in ovo 鸡胚中脑电穿孔技术用于研究多巴胺能神经元发育中基因功能

摘要

为了评估中脑多巴胺能神经元发育过程中基因的功能及其调控机制，我们描述了一种方法，该方法涉及将质粒DNA构建体进行卵内电穿孔转染至鸡胚中脑腹侧多巴胺能神经元前体细胞中。in ovo 电穿孔技术可用于高效表达目的基因，从而研究中脑发育及多巴胺能神经元分化的不同方面。

摘要

位于腹侧中脑的多巴胺能神经元调控运动、情绪行为以及奖赏机制^1-3。腹侧中脑多巴胺能神经元功能障碍与帕金森病、精神分裂症、抑郁症和痴呆相关^1-5。因此，研究中脑多巴胺能神经元分化的调控机制不仅有助于深入理解中脑发育及神经前体细胞命运决定的机制，还可为多种人类神经系统疾病的治疗提供新的策略。

多巴胺能神经元由位于胚胎中脑腹侧室管膜区的神经前体细胞分化而来。神经前体细胞的发育受到基因表达程序的调控^6,7。本文报道了利用电穿孔技术在哈姆林–汉密尔顿（Hamburger Hamilton, HH）11期（13个体节，42小时）鸡胚中脑中特异性表达基因的方法^8,9。鸡胚的体外发育特性使其在特定胚胎时期便于进行实验操作，并可在后续发育时间点观察其效应^10-13。在HH 13期（19个体节，48小时）之前的鸡胚神经管中含有具有多向分化潜能的神经前体细胞，能够分化为神经系统中不同类型的细胞。pCAG载体包含CMV启动子和鸡β-actin增强子，可在鸡胚神经管中实现Flag标签或其他表位标签构建体的高效表达¹⁴。本研究重点介绍实现胚胎中脑多巴胺能神经元前体细胞区域特异性基因表达的特殊措施，包括如何将DNA构建体特异性地注射至胚胎中脑区域，以及如何使用定制的小型电极精确定位电穿孔位置。对后期鸡胚中脑的分析为利用质粒载体进行中脑发育过程中的基因功能获得性与功能缺失性研究提供了理想的体内系统。对该实验体系的改进还可将其应用扩展至神经系统其他区域，用于细胞命运图谱分析及基因表达调控机制的研究。

方案

1. 试剂准备（视频中未展示）

1. 用1X PBS配制新鲜的1X青霉素/链霉素（Pen/Strep）稀释液，总量不超过50 mL。使用0.22 μm针头滤器过滤。
2. 通过混合所需的质粒构建体来制备注射用构建体。我们将所有构建体置于pCAG-Flag载体中，并按适当化学计量比混合至终体积约10 μL。此外，应加入pCAG-GFP¹⁴或pCAG-mCherry以追踪电穿孔效率及被电穿孔的细胞。本实验中我们使用pCAG-mCherry。最后，向质粒DNA混合物中加入经0.22 μm滤膜过滤的快绿（Fast Green）染料，使其终浓度为0.05%，以便观察注射至鸡胚中脑的效率。

2. 卵母细胞准备（视频中）

1. 为了获得HH 11期的胚胎，受精后的鸡蛋需在100 °F（37.8 °C）条件下孵育约41小时，湿度保持在25%-40%。将鸡蛋侧放，并用铅笔在顶端做一标记。将蛋盘放入预热并加湿的孵育箱中。通过将孵育箱托盘的翻转功能设置为“自动”来缓慢摇动鸡蛋。每24小时检查一次湿度和水位。
2. 实验开始前，将鸡蛋从孵育箱中取出，并置于室温下。这有助于减缓胚胎发育，防止过度发育。
3. 用70%乙醇清洁每个鸡蛋表面，并用无尘纸擦拭干净。
4. 取两段4 cm长的透明胶带，将它们并排贴在鸡蛋表面，覆盖铅笔标记处，形成一个较大的矩形区域。将胶带紧贴蛋壳表面抚平。窗口将在此区域打开。胶带可防止切开窗口时小块蛋壳脱落。
5. 使用10 mL注射器和18½号针头从鸡蛋中抽出5 mL蛋清。刺穿蛋壳后，应将针头朝远离卵黄的方向倾斜，以免在抽取蛋清时干扰或损伤胚胎。在处理不同鸡蛋之间，需用70%乙醇清洁针头，但务必确保针头干燥后再刺入下一个鸡蛋。

3. 玻璃注射针的制备（见视频）

1. 使用 Sutter Instrument 型号 P-97 的 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪（Flaming/Brown Micropipette Puller）按以下参数制备注射针：加热温度 670，拉力 120，速度 40，时间 165。采用 World Precision Instruments（API）4 英寸 1.0 mm 薄壁毛细玻璃管（API TW100F-4）制备针头。
2. 使用 P10 移液器和长尖端毛细管上样吸头（Eppendorf 5242956.003）将拉制好的玻璃针头装样。根据需注射的卵数量，装入 5–10 μL 样品。缓慢填充玻璃针头，形成连续的质粒溶液液柱，避免产生气泡。
3. 将装样后的针头插入连接于显微操作仪（Narishige MM3）和 Picospritzer III 微注射仪的针头夹持器中。在解剖显微镜下观察针头，并在绿色液体末端处剪断针尖。使用深色背景有助于更清晰地观察针头。合适的针尖修剪需通过练习掌握。

4. 中脑/神经管注射（见视频）

1. 使用弹簧剪在蛋壳上剪出一个直径为2-2.5 cm的窗口。从先前抽取蛋清时所制造的针孔处开始剪切，并在剪切过程中用手旋转鸡蛋。每处理完一个鸡蛋后，务必用浸有70%乙醇的Kimwipe擦拭剪刀以清洁消毒。
2. 在解剖显微镜下观察鸡胚。可能需要适当调整视线以适应观察。可通过在鸡胚下方注入经0.22 μm滤膜过滤的含20%印度墨汁的PBS溶液来帮助识别胚胎结构。然而，我们发现应尽可能避免此步骤，因其往往会降低胚胎存活率。
3. 注射时，若胚胎的方位与注射针路径平行，且头部远离注射针，则效果最佳。以与中脑-后脑交界处呈45度角的方向缓慢刺入神经管。关键在于仅将质粒DNA和快绿染料注入代表中脑的神经泡内，避免明显扩散至前脑和后脑区域。初始注射可将Picospritzer微注射仪的脉冲持续时间设为25 ms；具体时间可能需根据针头修剪情况进行调整。通常使用10-50 ms的范围。

5. 电穿孔（视频中）

1. 取出注射针。在胚胎所在的蛋内加入3滴含有1X青霉素-链霉素的PBS溶液。
2. 检查BTX EMC830电穿孔仪的设置：

   电压：	20 V
   脉冲时长：	25 ms
   脉冲次数：	3
   间隔时间：	500 ms
   极性：	单极

3. 将2 mm长的L形铂电极置于与神经管底部相同水平的位置，使胚胎中脑位于两个相距3 mm的电极中间。将电极与神经管底部对齐对于高效电穿孔腹侧中脑至关重要。为实现中脑特异性电穿孔，我们用两个自制的L形铂电极替换了原有的BTX电极，其尖端较短，长度为2 mm。这些铂电极由直径0.5 mm的铂丝（Alfa Aesar）制成。这种铂电极的长度恰好足以覆盖11期鸡胚的中脑区域（约0.9 mm长），而不会显著影响前脑或后脑区域。踩下BTX脚踏开关一次。每次成功电穿孔时，电极周围应产生气泡。小心地将电极从蛋中取出，并用浸有70%乙醇的Kimwipe擦拭电极。在胚胎所在的蛋内再加入3滴1X青霉素-链霉素溶液。
4. 用一块5 cm × 5 cm的透明包装胶带封住窗口。确保蛋被密封良好，且蛋内容物不与胶带直接接触。

6. 培养与收获

1. 将鸡蛋放回培养箱中，确保培养箱平台的翻转功能处于关闭状态。继续孵育鸡蛋，直至达到所需的HH 23期。
2. 收集存活的胚胎，并按实验条件分别放入盛有PBS的共用培养皿中。在荧光解剖显微镜下筛选胚胎，仅保留表达mCherry的胚胎。
3. 将胚胎转移至24孔板的各个独立孔中，每孔加入1 mL新配制的2%多聚甲醛（PFA），于4 °C固定2–3小时。
4. 用PBS洗涤固定后的胚胎，每次10分钟，共洗涤三次。将胚胎依次置于15%和30%蔗糖溶液中，直至充分平衡。胚胎最初会漂浮在蔗糖溶液中，平衡后会下沉。
5. 在荧光解剖显微镜下检查胚胎，记录每个胚胎的mCherry表达模式和表达水平。将每个胚胎包埋于OCT包埋剂中。正确调整胚胎方向对于获得理想的中脑横切面以进行后续分析至关重要（图1）。
6. 使用Leica CM3050S冷冻切片机制备厚度为18 μm的中脑切片。通过使用适当的细胞类型标志物进行免疫染色，分析中脑发育及多巴胺能神经元的分化情况。

7. 代表性结果

电穿孔及分析鸡胚中脑的示意图见图1。在成功注射并进行电穿孔的鸡胚中，经过进一步发育后，中脑区域应可见mCherry的表达（图2A、B、C）。假设mCherry的表达与共电穿孔的其他基因表达相关，则可对表现出正确mCherry表达的胚胎进行固定和包埋，以制备中脑冷冻切片用于后续研究（图2D）。通常情况下，使用上述方案可有效转染约50%的腹侧中脑神经前体细胞。通过mCherry与Flag标签基因以及多巴胺能神经元标志物（如酪氨酸羟化酶（TH））的共定位，可检测电穿孔神经前体细胞向多巴胺能命运的特化情况（图3）。通过使用不同前体细胞区域标志物对冷冻切片进行共免疫染色，可研究腹侧中脑前体细胞区域的模式形成。

mCherry 表达不足表明外源基因可能未被有效表达。处于此条件下的胚胎不应用于后续研究。同样，未能存活至实验程序结束的胚胎也不能用于数据收集和分析。

图1. 胚胎鸡中脑 in ovo 电穿孔实验示意图。将pCAG-mCherry与含快绿染料的目的基因混合后注射到Hamburger-Hamilton（HH）11期的胚胎鸡胚中，以便观察注射过程（A）。将DNA构建体注入中脑后，使用方波电穿孔仪进行电穿孔。随后继续孵育鸡胚，直至达到所需的HH 23期。然后收集表达mCherry的胚胎，进行固定和包埋处理（B）。按照图1B中白线所示的切面方向制备中脑冷冻切片，并利用中脑标志物（如酪氨酸羟化酶，TH）进行免疫染色分析（C）。 点击此处查看大图。

图2. 鸡胚中脑冷冻切片的制备。孵化41小时后，收集表达mCherry及目的基因的HH 23期鸡胚（A、B和C），经PFA固定、蔗糖处理后，包埋于OCT中用于冷冻切片。需小心调整鸡胚的方向，以确保获得中脑切片。图中显示了典型的鸡胚形态以及获取中脑切片的切割平面（D）。 点击此处查看大图。

图3. 电穿孔处理的中脑切片分析。取mCherry高表达水平的胚胎冷冻切片（A），并用识别Flag标签目的基因的抗体（B）以及中脑多巴胺能神经元标志物TH的抗体（C）进行染色。以电穿孔转染pCAG-mCherry和pCAG-Flag空载体的胚胎中脑作为对照。 点击此处查看大图。

讨论

这 在卵内 电穿孔法转染鸡胚中脑为制备转基因或基因敲除动物提供了一种低成本且快速的替代方案 体内 研究基因功能在中脑多巴胺能神经元发育中的作用。使用长度为2毫米的L形铂电极，结合胚胎中脑特异性DNA注射，是实现目的基因在中脑多巴胺能神经元前体细胞中高效表达的关键。此外，选用正确的Hamburger-Hamilton（HH）11期鸡胚至关重要。原因如下：首先，在HH 11期，鸡胚中脑的发育已足够成熟，前脑、中脑和后脑在形态上可清晰区分，这有助于准确地将注射针和电极定位至中脑区域，从而实现高效的DNA注射与转染。其次，在HH 11期，鸡胚的前神经孔尚未完全闭合，使得注射的质粒DNA能够更容易地进入中脑区域。前脑、中脑与后脑之间狭窄的连接区域也有助于防止注入中脑的DNA构建体快速扩散。最后，较晚阶段的胚胎倾向于将头部向神经轴侧面弯曲，使得电极难以精确靶向中脑区域。获得HH 11期胚胎所需的孵化时间可能因孵化温度的微小差异以及蛋与蛋之间的自然差异而略有不同。在我们的实验条件下，在100 °F下孵化约需41小时。

为了获得用于分析的鸡胚中脑切片，以正确的方...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
受精鸡卵	Charles River Laboratories
卵孵化箱	GQF Manufacturing	1502 Sportsman
BTX 电穿孔仪	BTX Harvard Apparatus	ECM830
电极	BTX Harvard Apparatus	45-0162 L形电极	与ECM830电穿孔仪配合使用
铂铱合金丝	Alfa Aesar	#10056	直径0.5 mm 用于制作2 mm长的电极
玻璃毛细管	World Precision Instrument	TW100F-4
微量移液器吸头	Eppendorf	5242 956.003
印度墨水	Staples		使用前过滤20%
微量注射器	Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation	Picospritzer III
荧光解剖显微镜	Leica	MZ16F
微电极拉制仪	Sutter Instrument	D-97