从大鼠脾细胞制备T细胞生长因子

摘要

我们描述了用于体外扩增抗原特异性大鼠T淋巴细胞系的T细胞生长因子的制备方法。

摘要

在体外培养中维持抗原特异性T细胞系或克隆需要通过多轮抗原诱导的活化，并由细胞扩增阶段间隔开^1,2。在扩增阶段向培养基中添加白细胞介素2对于防止细胞死亡是必要的，且足以维持短期T细胞系，但已被证明会增强Th1极化³。使用含有多种细胞因子混合物的T细胞生长因子（TCGF）替代白细胞介素2，在体外维持长期T细胞系方面比白细胞介素2更为有效³。此外，TCGF可在实验室中大量制备，且成本远低于重组白细胞介素2。

本文展示了如何从大鼠脾细胞培养上清液中制备T细胞生长因子（TCGF）。该实验中，我们取因采集胸腺和血液而被实施安乐死的未经处理的Lewis大鼠的脾脏。将脾脏制备成单细胞悬液，通过渗透压休克法裂解红细胞，然后将脾细胞接种于培养基中。使用刀豆蛋白A（concanavalin A）刺激细胞，这是一种有丝分裂原，可非选择性地激活所有大鼠T淋巴细胞，从而诱导细胞因子的产生。48小时后收集培养上清液，并加入α-甲基甘露糖苷以结合过量的刀豆蛋白A，防止其在后续应用中激活将要添加TCGF的T细胞系。随后，将TCGF进行无菌过滤，分装后于-20°C保存。

方案

1. 取Lewis大鼠脾脏（160-200 g的大鼠最佳）。在含有PBS加抗生素（PBS-PS）的培养皿中，于冰上使用细胞筛网进行充分剪碎。将组织悬液转移至50 ml离心管中，并用PBS-PS充满离心管。
2. 在4°C下离心10分钟，使细胞沉淀。
3. 用PBS-PS洗涤细胞两次。
4. 用0.15 M NH₄Cl溶液（每只脾脏5 ml）重悬细胞沉淀。在冰上轻轻且持续地用移液器吹打混匀3分钟，以裂解红细胞。然后用培养基充满离心管。
5. 在4°C下离心10分钟，使细胞沉淀。
6. 用PBS-PS洗涤细胞两次。
7. 计数细胞。每只大鼠脾脏可获得2亿至2.5亿个细胞。
8. 将细胞以每毫升200万个的密度接种于完全培养基中：每75 cm²培养瓶加入50 ml培养基。
9. 在培养箱中培养48小时。
10. 在4°C下离心15分钟，使细胞沉淀。
11. 收集上清液；弃去细胞沉淀。
12. 向上清液中加入15 mg/ml的甲基甘露糖苷，充分混匀。
13. 过滤（0.2 mm）。
14. 分装后于-20°C保存。必要时可在4°C保存10天。

讨论

我们使用Lewis大鼠的脾细胞制备T细胞生长因子（TCGF），因为我们会定期处死该品系的未免疫大鼠，以收集血清和胸腺组织，用于体外刺激Lewis大鼠T细胞系。这种TCGF也可用于促进其他品系大鼠T细胞系的生长和存活。TCGF同样可以从其他品系的大鼠中制备。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS，1×，无菌	试剂	GIBCO，by Life Technologies	14040-182
青霉素/链霉素 100×	试剂	Sigma-Aldrich	P0781	取 5 ml 100× 溶液加入 500 ml PBS 中，配制 PBS-PS
细胞筛，70 µm 孔径	工具	Fisher Scientific	08-771-2
氯化铵（NH₄Cl）	试剂	Sigma-Aldrich	A0171	用无菌蒸馏水配制 0.15 M 溶液，保持低温
RPMI 1640	试剂	GIBCO，by Life Technologies	21870-092
胎牛血清（FCS，FBS）	试剂	GIBCO，by Life Technologies	16140-071	经热灭活处理
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺	试剂	Cambrex/BioWhittaker	17-718R	PSG
RPMI 维生素，100×	试剂	Sigma-Aldrich	R7256
丙酮酸钠，100×	试剂	Sigma-Aldrich	S8636
非必需氨基酸，100×	试剂	Sigma-Aldrich
β-巯基–乙醇	试剂	Sigma-Aldrich	M7522
α-甲基甘露糖苷	试剂	Sigma-Aldrich	M6882
刀豆蛋白 A	试剂	Sigma-Aldrich	M6882
配制完全培养基：向 500 ml RPMI 1640 培养基中加入以下成分，过滤除菌：10% FCS；1 瓶 PSG；5 ml RPMI 维生素；5 ml 丙酮酸钠；5 ml 非必需氨基酸；50 µM β-巯基–乙醇；2 µg/ml 刀豆蛋白 A。