通过添加滑石微粒定制Aspergillus niger的形态

摘要

本文描述了一种精确生成并全面表征丝状真菌Aspergillus niger形态的方法，该方法可实现形态特征与生产性能之间的数学关联。

摘要

丝状真菌A. niger 是一种广泛应用于从食品到制药工业等多个工业生产过程中的菌株。这种丝状生物最引人注目且常常难以控制的特征之一是其复杂的形态，其形态可从致密的球形菌团到黏稠的菌丝体不等（图1）。已知多种工艺参数和培养基成分会影响真菌的形态¹。由于最佳生产效率与特定的形态形式密切相关，真菌的形态通常成为工业生产中提高产量的瓶颈。

一种直接且简洁的方法是通过向培养基中添加无机不溶性微粒（如水合硅酸镁、氧化铝或硅酸钛氧化物），以精确控制形态形状，从而提高酶的产量^2-6。由于微粒依赖的形态与酶产量之间存在明显相关性，因此有必要在数学上将生产效率与形态特征关联起来。为此，需要实现一种定量、精确且全面的形态学描述。

因此，我们提出一种方法，用于生成和表征依赖微粒的形态结构，并将真菌形态与生产性能相关联（图1），这可能有助于更深入地理解丝状微生物的形态发生过程。

重组菌株 A. niger SKAn1015 在3 L搅拌式生物反应器中培养72 h。在接种前添加浓度分别为1 g/L、3 g/L和10 g/L的滑石微颗粒，可重复地诱导产生多种形态结构。分别在24、48和72小时无菌取样，用于测定生长进程及所产酶的活性。所形成的产物为高价值酶β-呋喃果糖苷酶，这是一种在食品或制药工业中用于新糖合成的重要生物催化剂，可催化蔗糖转化为葡萄糖等反应^7-9。因此，加入蔗糖后葡萄糖的定量可反映所产β-呋喃果糖苷酶的量。葡萄糖的定量采用GOD/POD法测定¹⁰，并针对96孔微孔板的高通量分析进行了改良。

培养72小时后，通过显微镜观察真菌形态，并利用数字图像分析进行表征。采用开源图像处理程序ImageJ，计算表征真菌宏观形态的颗粒形态因子，如Feret直径、投影面积、周长、圆形度、长宽比、圆整度和实心度。将相关参数组合为一个无量纲的形态学数值（Mn）¹¹，以实现对真菌形态的全面表征。通过数学回归分析，凸显了形态学数值与生产效率之间的密切相关性。

方案

1. 反应器设置与培养启动

总共进行4次生物反应器培养。

1. 使用工作体积为 2.2 L 的 3 L 机械搅拌罐式生物反应器培养 A. niger SKAn1015。
2. 将 72.6 g 一水葡萄糖倒入反应器中，并加入 1.9 L 去离子水至所需体积。
3. 安装反应器设备，包括 3 块挡板、一个双六叶圆盘涡轮搅拌器、pH 电极、带空气过滤器的气体入口、冷却指、带空气过滤器的排气冷却器，以及用于无菌取样的浸入管和用于培养基、接种物、酸和碱的带空气过滤器的进液软管。
4. 在 121 °C 下对反应器进行 20 分钟的高压灭菌。
5. 将反应器连接至酸碱储液瓶（2 M HCl，2 M NaOH）及相应泵，并通过 pH 控制单元将 pH 值设定为 5.0 ± 0.05。
6. 将反应器连接至冷却水系统，并将加热夹套包裹在反应器容器外部。
7. 安装温度传感器及其相应的控制单元，并通过温度控制单元将温度设定为 37 ± 0.1 °C。
8. 将搅拌电机安装在反应器顶部，并以 200 min^-1 的搅拌速度启动运行。
9. 通过其中一个无菌进液软管加入无菌基础培养基¹¹（250 mL）。培养基配制时，所有组分均在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟后混合。对于三次培养，分别在培养基中加入滑石粉（3MgO•4SiO₂•H₂O），浓度分别为 1 g/L（反应器 2）、3 g/L（反应器 3）和 10 g/L（反应器 4）。使用前，将微粒悬浮于 50 mM 醋酸钠缓冲液（pH 6.5）中，然后加入无菌培养基。对照培养（不含微粒）中，以 50 mM 醋酸钠缓冲液（pH 6.5）替代微粒悬浮液。
10. 通过其中一个无菌进液软管加入按 Wucherpfennig 等（2011）¹¹ 方法制备的孢子悬浮液（接种物）（50 mL），使孢子终浓度达到 1×10⁶ mL^-1。接种时刻标记为培养开始时间（h = 0 h）。
11. 以 1.0 L min^-1 的流速开始通气。

2. 培养 24、48 和 72 小时后的无菌取样

1. 取50 mL无菌培养液至一个螺口管中。
2. 使用样品测定生物量干重、β-呋喃果糖苷酶活性及进行显微分析。

3. 培养24、48和72小时后生物量干重的测定

1. 生物量样品应至少取两份平行样。
2. 将纤维素滤膜在干燥器中干燥后，用微量天平称重，并将其放入布氏漏斗中，连接水流抽气泵。
3. 过滤一定体积的样品（例如 10 mL），并用 10 mL 去离子水冲洗滤膜，以去除生物量中的培养基成分。
4. 将滤膜在中间折叠一次，放入玻璃培养皿中，置于隔间干燥器中直至恒重（至少 24 小时）。
5. 在干燥器中冷却滤膜后称重。
6. 生物量干重的计算公式为：滤膜与干燥后生物量的总重量减去空白滤膜重量，再除以所用样品体积。

4. 培养24、48和72小时后通过GOD/POD法测定β-呋喃果糖苷酶的胞外酶活性

处理样本时，应始终将其置于冰上保存。

1. 用注射器将1.5 mL培养液悬浮液通过醋酸纤维素滤膜过滤至反应管中。将反应管储存于-20 °C，待用。
2. 取20 μL样品作为反应体系，并加入200 μL溶于0.05 M磷酸缓冲液（pH 5.4）中的1.65 M蔗糖溶液，以启动蔗糖转化为葡萄糖的反应。该反应至少需设两个重复。
3. 将反应体系置于40 °C加热块中孵育20分钟。随后在95 °C加热块中孵育10分钟以终止反应。将反应体系置于冰上冷却，并在4 °C下以13,000 g离心10分钟，去除冷凝水。
4. 为校正因pH和温度导致的蔗糖非酶促水解为葡萄糖的影响，设置空白对照，即用20 μL去离子水替代20 μL样品进行相同操作。
5. 为校正培养液中残留的葡萄糖含量，需为每个样品设置阴性对照。具体操作为：取20 μL样品，先在95 °C加热10分钟以灭活β-呋喃果糖苷酶，再加入蔗糖，并按步骤4.3所述条件孵育。
6. 稀释样品，使后续测定的吸光度值处于标准曲线的线性范围内。
7. 所有酶学测定均需设三个重复。在微孔板的每个孔中加入2 μL稀释后的样品。同时在微孔板上设置标准曲线：分别用2 μL十种已知浓度（1 mM至15 mM）的葡萄糖溶液替代2 μL样品，每种浓度各设一孔，用于校准；零点校准则使用2 μL去离子水替代2 μL样品。
8. 使用多通道移液器向各孔中加入200 μL试剂溶液。
9. 室温下孵育反应体系10分钟。
10. 将微孔板储存于6 °C，直至检测（最多数小时内完成）。
11. 使用96孔Sunrise酶标仪及Magellan数据采集软件，在450 nm波长下测定吸光度。设置混匀时间为5秒，静置时间为1秒。
12. 在电子表格中打开结果图表，并利用标准曲线数据绘制校准线：
    葡萄糖浓度 = a × 吸光度 + b
    
13. 计算酶活性：
    活性 = (吸光度 × 稀释倍数 - 空白值) × a + b
    
14. 通过计算样品活性与相应阴性对照活性之间的差值，确定β-呋喃果糖苷酶的活性。
15. 结合生物量干重与β-呋喃果糖苷酶活性，计算比生产速率，供后续使用¹¹。

5. 培养 72 小时后的显微观察与自动图像分析

1. 将约3 mL培养物悬液置于塑料培养皿中，加入生理氯化钠溶液稀释，直至形态结构分离。
2. 将培养皿置于配备集成或连接相机的显微镜下。采集并保存约100张图像（图2每个样本的形态结构数量。注意每张图像中至少有一个物体被完整呈现。
3. 使用图像处理程序 ImageJ 打开同一样本的所有图像¹². 使用“转换为黑白”处理工具（Make Binary）将图像转为黑白图像（图2）。若要将该命令应用于整批图像，请使用如下宏代码。
   运行（,,制作二值图像）
   
4. 使用 ImageJ 再次打开已处理的二值图像。利用“设置测量”分析工具，计算每幅图像的形态学参数，包括 Feret 直径、投影面积、周长、圆形度、长宽比、圆整度和实心度。若需将该命令应用于一系列图像，可使用如下宏代码。
   run("8-bit");
   执行“转为二值图像”；
   运行("设定比例...", "距离=X 已知=1000 像素=1 单位=μm 全球
   run("设置测量...", "面积 周长 形状 Feret直径 限制 显示 重定向=None 小数位数=3");
   运行("分析颗粒...", "大小=10000-无穷大 圆形度=0.00-1.00 显示=轮廓 显示结果");
   确定X为与之相关的像素数量 1000 μm 通过在比例尺上绘制一条直线来确定。将该直线的像素数量与比例尺的实际长度相关联 μm.
5. 在电子表格中打开包含每幅图像形状因子值的结果图表。按如下方法为每幅图像计算形态学数值。
   
6. 计算一个样本所有图像的形态学数值的平均值和标准偏差。
7. 使用绘图与数据分析软件对形态学数值与比生产率进行图形相关性分析，并通过数学回归确定其数学关系。

6. 典型结果

通过添加滑石微粒，A. niger SKAn 1015 的形态从典型的菌球形态转变为分散或甚至菌丝形态。在标准条件下表现为菌球形态，而在培养基中添加 10 g/L 滑石微粒后则形成菌丝形态（图4）。同时，β-呋喃果糖苷酶的活性提高约 3 倍^3-5。添加 1 或 3 g/L 滑石粉则导致分散形态的形成，并使呋喃果糖苷酶活性增加一倍（图4）。

微粒依赖性形态可通过形态数进行综合描述，该形态数可利用自动图像分析确定的参数计算得出。在显微图像中，完全圆形且表面光滑的菌粒表现为完美的圆形，此类颗粒的形态数为1。菌丝体形态的最小碎片可简化为一维线条，其形态数为0。因此，所有介于两者之间的中间形态，如伸长的不规则菌粒或团块，其形态数介于0和1之间。较大的颗粒将产生较高的形态数，而具有较大表面积的真菌颗粒或伸长形颗粒则对应较低的形态数¹¹。

在标准条件下，反应器1中的形态表现出约0.8的形态学数值。添加10 g/L滑石粉的反应器4，其形态学数值（Mn）约为0.1。反应器2和3的滑石粉浓度分别为1 g/L和3 g/L，其形态学数值介于上述两个极端之间，表现出分散的形态特征。由于依赖微粒的形态特征与β-呋喃果糖苷酶的生产率密切相关，因此可获得形态学数值与生产率之间的数学关联关系，如图5所示。

图 1. 实验设计与分析流程的总体方案。A. niger 在 3 L 搅拌式生物反应器中培养 72 小时（可添加或不添加微粒）。在培养 24、48 和 72 小时后取样，测定菌体干重和 β-呋喃果糖苷酶活性，并据此计算比生产速率。培养 48 小时后，通过显微镜观察真菌形态，并采用数字图像分析进行表征。图像分析的相关参数被整合为一个形态学数值，该数值与比生产速率在数学上具有相关性。

图2. 对来自A. niger的形态结构显微图像进行图像处理的步骤。步骤1：通过显微镜进行图像采集。步骤2：如有必要，对图像进行增强处理。步骤3：图像二值化，使用ImageJ生成黑白（二值）图像。步骤4：对二值图像进行处理，并清除不需要的对象。步骤5：利用开源程序ImageJ中的“分析颗粒”功能进行形态学分析。

图3. A. niger 在不同浓度微粒添加下的多种形态结构。随着微粒浓度的增加，菌体聚集体的尺寸可被精确调控，直至形成微小的核壳结构聚集体、微小菌团，甚至完全分散的菌丝体。通过在 submerged culture（浸没式培养）中添加微粒对 Aspergillus niger SKAn1015 进行形态工程改造。未添加微粒（A）、10 mg/L（B）、0.1 g/L（C）、0.2 g/L（D）、0.3 g/L（E）、0.6 g/L（F）、1.0 g/L（G）、1.5 g/L（H）、2.0 g/L（I）、2.5 g/L（J）、3.0 g/L（K）、3.5 g/L（L）、4.0 g/L（M）、4.5 g/L（N）、5.0 g/L（O）、10 g/L（P）、15 g/L（Q）、20 g/L（R）、30 g/L（S）和 40–50 g/L（T）。图像为培养72小时后通过光学显微镜拍摄。

图4. 果糖呋喃苷酶活性随滑石微粒浓度的变化关系，浓度分别为1 g/L（反应器2）、3 g/L（反应器3）和10 g/L（反应器4）。反应器1未添加微粒，其培养在标准条件下进行。

图 5. 形态学数值与比生产率之间具有代表性的好相关性（R² = 0.91）。横坐标为形态学数值，纵坐标为比生产率。非线性回归得到指数相关关系。

讨论

真菌形态的改造在生物技术领域已受到数十年的关注。不同的研究尝试通过改变特定的工艺参数（如pH值、功率输入、温度、培养基营养成分或接种浓度¹）来调控形态，但这些方法往往存在对形态控制不够精确和不完全、能耗高、抑制效应或产物不稳定等问题。相比之下，添加微粒可通过对微粒尺寸和浓度的精细调节，实现对真菌形态的精确工程化调控。这为利用微粒优化并定制设计高产形态，应用于黑曲霉（A. niger）及其他丝状微生物的生物技术生产，开辟了新的可能性。

数字图像分析是一种易于重复的方法，用于表征真菌的宏观形态。然而，文献中描述的形态结构在大小、形状和表面特征方面的参数种类繁多，使得对真菌形态的快速评估变得复杂。本文提出的形态数，通过整合相关参数，克服了这一缺陷，不仅可用于形态结构的全面表征，还可与生产率进行直接的数学关联。这使得根据给定形态估算生产率成为可能，从而可根据工艺需求定制形态。

利用形态学数值，可以区分不同的菌体颗粒和菌团形态^4,5。为进一步发展该形态学数值，引入分形维数的概念似乎具有前景。分形维数可用于衡量物体的复杂程度及其质量填充特性¹³，因此特别适用于对菌丝体形态进行整体表征。

然而，形成高产的菌丝体形态可能会对工艺性能造成问题，尤其是在大规模培养中，因为先前的研究表明，菌丝体生长形态会导致培养液黏度显著升高²。这会引起传热和传质困难，并形成不流动的非混合区域，从而需要更高的功率输入，使培养过程的运行成本增加¹。因此，在改变菌体形态时，应考虑真菌形态与培养液黏度之间的关系，并将其纳入后续的模型中。