核糖体结合新生多肽的分离 体外 识别mRNA上的翻译暂停位点

摘要

本文描述了一种用于鉴定mRNA上翻译暂停位点的技术。该方法基于在体外翻译目标mRNA时，分离在核糖体上积累的新生多肽链，随后通过变性凝胶电泳对新生肽链的大小进行分析。

摘要

翻译延伸速率是不均匀的。mRNA二级结构、密码子使用以及与mRNA结合的蛋白质可能改变核糖体在mRNA上的移动^{详见参考文献1}然而，目前普遍认为同义密码子的使用是导致翻译延伸速率不均一的主要原因¹同义密码子的使用频率并不相同。某些密码子的使用频率高于其他密码子，存在密码子使用偏好性。²密码子偏好性具有生物体和组织特异性^2,3此外，密码子的使用频率与其对应的tRNA浓度成正比。⁴因此，使用频率较高的密码子通常对应更多种类的tRNA，这意味着高频密码子的翻译速度通常快于低频密码子。因此，mRNA上富含稀有密码子的区域（潜在的暂停位点）通常会减缓核糖体在mRNA上的移动速度，导致相应长度的新生肽链发生累积。^5-8这些暂停位点可能对蛋白质表达、mRNA稳定性以及蛋白质折叠产生功能影响^{参见文献9以供审阅}确实，已有研究表明，缓解此类暂停位点可改变核糖体在mRNA上的移动，进而可能影响共翻译过程的效率（体内蛋白质折叠^1,7,10,11. 为了理解蛋白质折叠的过程 体内在细胞内，这一过程最终与蛋白质合成相偶联，因此必须全面了解密码子使用情况/tRNA含量对翻译延伸过程中核糖体沿mRNA移动的影响。

本文介绍了一种简单的方法，可用于定位特定mRNA在多种无细胞系统中翻译时的主要翻译暂停位点^6-8该步骤基于在核糖体上分离正在积累的新生多肽 体外 目标mRNA的翻译。其原理在于，在低频密码子处，核糖体停留时间延长，导致相应长度的新生肽段积累增多。 体外 转录的mRNA用于 体外 在存在放射性标记氨基酸的条件下进行翻译反应，以检测新生肽链。为了分离核糖体结合的新生多肽复合物，将翻译反应产物铺在30%甘油溶液上，随后进行离心。多核糖体沉淀中的新生多肽进一步用核糖核酸酶A处理，并通过SDS-PAGE分离。该技术原则上可用于任何蛋白质，能够分析核糖体沿mRNA的移动情况以及主要暂停位点的检测。此外，本实验方案还可进行调整，用于研究可能影响核糖体移动、从而潜在改变蛋白质功能或构象的各种因素和条件。

方案

1. DNA 模板制备与 体外 转录

1. 目的基因被克隆至T7和/或例如SP6转录启动子下游。
2. 对于 体外 将模板DNA用适当的限制性内切酶在ORF终止密码子和/或mRNA 3'端下游进行线性化处理。需通过琼脂糖凝胶电泳检测限制性酶切产物，以确认质粒DNA是否完全线性化。
3. 线性化的质粒用于 体外 转录反应。可测试不同浓度的模板DNA，以确定该反应所需的最适DNA浓度 体外 转录。通常使用 Ambion 的 MEGAscript 高产量转录试剂盒（Ambion/Life Technologies，美国纽约州格兰岛） 1 μg 线性化DNA产量为40-60 μg mRNA的 体外 转录操作按照制造商说明书进行（Ambion/Life Technologies，美国纽约州格兰德岛）。
4. 随后 体外 通过氯化锂沉淀法纯化mRNA，具体操作按照生产商说明书进行（Ambion's MEGAscript High yield Transcription Kit）。
5. 通过丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳进一步验证 mRNA 的完整性。

2. 体外 无细胞翻译

对于 体外 使用翻译 Rrabbit R网织红细胞裂解液，RRL（Promega，Madison，WI），请按照以下步骤操作：

1. 准备 100 μl 体外 根据制造商说明书进行翻译反应。简言之，在无核酸酶的水中加入 2 μl 甲硫氨酸缺失的氨基酸混合物（1 mM），10单位RNase抑制剂（Invitrogen/Life Technologies，美国纽约州格兰岛） 20 μCi 放射性[³⁵S]-甲硫氨酸（MP Biomedicals，Solon，OH）， 70 μl 兔网织红细胞裂解液（Promega，Madison，WI）
2. 在指定条件下孵育反应体系 30 °C 5分钟以预热翻译反应。加入 2 μg 将mRNA加入翻译反应体系，并在 30 °C 5 分钟。
3. 通过将翻译反应体系置于冰上以终止反应。

3. 新生多肽的分离 体外 翻译反应

1. 为了分离与核糖体（多聚核糖体）结合的新合成多肽，将翻译反应液铺加在 4.5 ml 含有 100 mM KCl、10 mM MgCl₂ 的 30% 甘油溶液（10 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.6）上方，并在 TLA-110 转子（Beckman Coulter, Inc, Brea, CA）中于 4 °C 下以 100,000 × g 离心 1 小时。
2. 小心移除上清液。
3. 将含有新合成多肽的多聚核糖体沉淀物重悬于少量（10–15 μl）1 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.6）中，加入终浓度为 0.5 mg/ml 的核糖核酸酶 A（Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY），于 37 °C 孵育 30 分钟。为促进肽酰-tRNA 酯键的水解，加入 NaOH 至终浓度为 10 mM，并继续孵育额外 30 分钟。

在无 mRNA 存在的情况下组装 体外 翻译反应，并在相同条件下进行（随后按前述方法分离新生肽链），可作为主要对照。在将提取物进行密度梯度离心前，用嘌呤霉素处理翻译反应体系，可作为额外的对照。

4. 在 Tris-三聚氰酸 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离新生多肽

1. 分离的新生多肽通过Tris-tricine SDS-PAGE进行分辨和分析。请注意，上样量取决于蛋白质标记效率、蛋白质翻译效率以及其他多种参数。应根据经验调整上样量，以实现对单个新生多肽链的最佳可视化和分离效果。
2. 电泳完成后，凝胶经固定并使用真空凝胶干燥仪干燥，随后进行放射自显影。通过磷屏成像系统观察新生多肽的分布情况。

5. 典型结果

牛γ-B晶状体蛋白在兔网织红细胞裂解液中进行了翻译 E. coli S30 提取系统（Promega，Madison，WI），随后分离新生多肽链。 图1 描述了分离核糖体结合新生链的步骤。本研究旨在检验翻译环境的改变（即tRNA谱系，已知在哺乳动物（RRL）和原核生物（E. coli由于不同生物体之间密码子偏好性的差异，可能会影响核糖体沿mRNA的移动，并影响翻译暂停位点的分布。核糖体移动的改变将导致翻译过程中积累的新生多肽链长度分布及其相对强度发生变化。条带的相对强度反映了暂停持续的时间。新生多肽链经分离后，在16.5% T、6% C的Tris-三羟甲基氨基甲烷（Tricine）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行分辨 （图2）γ-B-晶状体蛋白是一种20 kDa的蛋白质。在兔网织红细胞裂解液（RRL）中观察到新生多肽链长度和强度不一的现象。 E. coli 系统表明，核糖体在这两个系统中沿mRNA的移动遵循不同的翻译动力学。例如，我们观察到一个明显的17.7 kDa条带 E. coli 裂解液中存在而非在RRL系统中存在，表明在mRNA的3'末端区域（编码Gamma B晶状体蛋白的C端区域）进行翻译时，存在一个额外的翻译暂停位点 E. coli 系统。我们注意到，Gamma-B 晶状体蛋白含有串联的精氨酸密码子（AGG）₁₅₃ 和 AGA₁₅₄）在哺乳动物系统中较为常见，但已知在其中极为罕见且翻译速度极慢 E. coli 一种新型新生肽的积累 E. coli 系统（约17.7 kDa） 图 2.2) 很可能是由于核糖体在这些串联的稀有密码子处暂停所致。请注意，在缺乏 mRNA 的情况下无法观察到任何条带。图 2.3）并且嘌呤霉素处理可将新生肽链从多聚核糖体上大部分去除（图 2.3）。长期使用嘌呤霉素（puromycin）处理> 15 分钟）可去除所有新生肽链（数据未显示）。这证实了所观察到的多肽产物是与核糖体结合的新生肽链，而非与多聚核糖体共同沉降的mRNP。

如上所述，密码子偏好性具有生物体和组织特异性。此处描述的代表性实例明确表明，改变翻译的环境，即tRNA库/密码子偏好性，可导致核糖体沿mRNA移动发生变化。显然，这一简单技术不仅能用于鉴定mRNA上的翻译暂停位点，还可实现不同系统之间翻译暂停位点的快速比较。

图1. 分离核糖体结合的新生多肽步骤示意图 牛γ-B晶状体蛋白ORF序列（528个碱基对）被克隆至pBSKS+载体中T7启动子的下游。对于 体外 将模板DNA用EcoRI处理以进行线性化。线性化的模板用于转录 体外 转录。DNA模板中的T7启动子被T7 RNA聚合酶识别，从而转录下游的Gamma-B Crystallin基因。使用氯化锂沉淀法纯化mRNA。纯化的mRNA用于后续实验。 体外 翻译。孵育后，将翻译反应液铺在30%甘油溶液上，并在4℃下以100,000 × g离心1小时 4 °C 在100,000 × g条件下离心，以分离核糖体结合的新生多肽。

图2. 从兔网织红细胞裂解液（RRL）中分离翻译的牛γ-B晶状体蛋白新生多肽 E. coli 裂解液 2 μg mRNA 被混合进去 100 μl 含有RRL的反应 E. coli S30 提取系统（Promega，Madison，WI），按照制造商说明书操作 20 μCi [³⁵S]-甲硫氨酸，并在 30 °C 孵育5分钟后，将翻译反应液加至含100 mM KCl、10 mM MgCl₂的30%甘油（溶于10 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.6）4.5 ml之上₂，于4°C下以12,000 × g离心1小时 4 °C 以及在 TLA-110 转子（Beckman Coulter, Inc, Brea, CA）中以 100,000 × g 离心。分离得到的多聚核糖体沉淀重悬于 20 μl 含 0.5 mg/ml 核糖核酸酶 A（Invitrogen/Life Technologies，Grand Island，NY）的 1 mM Tris-HCl（pH 7.6）处理，随后按方案部分所述进行 NaOH 处理。新生多肽在 16.5% T、6% C 的 Tris-Tricine SDS-PAGE 凝胶上分离。凝胶干燥后进行放射自显影。曝光后，使用 GE Healthcare 的 Typhoon 成像扫描仪对凝胶进行扫描。 图 2.1 显示在两种不同系统（RRL 和）中进行翻译反应后分离并解析的新合成多肽的凝胶结果 E. coli). 图 2.2 使用Image Quant TL v2005软件对凝胶进行分析，此处作为示例，说明两种系统中积累的新生多肽的分子量和强度可被轻松分析与比较。 图 2.3 显示两组对照：在无 mRNA 条件下组装翻译反应，或在翻译反应经嘌呤霉素处理（5 分钟，终浓度 1 mM）后再进行离心，所分离并经 SDS-PAGE 分析的新合成多肽。

讨论

为了获得可重复的实验结果，in vitro 转录和翻译反应所用组分的质量与浓度至关重要。在本研究中，我们使用了市售试剂盒和提取物，只要操作得当，即可获得高度可重复的数据。然而，如有需要，也可自行从选定的细胞中制备具有翻译活性的提取物。mRNA 的质量可能影响翻译效果，因此在进行 in vitro 翻译前，必须检测 mRNA 的完整性。

此外，该持续时间 体外 每种蛋白质的翻译反应都需要单独优化。这是分离新生多肽的关键步骤。延长孵育时间会导致全长蛋白质的合成以及大部分新生多肽从核糖体上释放。孵育时间可通过以下操作进行优化： 体外 在不同时间点进行翻译反应。一旦确定了全长蛋白翻译所需的最短时间，下一步则需在该时间段附近开展另一组实验，以确定孵育时间，在此期间大多数新生多肽仍与核糖体结合（即翻译起始与终止过程仍处于平衡状态）。翻译反应也可通过添加抑制翻译延伸的抗生素（如环己酰亚胺）来终止。显然，该实验系统可用于解析mRNA上主要的暂停位点，所采用凝胶系统的分辨能力将对实验结果质量产生重要影响。建议在该类实验中使用Tr...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MEGAscript T7 高产量转录试剂盒	Ambion	AM1333
核糖核酸酶抑制剂	Invitrogen	15518012
Trans [35S]-标记物	MP Biomedicals	0151006
核糖核酸酶 A	Invitrogen	12091
兔网织红细胞裂解液系统（核酸酶处理）	Promega	L4960
E. coli S30 提取系统（用于线性模板）	Promega	L1030
离心	Beckman Coulter	Optima TLX 超速离心机
储存磷屏自显影技术	GE Healthcare	Typhoon 9410 多功能成像仪
新生多肽分析软件	GE Healthcare	Image Quant TL, v2005