人脐静脉内皮细胞的分离及其在流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移研究中的应用

摘要

本文首先描述了一种从人脐静脉中分离内皮细胞的实验步骤，然后展示了如何利用这些细胞在流动条件下研究中性粒细胞的跨内皮迁移。通过使用由具有玻璃光学特性的聚合物制成的低体积流动腔室，还可实现对稀有细胞群体的活细胞荧光成像。

摘要

中性粒细胞是数量最多的白细胞类型，构成先天免疫系统的重要组成部分¹。在急性炎症过程中，中性粒细胞是最早迁移到损伤部位的炎性细胞。中性粒细胞向损伤部位的募集是一个分步过程，包括：第一，血管扩张以增加血流量；第二，微血管结构改变及血浆蛋白从血液中渗出；第三，中性粒细胞在内皮细胞表面滚动、黏附并穿越内皮层发生转迁移；第四，中性粒细胞在损伤部位聚集^2,3。目前已发展出多种体内（in vivo）和体外（in vitro）方法，用于研究这些过程⁴。本方法聚焦于中性粒细胞穿越人源内皮细胞的转迁移过程。

一种研究中性粒细胞跨内皮迁移过程中分子机制的常用方法，是利用人中性粒细胞与原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）⁵进行相互作用。中性粒细胞的分离方法已在其他文献中通过可视化方式描述⁶；因此，本文将重点介绍HUVEC的分离方法。一旦分离并培养至融合状态，内皮细胞将被激活，导致黏附分子和活化分子的表达上调。例如，使用TNF-α等细胞因子激活内皮细胞可使E-选择素和IL-8的表达增加⁷。E-选择素介导中性粒细胞的捕获和滚动，而IL-8介导中性粒细胞的活化及其牢固黏附。黏附完成后，中性粒细胞开始跨内皮迁移。这种迁移可经由细胞旁途径（通过内皮细胞间的连接）或跨细胞途径（直接穿过内皮细胞本身）进行。在大多数情况下，这些相互作用发生在血管系统中常见的流动条件下^7,8。

平行板流动室是一种广泛应用的系统，可模拟流体动力学剪切应力 体内 并在流动条件下实现对中性粒细胞募集的研究 体外^9,10多家公司生产平行板流动腔，各有优缺点。如果需要进行荧光成像，则需使用玻璃或光学性质相似的聚合物。内皮细胞在玻璃表面生长不佳。

本文介绍一种简便快速的方法，利用由支持人源内皮细胞快速贴壁和生长的聚合物制成的低体积 ibidi 载玻片，结合相差、微分干涉（DIC）及荧光成像技术，对中性粒细胞跨内皮迁移过程进行观察。该方法中，内皮细胞在 ibidi μslide 中培养并加以刺激，在流动条件下引入中性粒细胞并评估其跨内皮迁移情况。通过荧光成像观察细胞间连接，可实时确定经细胞旁途径与跨细胞途径迁移的程度。

方案

1. 人血管内皮细胞的分离与培养

1. 处理人血和组织时必须采用二级生物安全操作程序。使用剪刀从胎盘上剪下脐带，然后仔细检查脐带是否存在血凝块以及分娩过程中夹闭脐带造成的损伤。切除并丢弃这些受损部分。
2. 通过将50 ml温热的脐带缓冲液倒入含有50 mg胶原酶的试管中，配制1 mg/ml的新鲜胶原酶溶液。
3. 更换为无菌手套，在超净工作台中打开已高压灭菌的器械盘，其中包含无菌的钝头套管、脐带夹、剪刀、三通阀和纱布。
4. 辨认脐带中的两条动脉和一条静脉。动脉较细且通常处于紧缩状态，而静脉较粗大，易于插管。为冲洗静脉中的血液，将连接有二通阀的套管轻轻插入静脉一端，并用夹子固定套管以确保其位置稳固。通过静脉灌注脐带缓冲液，重复操作直至流出液澄清，然后夹闭脐带末端。
5. 将胶原酶溶液灌入静脉，关闭阀门，将脐带放入盛有温热脐带缓冲液的烧杯中，孵育10分钟。10分钟后取出脐带，轻轻按摩以松动静脉管腔内的内皮细胞。将液体收集至含有内皮细胞培养基（ECM）的试管中。用脐带缓冲液冲洗两次以收集残留细胞，每次冲洗后的液体均收集至同一试管中。
6. 以350 × g离心10分钟，沉淀内皮细胞。
7. 弃去上清液，向沉淀中加入10 ml ECM。轻轻重悬细胞后，转移至预先用0.2%明胶包被的T75培养瓶中。明胶包被需在37 °C孵育至少1小时。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。
8. 次日，轻轻振荡培养瓶以去除残留的红细胞，随后弃去上清液，并用温热的Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤。弃去HBSS，加入10 ml温热的ECM进行换液。在显微镜下观察细胞，确认红细胞已被清除。评估内皮细胞的融合程度及形态特征。此阶段的内皮细胞应呈长梭形，无空泡形成。
9. 每三天更换一次培养基，直至细胞达到融合状态，随后使用含1 mM EDTA的0.08%胰蛋白酶溶液进行传代。将内皮细胞接种于预先用0.2%明胶包被的所需培养皿中。细胞通常在3–6天内达到融合。
10. 若使用ibidi培养小室，需预先用0.2%明胶对每个小室进行包被。去除多余的明胶和纤维连接蛋白后，向小室内加入悬浮于ECM中的内皮细胞，密度为1.5 × 10⁶/mL。每隔一天更换一次培养基，直至细胞融合。根据脐带来源不同，细胞通常在2–3天内达到融合。

2. 中性粒细胞的制备

1. 采用密度梯度离心法从健康志愿者的外周血中分离中性粒细胞。有关中性粒细胞分离的详细方案及可视化演示，可参见本期刊早前发表的文章⁶。分离后，将中性粒细胞重悬于含有0.5%人血清白蛋白的HBSS中，浓度为1×10⁶/mL。

3. 设置 Ibidi 培养小室

1. 在明胶包被的ibidi小室中培养内皮细胞。每天使用相差显微镜观察，直至细胞达到紧密汇合状态。
2. 刺激内皮细胞以增加黏附分子和活化分子的表达。在本实验方案中，内皮细胞在设置用于流动条件下成像的ibidi小室之前，使用10 ng/mL重组TNF-α在37 °C和5% CO₂条件下刺激4小时。
3. 按照Wiese及其同事¹¹的视觉化描述，使用一个空的ibidi小室准备显微镜和注射泵。
4. 本实验方案与Wiese方法的关键差异包括：预先填充管路以避免内皮细胞暴露于空气；使用水浴将缓冲液维持在37 °C；采用PharMed管路以减少缓冲液的热量散失；以及根据使用相差显微镜或荧光显微镜成像的不同情况，选用不同的显微镜物镜。
5. 显微镜设置完成后，当管路中充满HBSS后，关闭所有旋塞阀，并移除空的ibidi小室。
6. 将含有经TNF-α刺激的内皮细胞的ibidi小室连接至管路系统。

4. 中性粒细胞的募集与跨内皮迁移

1. 使用10倍相差物镜在显微镜下观察内皮细胞单层。
2. 设置注射泵开始回吸，并以所需的剪切应力（通常为0.5至2 dyn/cm²）启动HBSS的流动。
3. 在入口端，通过旋转三通旋塞，将液体从HBSS切换为分离的中性粒细胞（1×10⁶/mL）。
4. 使用连接至DVD录像机或直接连接至计算机的CCD相机开始记录。当中性粒细胞进入灌注腔时启动计时器，持续灌注中性粒细胞4分钟。单次实验使用3 mL中性粒细胞悬液已足够。
5. 4分钟后，切换回HBSS以防止新的中性粒细胞黏附。若需获取总相互作用、滚动及牢固黏附的数据，可在第4至第5分钟之间，使用10倍相差物镜随机选取6个视野，每个视野记录10秒。
6. 切换至40倍物镜，在第5至第10分钟期间记录单个视野；在第10分钟时，采集5至10个随机视野。
7. 停止灌注，转移至下一个灌注腔。

5. 使用 Ibidi 培养小室在流动条件下进行荧光成像

1. 使用感兴趣的荧光探针对内皮细胞或中性粒细胞进行标记。例如，可使用与Alexa-[547]偶联的抗VE-钙黏蛋白抗体来观察内皮细胞连接。
2. 在配备微分干涉差（DIC）和荧光功能的显微镜上安装ibidi小室。我们使用配备环境培养室的FluoView 1000共聚焦显微镜（Olympus）。使用专为DIC和荧光工作设计的物镜进行聚焦。
3. 在遵循第4节所述时间进程的同时，利用设备供应商提供的软件同步采集DIC和荧光图像。

6. 中性粒细胞募集的分析

1. 中性粒细胞滚动与相互作用的分析方法由 Wiese et al¹¹ 描述。
2. 通过计算在5秒时间内移动距离超过一个细胞直径的中性粒细胞数量，来测定在内皮单层上滚动的中性粒细胞百分比。将该数值除以视野中白细胞的总数，以确定滚动细胞的百分比。据此，其余未滚动的细胞被视为稳定黏附。
3. 通过计算中性粒细胞在特定时间内移动的距离，并将该距离除以对应的时间（秒），从而测定其中性粒细胞的滚动速度。
4. 跨内皮迁移通过计数已发生形态改变并迁移至单层下方的中性粒细胞数量来确定¹⁰。这些中性粒细胞的识别依据是：当其位于单层上方时呈相差明亮，而迁移至单层下方后则呈相差暗淡¹⁰。跨内皮迁移的细胞数量可表示为视野中总细胞数的百分比，或表示为单位面积内迁移细胞的绝对数量。在此模型系统中，通常在10分钟后约有50%的中性粒细胞完成跨内皮迁移。

7. 代表性结果

未受刺激的内皮细胞不支持中性粒细胞的募集。相反，用 TNF-α 刺激内皮细胞可导致中性粒细胞滚动、牢固黏附和跨内皮迁移。这些数据的示例如图1和图2所示。图1A显示了中性粒细胞与经 TNF-α 刺激的内皮细胞之间的相互作用。这些相互作用可被定量分析，从而揭示与内皮细胞发生相互作用的中性粒细胞总数，以及发生滚动、牢固黏附或已完成跨内皮迁移的中性粒细胞数量（图2）。中性粒细胞的跨内皮迁移可发生在细胞连接处，也可直接穿过内皮细胞本身。为了区分这两种情况，使用抗 VE-钙黏蛋白抗体标记内皮细胞，并将跨内皮迁移分为经细胞间（旁细胞）迁移或经细胞内迁移（图1B和图1C）。在该模型中，几乎所有跨内皮迁移均为旁细胞途径⁷。

图1. 使用ibidi腔室在流动条件下同时进行微分干涉（DIC）与荧光成像。（A）新鲜分离的人中性粒细胞在人脐静脉内皮细胞上迁移的DIC图像。黄色箭头显示一个黏附的中性粒细胞；白色箭头显示一个正在跨内皮迁移的中性粒细胞。（B）使用与Alexa-[547]偶联的抗VE-钙黏蛋白抗体对内皮细胞连接进行染色并成像。（C）显示A和B通道的叠加图像，揭示在此模型中几乎所有跨内皮迁移均为旁细胞途径。 点击此处查看高清大图。

图2. 内皮细胞未受刺激或经10 ng/mL TNF-α刺激。4小时后，组装平行板流动腔，并以1 dyn/cm²的流速灌注中性粒细胞。(A) 使用美国国立卫生研究院（NIH）提供的ImageJ软件分析并测量中性粒细胞的相互作用。总的相互作用细胞被分为(B) 滚动、牢固黏附或(C) 跨内皮迁移。数据表示3至5次实验的平均值±标准误。A图和C图中对照组与TNF处理组之间的差异具有显著性（p<0.001）。

讨论

研究人员通常使用来自不同血管床的内皮细胞来研究中性粒细胞的募集和跨内皮迁移，其中包括但不限于皮肤微血管内皮细胞¹²肝窦内皮细胞¹³ 人脐静脉内皮细胞¹⁰其中，HUVEC 因其相对易于分离和获取而广受欢迎。HUVEC 是一种强大的 体外 模拟多种内皮细胞生理过程的模型系统 体内该模型系统有助于鉴定在多种白细胞亚类募集过程中起关键作用的黏附分子和趋化因子，并实现了对这些过程调控机制的深入分析。 体外 HUVEC 的研究工作奠定了基础 体内 最终为人类疾病的认知与治疗提供了更深入理解的研究¹⁴.

本文中，我们介绍一种快速、简便的研究中性粒细胞募集的方法 体外 使用 ibidi 流动室。这类流动室相较于本期刊此前描述的其他平行板流动室具有多项优势¹¹Ibidi 培养小室由一种具有类似玻璃光学特性的聚合物制成，可支持用户进行荧光、微分干涉差（DIC）以及相差显微成像。部分培养小室采用玻璃盖玻片...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1型胶原酶	Worthington	4197
脐带缓冲液			成分：140 mM NaCl，4 mM KCl，10 mM D-葡萄糖溶于1 mM NaH2PO4/Na2HPO4 缓冲液，pH 7.4
内皮细胞培养基（ECM）			M199 培养基含 Eagle 盐，添加 16% 人血清，并补充每毫升含 100 单位青霉素、100 μg 链霉素和 0.3 mg L-谷氨酰胺
M199	GIBCO	31100-035
青霉素-链霉素-谷氨酸盐溶液（100×）	Invitrogen	10378-016
Ibidi 培养小室	Ibidi	80606
TNF-α	Prepro Tech	300-01A
人血清白蛋白 20% 溶液	Gemini Bioproducts	800120050
不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS	Sigma	H2487-10X
含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS	Sigma	H1387-10X