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明。伦理许可由乌普萨拉动物实验伦理委员会批准，批准号为C 29/10。大鼠购自商业养殖场（Taconic，丹麦）。

选择窄带紫外辐射（UVR）光源是为了使UVR光谱分布明确。大鼠晶状体对UVR-B的最大敏感波长约为300 nm。照射剂量选择为1 kJ/m²，低于阈值剂量¹⁵。照射时间设定为15分钟.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂名称	公司	目录号	备注（可选）
Ketalar	Pfizer	150086	50 mg/ml
Rompun	Bayer	022545	20 mg/ml
Oculentum Simplex	Apoteket, Sweden	336164	5 g
Mydriacyl	Alcon	00352	10 mg/ml
平衡盐溶液	Alcon	0007950055
3.5 µL β-巯基乙醇
NucleoSpin RNA II 总RNA提取试剂盒	Macherey-Nagel GmbH&Co, Duren, Germany	740955.50
p53 DNA 特异性引物	biomers.net GmbH	定制
Taq DNA 聚合酶，dNTPack	Roche	04 728 866 001
琼脂糖	Sigma	A5093
溴化乙锭溶液 0.5 mg/ml	Sigma	E1385
Nano-Drop ND-1000 分光光度计	NanoDrop Products
1st 链 cDNA 合成试剂盒（用于 RT-PCR，AMV）	Roche Diagnostics GmbH	11 483 188 001
iCycler MyiQ 单色实时 PCR 检测系统	Bio-Rad Laboratories
96 孔板	Sarstedt	72.1979.202
TaqMan 基因表达主混合液	Applied Biosystems	4369016
TaqMan 基因表达检测 - Caspase 3	Applied Biosystems	Rn00563902_m1
TaqMan 基因表达检测 - 18S	Applied Biosystems	Hs99999901_s1
MyiQ 软件	Bio-Rad Laboratories
裂解型 Caspase-3（Asp175）	Cell Signaling Technology	9661
抗兔 IgG	Abcam	Ab6798
蔗糖	Sigma Aldrich	84097
Vectashield	Vector Laboratories
通用显微镜 Axioplan 2 Imaging	Carl Zeiss
多聚甲醛	Sigma Aldrich	441244
TBE 缓冲液 10×	Promega	V4251