本文首先描述了一种从人脐静脉中分离内皮细胞的实验步骤，然后展示了如何利用这些细胞在流动条件下研究中性粒细胞的跨内皮迁移。通过使用由具有玻璃光学特性的聚合物制成的低体积流动腔室，还可实现对稀有细胞群体的活细胞荧光成像。
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本文内容
摘要
摘要
中性粒细胞是数量最多的白细胞类型，构成先天免疫系统的重要组成部分1。在急性炎症过程中，中性粒细胞是最早迁移到损伤部位的炎性细胞。中性粒细胞向损伤部位的募集是一个分步过程，包括：第一，血管扩张以增加血流量；第二，微血管结构改变及血浆蛋白从血液中渗出；第三，中性粒细胞在内皮细胞表面滚动、黏附并穿越内皮层发生转迁移；第四，中性粒细胞在损伤部位聚集2,3。目前已发展出多种体内（in vivo）和体外（in vitro）方法，用于研究这些过程4。本方法聚焦于中性粒细胞穿越人源内皮细胞的转迁移过程。
一种研究中性粒细胞跨内皮迁移过程中分子机制的常用方法，是利用人中性粒细胞与原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）5进行相互作用。中性粒细胞的分离方法已在其他文献中通过可视化方式描述6；因此，本文将重点介绍HUVEC的分离方法。一旦分离并培养至融合状态，内皮细胞将被激活，导致黏附分子和活化分子的表达上调。例如，使用TNF-α等细胞因子激活内皮细胞可使E-选择素和IL-8的表达增加7。E-选择素介导中性粒细胞的捕获和滚动，而IL-8介导中性粒细胞的活化及其牢固黏附。黏附完成后，中性粒细胞开始跨内皮迁移。这种迁移可经由细胞旁途径（通过内皮细胞间的连接）或跨细胞途径（直接穿过内皮细胞本身）进行。在大多数情况下，这些相互作用发生在血管系统中常见的流动条件下7,8。
平行板流动室是一种广泛应用的系统，可模拟流体动力学剪切应力 体内 并在流动条件下实现对中性粒细胞募集的研究 体外9,10多家公司生产平行板流动腔，各有优缺点。如果需要进行荧光成像，则需使用玻璃或光学性质相似的聚合物。内皮细胞在玻璃表面生长不佳。
本文介绍一种简便快速的方法，利用由支持人源内皮细胞快速贴壁和生长的聚合物制成的低体积 ibidi 载玻片，结合相差、微分干涉（DIC）及荧光成像技术，对中性粒细胞跨内皮迁移过程进行观察。该方法中，内皮细胞在 ibidi μslide 中培养并加以刺激，在流动条件下引入中性粒细胞并评估其跨内皮迁移情况。通过荧光成像观察细胞间连接，可实时确定经细胞旁途径与跨细胞途径迁移的程度。
方案
1. 人血管内皮细胞的分离与培养
- 处理人血和组织时必须采用二级生物安全操作程序。使用剪刀从胎盘上剪下脐带，然后仔细检查脐带是否存在血凝块以及分娩过程中夹闭脐带造成的损伤。切除并丢弃这些受损部分。
- 通过将50 ml温热的脐带缓冲液倒入含有50 mg胶原酶的试管中，配制1 mg/ml的新鲜胶原酶溶液。
- 更换为无菌手套，在超净工作台中打开已高压灭菌的器械盘，其中包含无菌的钝头套管、脐带夹、剪刀、三通阀和纱布。
- 辨认脐带中的两条动脉和一条静脉。动脉较细且通常处于紧缩状态，而静脉较粗大，易于插管。为冲洗静脉中的血液，将连接有二通阀的套管轻轻插入静脉一端，并用夹子固定套管以确保其位置稳固。通过静脉灌注脐带缓冲液，重复操作直至流出液澄清，然后夹闭脐带末端。
- 将胶原酶溶液灌入静脉，关闭阀门，将脐带放入盛有温热脐带缓冲液的烧杯中，孵育10分钟。10分钟后取出脐带，轻轻按摩以松动静脉管腔内的内皮细胞。将液体收集至含有内皮细胞培养基（ECM）的试管中。用脐带缓冲液冲洗两次以收集残留细胞，每次冲洗后的液体均收集至同一试管中。
- 以350 × g离心10分钟，沉淀内皮细胞。
- 弃去上清液，向沉淀中加入10 ml ECM。轻轻重悬细胞后，转移至预先用0.2%明胶包被的T75培养瓶中。明胶包被需在37 °C孵育至少1小时。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。
- 次日，轻轻振....
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讨论
研究人员通常使用来自不同血管床的内皮细胞来研究中性粒细胞的募集和跨内皮迁移，其中包括但不限于皮肤微血管内皮细胞12肝窦内皮细胞13 人脐静脉内皮细胞10其中，HUVEC 因其相对易于分离和获取而广受欢迎。HUVEC 是一种强大的 体外 模拟多种内皮细胞生理过程的模型系统 体内该模型系统有助于鉴定在多种白细胞亚类募集过程中起关键作用的黏附分子和趋化因子，并实现了对这些过程调控机制的深入分析。 体外 HUVEC 的研究工作奠定了基础 体内 最终为人类疾病的认知与治疗提供了更深入理解的研究14.
本文中，我们介绍一种快速、简便的研究中性粒细胞募集的方法 体外 使用 ibidi 流动室。这类流动室相较于本期刊此前描述的其他平行板流动室具有多项优势11Ibidi 培养小室由一种具有类似玻璃光学特性的聚合物制成，可支持用户进行荧光、微分干涉差（DIC）以及相差显微成像。部分培养小室采用玻璃盖玻片.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Pina Colarusso 博士和活细胞成像中心在成像及图像分析方面提供的帮助；感谢 Lailey 女士提供的技术协助；感谢加拿大阿尔伯塔省卡尔加里市山脚医院 51 号病房提供人脐带。K.D. Patel 博士是阿尔伯塔创新健康解决方案项目的科学家。本研究得到了加拿大卫生研究院运营基金，以及加拿大创新基金会和阿尔伯塔省科学与研究局的设备与基础设施基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1型胶原酶 | Worthington | 4197 | |
| 脐带缓冲液 | 成分：140 mM NaCl，4 mM KCl，10 mM D-葡萄糖溶于1 mM NaH2PO4/Na2HPO4 缓冲液，pH 7.4 | ||
| 内皮细胞培养基（ECM） | M199 培养基含 Eagle 盐，添加 16% 人血清，并补充每毫升含 100 单位青霉素、100 μg 链霉素和 0.3 mg L-谷氨酰胺 | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酸盐溶液（100×） | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi 培养小室 | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| 人血清白蛋白 20% 溶液 | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS | Sigma | H2487-10X | |
| 含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS | Sigma | H1387-10X |
参考文献
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-....
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