本方案描述了使用低强度脉冲超声刺激培养的成纤维细胞，通过模拟跨膜基质受体syndecan-4的激活，诱导黏着斑的形成和Rac1的活化。该方法可在细胞水平上研究一种已成功应用于临床的技术，从而为优化该疗法提供可能。
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摘要
摘要
在多细胞生物中，细胞行为由其与细胞外基质的相互作用所决定。基质结合所产生的效应包括调控细胞迁移和增殖、分泌活动乃至细胞分化。上述每种复杂过程所依赖的信号均来源于细胞表面细胞外基质受体的分子相互作用。整合素是典型的受体，不仅在细胞外基质与细胞骨架之间提供机械连接，还启动部分黏附依赖性信号级联反应。然而，越来越多的研究表明，其他跨膜受体也与整合素协同作用，共同调控整合素自身及其下游信号。其中最典型的例子是跨膜蛋白聚糖——syndecan-4，它在细胞黏附于纤连蛋白的过程中与α5β1-整合素协同发挥作用。体内模型研究证实了syndecan-4信号传导的重要性，因为syndecan-4基因敲除小鼠由于成纤维细胞迁移效率低下而表现出伤口愈合迟缓1,2。在野生型动物中，成纤维细胞向伤口部位的迁移是由纤连蛋白的出现所触发的，这些纤连蛋白从受损的毛细血管渗出，并由巨噬细胞沉积于受伤组织中。因此，人们迫切希望发现能够增强纤连蛋白依赖性信号传导并加速组织修复过程的策略。
通过使用重组纤连蛋白片段刺激细胞，可以将纤维连接蛋白依赖性信号传导中由整合素介导和由syndecan-4介导的组分分离开来。尽管整合素的结合对于细胞黏附至关重要，但某些纤维连接蛋白依赖性信号由syndecan-4调控。syndecan-4可激活Rac1突出信号3，引起整合素的重新分布1，触发细胞骨架分子（如vinculin）向黏着斑的募集4，从而诱导定向迁移3。我们已寻找激活此类信号的替代策略，发现低强度脉冲超声（LIPUS）可模拟syndecan-4结合所产生的效应5。在本实验方案中，我们描述了如何将强度为30 mW/cm2、频率为1.5 MHz、脉冲频率为1 kHz（图1）的超声应用于培养的成纤维细胞（图2），以诱导Rac1活化和黏着斑形成。超声刺激最长持续20分钟，因为该参数组合已被证明在促进临床骨折修复方面效果最佳6。该方法使用重组纤连蛋白片段激活α5β1-整合素，而不激活syndecan-4，并需通过环己酰亚胺抑制蛋白质合成，以阻断成纤维细胞额外基质的沉积。超声对修复机制的积极作用已有充分文献记载7,8，通过了解超声在体外培养中的分子效应，我们应能进一步优化治疗技术，以改善临床疗效。
方案
1. 用基质配体包被表面
- 将超声应用于3.5 cm孔中的细胞，可使用单个培养皿或6孔板。进行生化检测时，直接将配体包被到塑料表面。进行免疫荧光染色时，将玻璃盖玻片在MilliQ水中煮沸三次，并将4个盖玻片放入每个孔的底部。
- 必须对玻璃表面进行衍生化处理，以确保配体高效包被。将磺基-m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester）溶于PBS中，配制成1 mM溶液。每孔加入2 ml，室温孵育30分钟。
- 用PBS洗涤衍生化表面3次。
- 在衍生化玻璃或未经处理的塑料表面包被整合素配体。每孔加入2 ml含Ca2+和Mg2+的PBS溶液，其中整合素配体9浓度为10 μg/ml，4 °C孵育过夜。
- 通过将1% BSA溶于PBS中，加热至85 °C持续13分钟，制备单颗粒BSA。冷却后，经0.45 μm滤膜过滤。
- 用PBS洗涤配体包被的表面3次，然后用单颗粒BSA封闭30分钟。
2. 细胞的制备
- 为在实验全程控制基质环境，应在80%汇合的成纤维细胞中加入25 μg/ml环己酰亚胺，处理2小时以阻断蛋白质合成。
- 用PBS冲洗经环己酰亚胺处理的细胞，并使用0.5 mg/ml胰蛋白酶/EDTA从培养瓶中消化脱离细胞。
- 将脱离的细胞在500×g离心5分钟，收集细胞沉淀。
- 用含25 μg/ml环己酰亚胺的DMEM/25 mM HEPES重悬细胞。
- 使用血细胞计数板测定细胞悬液密度，并调整至10⁵ ml⁻¹。
- 将细胞在37 °C孵育20分钟，以恢复细胞表面整联蛋白。
- 用PBS将配体包被且经BSA封闭的孔板冲洗3次。
- 每孔接种2 ml细胞悬液。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育2小时，使其充分铺展。
3. 超声刺激
- 将超声发射器阵列和耦合凝胶预热至 37 °C。
- 在每个发射器上涂抹豌豆大小的耦合凝胶。
- 使用超声指示二极管检测器测试每个发射器是否正常工作。
- 将培养板放置在发射器阵列上。将阵列放回 37 °C、5% CO2 环境中，并让温度平衡 10 分钟。
- 开启超声信号。
- 超声信号将在 20 分钟后自动关闭，以模拟治疗方案。若需要更短的刺激时间，应在相应时间点将培养板从阵列中取出。在所有情况下，均应使用未刺激的培养板作为阴性对照。
4. 免疫荧光法分析局灶性黏附
- 为分析黏着斑的形成，施加20分钟超声信号，随后将细胞置于37 °C、5% CO2条件下继续培养40分钟，以促进结构发育。
- 吸除培养基，并加入2 ml含4%多聚甲醛的PBS固定细胞，在室温下孵育14分钟。
- 吸除多聚甲醛溶液，用PBS清洗三次，将PBS沿孔壁轻轻加入，避免产生剪切力。
- 将每个盖玻片从3.5 cm孔转移至24孔板中，用于后续免疫荧光染色。
- 加入0.5 ml含0.1 M甘氨酸的PBS溶液至每个24孔板孔中，以淬灭残留的多聚甲醛，在室温下孵育20分钟。
- 吸除甘氨酸溶液，用PBS清洗三次。
- 加入0.5 ml含0.5% Triton X-100（w/v）的PBS溶液对细胞进行透化处理，在室温下孵育4分钟。
- 吸除Triton X-100溶液，用PBS清洗三次。
- 加入0.5 ml含3%（w/v）BSA的PBS溶液进行封闭，在4 °C下孵育过夜。
- 使用BSA封闭液按1:400比例稀释hVIN-1抗体，对含vinculin的黏着斑进行染色，在室温下孵育1小时。
- 用PBS清洗三次。
- 在BSA封闭液中加入荧光标记的二抗（DyLight 488标记，按1:200稀释）以及TRITC标记的鬼笔环肽（按1:200稀释）对肌动蛋白进行染色，在室温下孵育30分钟。
- 用PBS清洗三次，再用水清洗一次。
- 使用Prolong Gold封片剂将样品倒置封片于载玻片上。
5. 通过下拉实验定量 Rac1 激活
- 为分析 Rac1 活化，将超声信号作用于细胞 20 分钟，条件为 37 °C、5% CO2。若需评估超过 20 分钟的响应时间，则施加超声信号 20 分钟后，继续将细胞维持在 37 °C、5% CO2 环境中直至达到所需时间，以允许响应充分发展。
- 吸除培养基并将培养板置于冰上。每孔用 2 ml 冷 PBS 清洗一次，吸除液体。将孔板倾斜放置 1 分钟以去除残留 PBS，随后彻底吸除。
- 每孔加入 35 μl 裂解缓冲液（10% 甘油、20 mM Hepes pH 7.4、140 mM NaCl、1% NP40、0.5% 脱氧胆酸钠、4 mM EGTA、4 mM EDTA、1 × cOmplete 蛋白酶抑制剂），在冰上裂解细胞。本示例中，每个时间点使用 6 孔，共获得 210 μl 细胞裂解液。可使用更多或更少孔数，但总裂解液体积应约为 200 μl。
- 使用细胞刮充分刮取细胞，确保完全裂解，并将孔板倾斜放置 1 分钟，使裂解液汇集。
- 将裂解液转移至预冷的 1.5 ml 微离心管中（合并相同处理组的裂解液），在 4 °C 下以 21000 × g 离心 2 分钟，沉淀细胞碎片。
- 取 180 μl 裂解液转移至预冷的 1.5 ml 微离心管中，管中已含有 130 μl 裂解缓冲液和 25 μl PAK-谷胱甘肽琼脂糖珠10。剩余粗裂解液保存于 -20 °C，用于后续凝胶分离。
- 在 4 °C 下旋转孵育 40 分钟，使活性 Rac1 结合至 PAK-谷胱甘肽琼脂糖珠上。
- 在 4 °C 下以 2000 × g 离心 1 分钟，收集琼脂糖珠复合物。
- 用 500 μl 裂解缓冲液洗涤珠子复合物三次，每次洗涤后以 2000 × g 离心收集珠子并弃去上清液。每次洗涤后使用 200 μl 移液器小心吸除残留的洗涤缓冲液。
- 每份样品加入 35 μl SDS-PAGE 上样缓冲液，于振荡加热金属块上 85 °C 孵育 5 分钟，进行洗脱。随后在 21000 × g 下离心 1 分钟，去除珠子。
- 通过 SDS-PAGE 分离珠子洗脱液，转膜至硝酸纤维素膜，并使用 Rac1 抗体进行检测。
6. 代表性结果
在本方案中，我们描述了超声波诱导黏着斑蛋白（vinculin）染色的黏着斑及Rac1活性的方法。在黏着斑实验中，基础状态为成纤维细胞在α5β1-整合素配体上铺展时，不会形成含vinculin的黏着斑（图3A），除非通过添加可溶性配体激活另一种纤连蛋白受体——syndecan-4（图3B）3,4。然而，超声刺激可诱导黏着斑的形成，其程度与syndecan-4激活相当（图3C），表明超声刺激可替代纤连蛋白依赖性信号通路中的某些组分5。本方案的关键难点在于消除无刺激条件下黏着斑的自发形成。环己酰亚胺对蛋白质合成的抑制不完全时，会导致细胞外基质沉积，足以引发细胞自刺激。细胞密度过高也可能导致低水平的黏着斑形成，并削弱对超声的响应，因为细胞间接触与细胞-基质接触之间的串扰会干扰旨在分离单一刺激因素的实验。作为基础实验的拓展，我们展示了在缺乏syndecan-4的成纤维细胞中重复该实验的结果（图4）。这些成纤维细胞仍可响应超声刺激（图4C），但对syndecan-4配体无反应（图4B）。使用Sdc4 -/-成纤维细胞的实验表明，超声确实可以绕过某些纤连蛋白受体的需求，并说明如何通过简单的实验方案进一步揭示信号通路的机制信息。
在生化实验中，我们通过下拉实验（pull-down assay）证明超声可诱导Rac1的活化，该方法改编自Del Pozo et al.10所述方法。在启动超声刺激后0、10、30和60分钟沉淀活化的Rac1，结果显示Rac1活性在10–30分钟达到峰值，随后恢复至基础水平（图5）。对粗裂解液进行vinculin印迹以确保各时间点上样量一致。该结果与syndecan-4激活Rac1的模式相似3，但相较于纤连蛋白（fibronectin）诱导的活化过程略为延长。因此，通常需要进行8–10次重复实验才能获得显著的数据。Rac1的活化促使细胞启动局灶性黏附的形成，而新生的局灶性黏附在10–30分钟开始出现，与Rac1的活化时间相吻合。一旦启动，这些黏附结构将继续成熟，最终形成如图3和图4所示的大型黏附斑。
图1. 超声波波形。超声波包含一个间歇性的1.5 MHz信号，由于其振幅较低（30 mW/cm2，空间平均，时间平均），不会产生加热效应。
图2. 细胞制备及超声刺激工作流程的示意图。
图3. 超声诱导成纤维细胞中黏着斑的形成。成纤维细胞首先铺展在纤连蛋白的整合素结合片段上（A），随后用纤连蛋白的syndecan-4结合片段（B）或超声（C）进行刺激。刺激60分钟后，固定细胞并进行vinculin和actin染色，通过落射荧光显微镜成像。标尺 = 10 μm。
图4. 超声诱导缺乏syndecan-4的成纤维细胞形成黏着斑。Sdc4 -/-成纤维细胞首先铺展在纤连蛋白的整合素结合片段上（A），随后用纤连蛋白的syndecan-4结合片段（B）或超声（C）进行刺激。刺激60分钟后，固定细胞并用vinculin和actin染色，通过落射荧光显微镜成像。尽管Sdc4 -/-成纤维细胞对纤连蛋白不敏感，超声仍可诱导黏着斑形成，表明超声可绕过基质受体的参与。标尺 = 10 μm。
图 5. 超声激活Rac1。细胞分别接受0、10、30和60分钟的刺激，每个时间点使用6个孔。通过Rac1下拉实验的时间过程样品，经Western blot使用抗Rac1抗体孵育后，检测各时间点样品中GTP-Rac1的含量（上图）。条带强度的定量分析（8–10次重复的平均值）显示，超声信号在10和30分钟时引起Rac1活性升高，至60分钟时恢复至基线水平（图）。误差棒表示标准误（s.e.m）。
讨论
在本实验方案中，我们描述了一种将通常用于人类患者的治疗方法应用于细胞实验的方法。最终目标是阐明超声作用的分子机制，从而优化该疗法。在本方案中，我们采用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为模型细胞系统，但研究也发现超声对原代人包皮成纤维细胞同样有效。 关键词：超声，分子机制，细胞实验，小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs，原代人包皮成纤维细胞 5，间充质干细胞、成骨细胞和软骨细胞 6我们以Rac1活化为例来演示一种生化检测方法，但该方法同样可用于通过免疫共沉淀检测蛋白质磷酸化的调控或蛋白质复合物的形成。在免疫荧光示例中，我们展示了超声对黏着斑形成的影响，但也可用于检测任何分子的重新分布。例如，可检测细胞质因子向质膜的募集、运输囊泡中蛋白质的共定位，或考察超声对有丝分裂纺锤体结构的影响。迄今为止，我们的研究仅限于检测超声对纤连蛋白依赖性通路的作用，未来还可进一步测试超声对细胞在胶原基质上或在生长因子存在条件下的影响，以构建更接近体内复杂环境的超声调控细胞行为的全景图 体内 情况。更大的挑战在于利用延时成像来检测超声波的作用，因为超声发射器会遮挡光路，且超声振动还会带来额外的技术障碍。然而，由于治疗应用每天仅需20分钟的刺激，因此在短暂刺激后对细胞行为进行分析可能是行之有效的。
披露
Andrew Harrison 是 Smith & Nephew UK Limited 的员工。
致谢
本工作获得了惠康信托基金（Wellcome Trust）授予 MDB 的 088419 号资助以及史密斯-内夫有限公司（Smith & Nephew UK Ltd.）的赞助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磺基-间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯 | Fisher Scientific | PN22312 | 25 mM 储存液溶于水后可于 -20°C 保存 |
| 6 孔组织培养板 | Corning | 3516 | 其他公司的塑料材质可能包被效果差 |
| 13 mm 玻璃盖玻片 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3336 | 其他公司的玻璃材质可能包被效果差 |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PBS，含 Ca2+ 和 Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| 50K 整联蛋白配体（纤连蛋白片段） | 构建描述及制备方法见 9, 11。可使用其他基质配体以研究其他信号通路 | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 放线菌酮 | Sigma-Aldrich | C7698 | 可配制成 10 mg/mL 水溶液储存液后保存 |
| DMEM/25 mM HEPES | Sigma-Aldrich | D6171 | |
| Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc. | ||
| 超声耦合凝胶 | Smith & Nephew Inc. | ||
| SAFHS 指示剂 | Smith & Nephew Inc. | ||
| hVIN-1 | Sigma-Aldrich | V9264 | |
| DyLight 488 标记的抗小鼠抗体 | Stratagene, Agilent Technologies | 715-485-150 | |
| TRITC 标记的鬼笔环肽 | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | |
| cOmplete 蛋白酶抑制剂（无 EDTA） | Roche Group | 056 489 001 | 由片剂配制成 100× 储存液，于 -20°C 保存 |
| PAK-谷胱甘肽琼脂糖微珠 | 构建描述及制备方法见 10 | ||
| 甘油 | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
| HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | 配制成 1 M 储存液并调节 pH 至 7.4 |
| NaCl | Fisher Scientific | S/0160/65 | |
| NP40 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
参考文献
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