方法文章

in ovo 鸡胚中脑电穿孔技术用于研究多巴胺能神经元发育中基因功能

DOI：

10.3791/4017

⸱

2012年8月3日

 ,  , 
1Northwestern University Feinberg School of Medicine, Children's Hospital of Chicago Research Center, 2Departments of Pediatrics, Neurology and Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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为了评估中脑多巴胺能神经元发育过程中基因的功能及其调控机制，我们描述了一种方法，该方法涉及将质粒DNA构建体进行卵内电穿孔转染至鸡胚中脑腹侧多巴胺能神经元前体细胞中。in ovo 电穿孔技术可用于高效表达目的基因，从而研究中脑发育及多巴胺能神经元分化的不同方面。

摘要

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位于腹侧中脑的多巴胺能神经元调控运动、情绪行为以及奖赏机制1-3。腹侧中脑多巴胺能神经元功能障碍与帕金森病、精神分裂症、抑郁症和痴呆相关1-5。因此，研究中脑多巴胺能神经元分化的调控机制不仅有助于深入理解中脑发育及神经前体细胞命运决定的机制，还可为多种人类神经系统疾病的治疗提供新的策略。

多巴胺能神经元由位于胚胎中脑腹侧室管膜区的神经前体细胞分化而来。神经前体细胞的发育受到基因表达程序的调控6,7。本文报道了利用电穿孔技术在哈姆林–汉密尔顿（Hamburger Hamilton, HH）11期（13个体节，42小时）鸡胚中脑中特异性表达基因的方法8,9。鸡胚的体外发育特性使其在特定胚胎时期便于进行实验操作，并可在后续发育时间点观察其效应10-13。在HH 13期（19个体节，48小时）之前的鸡胚神经管中含有具有多向分化潜能的神经前体细胞，能够分化为神经系统中不同类型的细胞。pCAG载体包含CMV启动子和鸡β-actin增强子，可在鸡胚神经管中实现Flag标签或其他表位标签构建体的高效表达14。本研究重点介绍实现胚胎中脑多巴胺能神经元前体细胞区域特异性基因表达的特殊措施，包括如何将DNA构建体特异性地注射至胚胎中脑区域，以及如何使用定制的小型电极精确定位电穿孔位置。对后期鸡胚中脑的分析为利用质粒载体进行中脑发育过程中的基因功能获得性与功能缺失性研究提供了理想的体内系统。对该实验体系的改进还可将其应用扩展至神经系统其他区域，用于细胞命运图谱分析及基因表达调控机制的研究。

方案

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1. 试剂准备（视频中未展示）

  1. 用1X PBS配制新鲜的1X青霉素/链霉素（Pen/Strep）稀释液，总量不超过50 mL。使用0.22 μm针头滤器过滤。
  2. 通过混合所需的质粒构建体来制备注射用构建体。我们将所有构建体置于pCAG-Flag载体中，并按适当化学计量比混合至终体积约10 μL。此外，应加入pCAG-GFP14或pCAG-mCherry以追踪电穿孔效率及被电穿孔的细胞。本实验中我们使用pCAG-mCherry。最后，向质粒DNA混合物中加入经0.22 μm滤膜过滤的快绿（Fast Green）染料，使其终浓度为0.05%，以便观察注射至鸡胚中脑的效率。

2. 卵母细胞准备（视频中）

  1. 为了获得HH 11期的胚胎，受精后的鸡蛋需在100 °F（37.8 °C）条件下孵育约41小时，湿度保持在25%-40%。将鸡蛋侧放，并用铅笔在顶端做一标记。将蛋盘放入预热并加湿的孵育箱中。通过将孵育箱托盘的翻转功能设置为“自动”来缓慢摇动鸡蛋。每24小时检查一次湿度和水位。
  2. 实验开始前，将鸡蛋从孵育箱中取出，并置于室温下。这有助于减缓胚胎发育，防止过度发育。
  3. 用70%乙醇清洁每个鸡蛋表面，并用无尘纸擦拭干净。
  4. 取两段4 cm长的透明胶带，将它们并排贴在鸡蛋表面，覆盖铅笔标记处，形成一个较大的矩形区域。将胶带紧贴蛋壳表面抚....

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讨论

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这 在卵内 电穿孔法转染鸡胚中脑为制备转基因或基因敲除动物提供了一种低成本且快速的替代方案 体内 研究基因功能在中脑多巴胺能神经元发育中的作用。使用长度为2毫米的L形铂电极，结合胚胎中脑特异性DNA注射，是实现目的基因在中脑多巴胺能神经元前体细胞中高效表达的关键。此外，选用正确的Hamburger-Hamilton（HH）11期鸡胚至关重要。原因如下：首先，在HH 11期，鸡胚中脑的发育已足够成熟，前脑、中脑和后脑在形态上可清晰区分，这有助于准确地将注射针和电极定位至中脑区域，从而实现高效的DNA注射与转染。其次，在HH 11期，鸡胚的前神经孔尚未完全闭合，使得注射的质粒DNA能够更容易地进入中脑区域。前脑、中脑与后脑之间狭窄的连接区域也有助于防止注入中脑的DNA构建体快速扩散。最后，较晚阶段的胚胎倾向于将头部向神经轴侧面弯曲，使得电极难以精确靶向中脑区域。获得HH 11期胚胎所需的孵化时间可能因孵化温度的微小差异以及蛋与蛋之间的自然差异而略有不同。在我们的实验条件下，在100 °F下孵化约需41小时。

为了获得用于分析的鸡胚中脑切片，以正确的方.......

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披露

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作者无潜在的利益冲突需要披露。

致谢

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我们感谢松田隆彦博士提供了pCAG-mCherry质粒。YCM获得了Schweppe基金会职业发展奖和Whitehall基金会资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
受精鸡卵Charles River Laboratories
卵孵化箱GQF Manufacturing1502 Sportsman
BTX 电穿孔仪BTX Harvard ApparatusECM830
电极BTX Harvard Apparatus45-0162 L形电极与ECM830电穿孔仪配合使用
铂铱合金丝Alfa Aesar#10056直径0.5 mm
用于制作2 mm长的电极
玻璃毛细管World Precision InstrumentTW100F-4
微量移液器吸头Eppendorf5242 956.003
印度墨水Staples使用前过滤20%
微量注射器Parker Automation,
Parker Hannifin Cooperation		Picospritzer III
荧光解剖显微镜LeicaMZ16F
微电极拉制仪Sutter InstrumentD-97

参考文献

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  1. Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
  2. Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci.

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mCherry

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