本视频展示了一种将人胰腺处理成多种储存格式的解剖操作流程。在整个胰腺各区域中均保持解剖学方向，以便明确不同区域的胰岛组成与密度。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
该解剖与取样操作流程是为糖尿病胰腺器官捐献者网络（nPOD）项目开发的，旨在标准化从尸体器官捐献者获取的胰腺组织的制备过程。胰腺被分为三个主要区域（头、体、尾），随后沿从内侧到外侧的轴线进行连续的横断面切片。交替的组织切片用于制备固定石蜡包埋块和新鲜冷冻组织块，剩余样品则被切碎后进行速冻处理，可选择是否添加RNase抑制剂，用于DNA、RNA或蛋白质的提取。胰腺解剖操作的整体目标是在保持解剖学方向的前提下，对整个胰腺进行全面取样。
与啮齿类动物胰岛相比，人类胰岛在胰岛组成、大小和数量方面表现出内分泌细胞的异质性 1。来自胰头、胰体和胰尾区域的大多数人胰岛主要由含胰岛素的β细胞构成，其次为较少比例的含胰高血糖素的α细胞和含生长抑素的δ细胞。含胰多肽的PP细胞和含饥饿素的ε细胞也存在，但数量较少。相比之下，钩突区域的胰岛主要由含胰多肽的PP细胞组成 2。这些区域性的胰岛差异源于发育过程中的不同。胰腺起源于前肠的腹侧和背侧胰芽，随着胃和十二指肠的旋转，腹侧胰芽移动并与背侧胰芽融合3。腹侧胰芽形成胰头的后部，包括钩突，而背侧胰芽则发育为胰腺的其余部分。不同区域的胰腺还表现出差异，例如胰尾区域的胰岛密度高于其他区域，而在1型糖尿病中，源自背侧胰芽的结构会发生选择性萎缩4,5。
通常还会从器官捐献者身上获取其他器官和组织，包括胰腺淋巴结、脾脏和非胰腺淋巴结。这些样本的获取方式与胰腺类似， additionally 进行冷冻保存细胞的分离。当胰腺包含近端十二指肠时，可采集十二指肠黏膜用于石蜡切片、冷冻切片以及剪碎后速冻的制备。
方案
1. 实验准备
- 使用铅笔手动标记石蜡包埋盒，或使用包埋盒打印机自动标记。标记内容应包括供体标识符（CaseID）、样本类型、分样编号以及任何其他唯一标识信息（参见案例工作表，附录1）。
- 使用永久性记号笔对标记OCT模具，方法与标记包埋盒相同。裁剪5-10 cm的铝箔矩形片备用。
- 使用永久性记号笔打印或手动标记所有冻存管和试管。准备足够数量的冻存管用于速冻组织碎块，以及装有RPMI培养基的试管用于新鲜样本运输。对于添加RNAlater的速冻冻存管，每支 cryovial 中加入1 mL RNAlater。
- 在生物安全柜及实验台面上设置解剖板，并放置已灭菌的解剖器械（镊子、手术刀、刀片、纱布垫（4x4）），同时按使用顺序摆放包埋盒和OCT模具。
- 准备冷冻浴：将干冰放入中等大小的泡沫盒（10x10 cm）中，厚度至少3 cm，然后加入异戊烷直至完全覆盖干冰。
- 可选：用小型杜瓦瓶盛装液氮。
- 若需胰腺组织用于电子显微镜（EM）检测，配制TAAB固定液：加入1.25 mL 16%多聚甲醛、1.25 mL 8%戊二醛和7.5 mL 0.1M PBS。配制Lowicryl固定液：将2.5 mL 16%多聚甲醛加入7.5 mL 0.1M PBS中。
- 准备用于细胞分离的溶液。向500 mL DMEF（含谷氨酰胺）培养基中，按照无菌操作技术加入以下成分：
- 胎牛血清（FBS）：加入50 mL，终浓度为10%。
- 青霉素/链霉素（Pen/Strep，10,000 U/mL / 10,000 µg/mL 储存液）——向RPMI培养基中加入5 mL Pen/Strep储存液，终浓度为100 U/mL / 100 µg/mL。当使用DPBS保存淋巴结或脾脏样本时，也向500 mL DPBS中加入5 mL Pen/Strep储存液。
2. 人员
- 该操作最理想由三名工作人员共同完成，但经过良好培训的单个人员也可独立实施。两名人员通常可在90分钟内完成操作。实际所需时间取决于所接收组织的数量以及胰腺淋巴结的寻找难度。用于细胞分离的样本在组织解剖完成前需置于4 °C保存，而血清样本则同步进行处理。
- 病理医师、病理技术员或同等资质人员——由经验丰富的工作人员主导组织处理，执行主要解剖操作，包括胰头部分的分割及胰腺淋巴结的采集。初始工作重点为胰腺，随后检查胰周脂肪组织以寻找淋巴结。
- 实验室技术员或同等资质人员——接受过组织修整培训的工作人员，主要负责称量胰腺及其各区域，修整用于石蜡包埋、冷冻包埋的组织块，以及用于速冻保存的样本管。从病理技术员处接收十二指肠和脾脏，并在病理技术员处理胰腺的同时对这些器官进行处理。
- 实验室助理——协助其他人员完成工作，包括包埋盒和冻存管的标签标注、样本切割分装至冻存管，以及血清样本的处理。
3. 胰腺解剖
- 去除十二指肠和脾脏，使用钝性和锐性解剖方法清除胰腺周围的多余脂肪、血管和神经
- 将清理后的胰腺置于铺有纸巾的解剖板上。将棉签蘸取蓝色墨水，涂抹于胰腺的腹侧表面，吸去多余墨水
- 可选步骤：用新的棉签蘸取黑色墨水，涂抹于胰腺的背侧表面。将胰腺恢复至正常方位，腹侧朝向解剖者
- 将胰腺切割为三个区域：头、体和尾（图1）。先切开头与体之间的交界处，然后将剩余部分大致均分为体部和尾部
- 称量胰腺各区域并记录重量（病例分析工作表（附录1））
- 以横向“面包切片”方式对胰腺各区域进行切片（厚度约0.5 cm）（图1）
- 取各区域交界处的切片用于组织匀浆样本。根据胰腺大小，体-尾交界区域的样本可能难以获取；此时可减少石蜡包埋块的数量以获取匀浆样本，或仅采集胰头-体交界区域的样本。根据所取样本靠近的近端区域，将冻存管标记为“头”或“体”。
- 将组织剪碎，并均匀分装至冻存管中（每管不少于1克）。不加RNALater，迅速在液氮或干冰-异戊烷混合物中冷冻，随后转移至-80 °C冰箱保存
- 含RNALater的冻存管在室温下放置30分钟，以确保充分平衡，重新混匀后迅速在液氮或干冰-异戊烷混合物中冷冻，随后转移至-80 °C冰箱保存
- 从石蜡包埋开始，交替取切片用于制备石蜡块和OCT包埋块（图1）
- 将所有横切面统一向右倾斜
- 将大小约为1.5 × 1.5 × 0.5 cm的组织块放入包埋盒中。若横切面过大，可将其切成两半（图2b）。将含有蓝色墨水标记的腹侧半块包埋盒标记为“A”，背侧半块标记为“B”
- 若组织块仍过大，可沿垂直于前一切口的方向再次切割（图2c）。包埋盒按顺时针方向标记为A-D。根据需要进一步修剪组织，以适配包埋盒
- 在每个区域内，从最内侧的切片开始，按顺序对包埋块编号
- 对于石蜡包埋块，将包埋盒标签置于左侧，将组织放入包埋盒中，并保持其原有方向。盖上包埋盒盖，转移至盛有约500 ml 10%中性缓冲福尔马林（NBF）的容器中。当最后一个包埋盒放入固定液后开始计时固定时间
- 对于OCT包埋块，先在预先标记的模具中倒入一层薄薄的OCT包埋剂，然后将组织放入模具中，确保方向正确，并用OCT完全覆盖组织。迅速将OCT模具浸入干冰-异戊烷混合物中约1分钟。取出后置于干冰上临时保存，或放入-80 °C冰箱长期保存
- 从胰头-体交界处获取大小约为0.5 × 0.5 cm的组织片用于电子显微镜（EM）检查。将一片放入TAAB固定液，另一片放入Lowicryl固定液。两种固定液均需在4 °C条件下保存至少48小时，或长期保存直至进行后续电镜处理
4. 脾脏、淋巴结分离及十二指肠黏膜分离
- 从脂肪组织中分离胰腺淋巴结（PLN），修剪掉淋巴结被膜外的所有结缔组织，置于含有DMEF的无菌细胞培养皿中。根据分离得到的淋巴结总数，将PLN分装为若干份，用于新鲜样本运输、冷冻保存的细胞分离、石蜡包埋和/或OCT包埋块制备，以及细胞悬液分装。将较大的淋巴结切成不超过0.5 cm的小块。
- 将非胰腺淋巴结和脾脏切成小块（约0.5 cm的立方体），根据起始材料的量，分别置于固定液、OCT包埋介质、或DMEM中，用于新鲜样本运输或冷冻保存的细胞分离。
- 切开十二指肠，用湿润的纱布轻轻擦拭十二指肠黏膜，去除黏液。取黏膜组织切片，分别用于制备石蜡包埋和/或冷冻OCT包埋块，以及加入或不加入RNAlater的剪碎样本，分装至冻存管中。冷冻保存方式与其他样本相同。
5. 用预先标记的铝箔包裹OCT包埋块，并将OCT包埋块和小瓶放入盒子中，于-80 °C长期保存。
6. 提交固定样品进行石蜡包埋处理
- 使用自动石蜡包埋机或手动计时，用16小时（范围为20±4小时）固定组织。使用自动包埋机将组织处理成石蜡包埋块（附录2）。
- 包埋切片时，应按照初检医师放置的方向，使包埋盒标签位于左侧。十二指肠黏膜包埋时应将切割面朝下，以便于观察与黏膜下层垂直的黏膜结构。
7. 清洁解剖区域并进行消毒。清洗解剖器械并重新灭菌。将剩余的人体组织置于福尔马林固定液中，作为生物医学废物储存。根据当地法规，在一个月内丢弃生物医学废物。
8. 更新样品库存系统
9. 典型结果
该操作可在2小时内完成对完整人胰腺的处理，包括对器官内三个主要区域（即头、体和尾部）进行代表性取样，并明确划分这些区域。位于胰头部后方的钩突区域包含在胰头部分的解剖中。无糖尿病的器官捐献者胰腺中位重量为82.4克（52.7 - 139.0克）。胰腺各区域的重量大致相等（图3）。
该方法还可利用连续石蜡和OCT包埋块的染色切片，实现对整个胰腺的重建。多种格式均可行，可最大限度地适应当前和未来的技术需求。当前使用的nPOD病例工作表已提供（附录1），用于记录所获取的样本及其按分装类型和数量进行的后续处理信息。
图1. 实验流程总体示意图。 整个胰腺在保持解剖学方向的前提下进行处理。由于腹侧胰腺叶位于包含钩突区域的后部，头部区域在上下轴上更长。连接处的阴影区域表示用于剪碎后存入冻存管的组织样本区域。P，石蜡；O，OCT。
图2. 胰腺切片的字母标记方案。 胰腺的横切片可进一步分为半片或四分之一片，并按顺时针方向用字母标记。
图3. 无糖尿病器官捐献者的胰腺重量。 来自成年捐献者（>17岁）的完整胰腺称重后，按解剖区域分割并分别获取各区域重量。数据为均值 ± 标准误（N=15）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本实验的目的是建立一种标准化的胰腺处理流程，可在多个采集点之间实现统一，从而允许不同研究团队获得的结果进行比较。该解剖方法基于标准的外科病理学操作，并增加了对胰腺主要区域进行注释的步骤，随后进行区域内细分。为了获取高质量的生物样本，必须对生物样本处理方法进行标准化，这一点已由国家生物样本库组织（如美国国家癌症研究所）发布的生物样本采集最佳实践指南所证实6。已有研究报道了来自处于糖尿病不同阶段的供体以及合适对照人群的人类胰腺样本的生物样本库建设7-9。然而，对于来自胰头区域的样本，其具体的采集细节仍缺乏明确规范。已知个体间胰岛存在显著异质性，胰岛大小分布的差异可达5倍之多，因此在分析内在异质性时，必须对胰腺区域进行精确注释10。采用标准化方式处理胰腺样本将有助于区分个体患者因素，从而更清晰地揭示其他潜在的关键疾病因素。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢捐赠者家属以及参与本研究的器官获取组织，同时感谢 Maria Martino 和 Irina Kusmartseva 提供的专业协助。本研究由青少年糖尿病研究基金会（M.C-T.，M.A.）资助，用于支持糖尿病胰腺器官捐赠者网络项目。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖器械，包括带22号刀片的手术刀 | Various | Various | |
| 离心管（15 和 50 ml） | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | 无菌 |
| 冻存管（1.8 ml） | VWR North America | 89004-300 | 无菌，可选条形码 |
| RNA保存液（RNAlater） | Ambion | AM7021 | |
| 外科病理学墨水 | |||
| 包埋盒 | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT 包埋剂 | TissueTek | 4583 | |
| 模具 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | 多种尺寸 |
| 异戊烷 | Fisher Scientific | O3551-4 | 用于OCT冷冻浴 |
| 干冰 | 用于OCT冷冻浴 | ||
| 液氮（盛于杜瓦瓶中） | 用于快速冷冻冻存管 | ||
| 细胞培养皿（100 mm） | Corning | 430167 | 无菌 |
| Hyclone DMEF 培养基 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | 无菌，冷藏保存，含谷氨酰胺 |
| 胎牛血清 | Cellgro | 35-010-CV | 无菌，分装后冷冻保存 |
| 青霉素/链霉素/抗真菌剂 | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | 无菌，分装后冷冻保存 |
| 9型石蜡 | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1× D-PBS 缓冲液 | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | 无菌 |
| 16% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 现配现用，冷藏保存 |
| 8% 戊二醛 | Electron Microscopy Sciences | 16019 | 现配现用，冷藏保存 |
| 生物安全二级操作台 | Various | ||
| 超低温冰箱 | Various | ||
| Sakura 包埋盒打印机 | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | 自动石蜡处理仪 | |
| 石蜡包埋工作站 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| 表1. 特定试剂与设备。 |
参考文献
- Brissova, M. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).
- Rahier, J. The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).
- Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).
- Wittingen, J., Frey, C. F. Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas. Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).
- Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. Cellular composition of the human diabetic pancreas. Diabetologia. 24, 366-371 (1983).
- Vaught, J. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).
- Gianani, R. Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).
- Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity. Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).
- In't Veld, P. Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors. Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).
- Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans. Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
