一种用于从人类细胞生产分泌蛋白的便捷通用表达平台

摘要

在后人类基因组时代，天然构象重组蛋白的可获得性对于结构、功能及治疗相关的研究与开发至关重要。本文介绍了一种在人胚胎肾293T细胞中进行小规模及大规模蛋白表达的系统，可用于生产多种重组蛋白。

摘要

在细菌中进行重组蛋白表达，通常 E. coli，一直是实现毫克级蛋白质表达的最成功策略。然而，原核宿主通常不适合表达人类、病毒或真核蛋白，原因在于外源大分子的毒性、蛋白质折叠机制的差异，或细菌缺乏特定的共翻译或翻译后修饰能力。基于酵母的表达系统（P. pastoris 或 S. cerevisiae) ^1,2，杆状病毒侵染的昆虫（S. frugiperda 或 T. ni) 细胞 ³，以及无细胞 体外 翻译系统 ^2,4 已成功用于哺乳动物蛋白的生产。直观而言，最佳选择是使用哺乳动物宿主，以确保表达出具有正确翻译后修饰的重组蛋白。多种哺乳动物细胞系（人胚胎肾（HEK）293、 CV-1 细胞在 O携带复制起点的 SV40 大T抗原（COS）、中国仓鼠卵巢（CHO）及其他细胞系已成功用于过表达毫克量级的多种人源蛋白 ^5-9然而，使用哺乳动物细胞的优势常常被较高的成本、对专用实验设备的需求、较低的蛋白产量以及构建稳定表达细胞系所需的漫长周期所抵消。提高产量并加快蛋白生产速度，同时保持低成本，是许多学术和商业实验室关注的主要因素。

本文介绍了一种省时且经济的两步法，用于从贴壁生长的HEK 293T细胞中表达分泌型人源蛋白。该系统能够生产微克至毫克级的功能性蛋白，适用于结构、生物物理及生化研究。第一步，平行构建多个目的基因的表达质粒，并在小规模培养中瞬时转染至贴壁的HEK 293T细胞。通过商用抗体针对载体编码的蛋白纯化标签进行Western印迹分析，检测并分析分泌至细胞培养基中的重组蛋白。随后，选取适合大规模蛋白生产的构建体，利用聚乙烯亚胺（PEI）在10层细胞工厂中进行瞬时转染。将分泌至升液体积的条件培养基中的蛋白通过切向流过滤浓缩为可操作的体积，再经抗HA亲和层析进行纯化。该平台的有效性已通过其表达多种蛋白的能力得到验证，包括毫克量级的细胞因子、细胞因子受体、细胞表面受体、内在限制因子以及病毒糖蛋白。该方法还成功应用于三聚体埃博拉病毒糖蛋白的结构解析^5,10。

总之，该平台具有操作简便、速度快和可扩展性强的优点，同时能够最大限度地提高蛋白质的质量和功能。此外，除标准的加湿CO₂培养箱外，无需其他额外设备。该方法可快速拓展应用于更复杂的系统，例如蛋白复合物的共表达、抗原和抗体的表达、用于疫苗的病毒样颗粒的生产，或用于难转导细胞系的腺病毒和慢病毒的生产。

方案

1. 准备工作——载体构建与细胞培养

在开始实验方案之前，应针对哺乳动物细胞中的表达对目标基因进行密码子优化，并使用标准的分子生物学技术将其克隆至合适的表达载体中。为了最大程度地确保成功表达，应构建目标基因的多个变异体。目前市面上有多种哺乳动物表达载体可供选择，这些载体带有不同的纯化标签（如多聚组氨酸、血凝素、链霉亲和素、HALO-Tag、谷胱甘肽S-转移酶等）。我们倾向于使用pDISPLAY载体，该载体包含强效的人巨细胞病毒启动子、Ig κ分泌信号序列、血凝素纯化标签，并具有C端跨膜锚定序列，可引导蛋白通过分泌途径定位于细胞质膜表面。通常我们在载体编码的跨膜锚定序列前方插入一个终止密码子，以使蛋白能够分泌至条件培养基中。

人胚胎肾（HEK）293T 细胞广泛可得，易于培养和转染。HEK 293T 细胞常规用于表达哺乳动物蛋白，但被视为具有生物危害性，应在生物安全二级条件下操作。请穿戴适当的个人防护装备；操作应在经认证的生物安全柜内采用无菌技术进行。所有废弃物和工作表面应根据机构和政府指南进行消毒。建议在使用前检测细胞是否存在支原体污染。细胞可用环丙沙星（10 μg/ml）处理十天，以清除任何支原体属污染源。 HEK 293T 细胞传代的一般操作流程另见（方框 1）。

有关测试规模和大规模蛋白质表达的其他注意事项，参见文献^11-15。

2. 小规模测试表达

在完成载体构建并制备后，可使用 HEK 293T 细胞进行小规模测试转染；以下示意图总结了该过程（图 1）。

1. 根据需要进行的检测表达数量，选用 T75 cm² 或 T225 cm² 细胞培养瓶培养 HEK 293T 细胞，并在细胞达到 100% 汇合时每 2–3 天传代一次（方框 1）。
2. 在 6 孔板中每孔接种 2.5 × 10⁵ 个 HEK 293T 细胞，加入 2 ml 含 1× 青霉素-链霉素和 10% (v/v) 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基，轻轻摇动培养板以确保每孔中细胞均匀分布，并在 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中过夜孵育。
3. 当 HEK 293T 细胞达到 40% 汇合度时，弃去培养基，向每孔加入新鲜的 2 ml 含 1× 青霉素-链霉素和 10% (v/v) FBS 的 DMEM 培养基，进行转染实验。
4. 将 90 μl 无血清 DMEM 分装至无菌的 1.5 ml 微量离心管中。用移液器加入 3 μl GeneJuice 至无血清 DMEM 中，轻轻混匀（手指轻弹混匀），室温孵育 5 分钟。
5. 向 DMEM-GeneJuice 混合液中加入 1 μg 经 MiniPrep 纯化的质粒 DNA（DNA 储存液浓度 = 100 ng/μl），手指轻弹混匀，室温孵育 15 分钟。
6. 将转染混合物逐滴加入 HEK 293T 细胞中，轻轻摇动 6 孔板以使转染混合物均匀分布。将 6 孔板置于 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育。
7. 转染后 24 小时，向每孔加入 1 ml 新鲜的含 1× 青霉素-链霉素和 10% (v/v) FBS 的 DMEM 培养基，继续孵育 48 小时（总计 72 小时）。
8. 转染后第三天，从每孔收集 1 ml 上清液，于室温下以 16,000 g 离心 10 分钟。随后按照 方框 2 中所述步骤进行 Western 印迹分析。样品可储存于 4 °C，具体储存时长取决于目标蛋白的稳定性。

3. 大规模测试表达与纯化

一旦确定了构建体，即可通过PEI转染贴壁的HEK 293T细胞，在10层细胞工厂（图2；表面积6360 cm²）中实现毫克级重组蛋白的表达。对于更初步的探索性研究，可使用较小的细胞工厂或T形瓶（表1）。

1. 使用MaxiPrep质粒纯化试剂盒纯化1 mg用于转染的DNA。500 ml的XL-1 Blue菌过夜培养应至少产生1 mg的纯DNA。通过测定A₂₆₀/A₂₈₀比值检测DNA纯度，比值应高于1.8。
2. 将HEK 293T细胞扩增至2.0 × 10⁸个细胞。每个生长至100%汇合度的T225 cm²培养瓶平均含有约2.25 × 10⁷个细胞。
3. 向10层细胞工厂中加入1.2 L含5% (v/v) 胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。将2.0 × 10⁸个HEK 293T细胞加入细胞工厂，并均匀分布至所有层。在细胞工厂中很难观察细胞的汇合度。作为替代方法，可使用与10层培养装置相同细胞数与表面积比例，在T75 cm²培养瓶中接种适量细胞，并监测该培养瓶中的细胞生长速率。有关细胞工厂操作的指导，请参见相关视频。在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜，以促进细胞贴壁和生长。
4. 当贴壁的HEK 293T细胞达到70%汇合度时，进行大规模转染。在生物安全柜中，使用无菌T75 cm²培养瓶配制PEI-DNA转染混合物（PEI与DNA的质量比为3:1）。将0.84 mg DNA与84 ml无菌1× PBS混合，然后加入2.5 ml PEI（共2.5 mg PEI）。室温孵育15分钟，溶液应变得浑浊。
5. 将PEI-DNA转染混合物缓慢倒入细胞工厂中，并均匀分布至所有层。可选：为提高表达产量，可加入丙戊酸（终浓度4 mM）。在37 °C、5% CO₂条件下孵育四天。
6. 转染后第四天收集上清液。将条件培养基在4 °C下以6000 × g离心30分钟。进一步使用0.22 μm Stericup真空滤器装置过滤上清液。10层细胞工厂可重复使用，清洁方法见Box 3。关键是在收集上清液后立即开始清洁；切勿让细胞干燥附着在容器表面。
7. 使用Centramate切向流过滤系统将上清液浓缩至75 ml。
8. 加入500 ml PBS，再次浓缩至75 ml。重复此步骤三次，以彻底完成样品的缓冲液置换。
9. 用1× PBS平衡1 ml抗HA亲和柱，并以重力流方式以流速<1 ml/min上样浓缩后的样品。
10. 用30 ml 1× PBS-Tween20洗涤层析柱。
11. 将HA肽溶解于1× PBS中（1.0 mg/ml），并在37 °C下孵育。
12. 将1 ml HA肽溶液上样至抗HA柱，使肽流入树脂。收集穿流液。当肽溶液到达柱床高度时停止流速。
13. 将整个抗HA柱在37 °C下孵育15分钟。
14. 重复步骤12两次。
15. 向抗HA柱中加入1 ml 1× PBS，并使其流入树脂直至到达柱床高度。收集穿流液。
16. 用10 ml 0.1 M甘氨酸（pH 2.2）再生抗HA柱。用10 ml PBS洗涤，并将亲和柱保存在含0.02% (w/v) NaN₃的PBS中，4 °C储存。
17. 进行SDS-PAGE分析，并根据结果合并相应组分。注意：HA肽会干扰通过A₂₈₀或Bradford法测定的蛋白浓度。为估算蛋白含量，可在SDS-PAGE凝胶上样5、10、15、25 μg的BSA作为标准品，并比较条带强度。

可重复步骤 9-17 以从条件培养基中捕获更多的蛋白质。

4. 代表性结果

本文介绍并展示了一种便捷的表达平台，可用于生产毫克级的人源蛋白，所得蛋白可进一步用于结构与功能研究。利用6孔板中的HEK 293T细胞对人源蛋白构建体进行筛选，能够高效且有效地识别出适用于大规模表达的构建体。商用表达载体可通过多种转染试剂（如GeneJuice、FuGene HD或PEI）在HEK 293T细胞中实现高效转染。我们建议在测试表达时使用商用转染试剂（如GeneJuice或FuGene HD），因为这些试剂对表达水平较低的蛋白更为有效（图3）。用于大规模表达的构建体应在Western blot上表现为单一且信号强的条带，其迁移位置对应于预期的分子量（图3）。由于糖基化存在异质性，糖蛋白可能呈现较宽的条带。我们已证实，多种大分子蛋白，包括病毒糖蛋白、细胞因子、细胞因子受体及其他表面蛋白，均可利用该通用表达平台进行表达与纯化，获得毫克级的蛋白产物（图4）。

图1. 小规模转染操作流程示意图。 点击此处查看高清大图。

图2. 用于大规模蛋白表达的Corning 10层CellSTACK。 每层提供636 cm²的细胞贴附表面积。标准实验室CO₂培养箱（6.0立方英尺）可轻松容纳四个10层细胞工厂。

图3. 多种分泌蛋白的小规模表达。 我们使用常见的转染试剂（GeneJuice、FuGene HD 和 PEI）进行了一系列小规模测试表达。(a) 选定的人源细胞蛋白（tetherin）、受体（IL-2R β亚基）和细胞因子（IL-2）的Western blot筛选。Tetherin是一种人膜糖蛋白，可抑制新生HIV-1病毒颗粒的释放¹⁶。Tetherin的胞外域以糖基化、二硫键连接的二聚体形式存在，分子量约为36 kDa。在还原条件下（如此处所示），tetherin以单体形式迁移，表观分子量约为22 kDa。白细胞介素-2（IL-2）是一种参与淋巴细胞增殖的细胞因子（约17 kDa）¹⁷。它与IL-2受体复合物相互作用，其中IL-2R β亚基（约26 kDa）是其组成部分之一¹⁸。CD21是一种膜蛋白，参与补体系统对B细胞的活化与成熟过程，同时也是EB病毒（Epstein-Barr病毒）的受体。CD21的糖基化胞外域以单体形式迁移，表观分子量约为20 kDa。(b) 选定的病毒表面糖蛋白（XMRV Env 和 ebolavirus GP）的Western blot筛选。XMRV 和 ebolavirus 糖蛋白（跨膜锚定区已删除）在病毒膜上以三聚体刺突形式存在，参与宿主细胞的附着与融合过程。XMRV Env 和 EBOV GP 的胞外域富含N-连接聚糖，其表观分子量分别约为70 kDa 和 75 kDa。

图4. 来自大规模HEK 293T细胞培养的纯化人源细胞蛋白。所有蛋白均使用10层细胞工厂表达，并通过抗HA亲和层析进行浓缩和纯化。如考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析所示，白细胞介素-2受体（IL-2R）α和γ亚基的胞外域分别迁移至40 kDa和46 kDa的分子量位置。在非还原条件下，tetherin的胞外域以二聚体形式迁移，表观分子量为36 kDa。请注意，在表观分子量60 kDa处可见少量BSA污染。此外，tetherin、IL-2R α和IL-2R γ上存在的N-连接糖链的异质性导致SDS-PAGE凝胶中条带展宽。这些复杂型N-连接糖链可通过肽：N-糖苷酶F处理去除。

容器	表面积
6孔板	9.5 cm2（每孔）
100 mm 培养皿	55 cm2
245 mm 培养皿	500 cm2
T75 cm2 培养瓶	75 cm2
T175 cm2 培养瓶	175 cm2
T225 cm2 培养瓶	225 cm2
滚瓶-普通型	850 cm2
滚瓶-扩展表面型	1700 cm2
1层 CellSTACK	636 cm2
2层 CellSTACK	1272 cm2
5层 CellSTACK	3180 cm2
10层 CellSTACK	6360 cm2
40层 CellSTACK	25,440 cm2

表1. 用于蛋白质表达的细胞培养容器比较。

试剂配方列表

100倍浓度环丙沙星 配制10 ml溶液，将10 mg环丙沙星加入10 ml去离子水中。加入10 μl 6N HCl以完全溶解环丙沙星。

PEI（1 mg/mL） 配制100 mL溶液时，将100 mg的25 kDa线性PEI溶于去离子水中，并加热至80 °C。冷却至室温后，调节pH至7.2，用0.22 μm滤器过滤除菌，分装后于-20 °C冷冻保存以长期储存。

1X PBS 配制1 L水溶液：8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.4 g Na₂HPO₄（无水）、0.24 g KH₂PO₄。调节溶液pH至7.4，定容至1.0 L。

1X PBS-吐温-20 配制1 L水溶液：8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.4 g Na₂HPO₄（无水）、0.24 g KH₂PO₄、1 ml 吐温-20。调节溶液pH至7.4，并定容至1.0 L。

1× 转膜缓冲液 配制 1 L 水溶液：3.0 g Tris 碱，14.4 g 甘氨酸，150 ml 甲醇。

1× SDS-PAGE 电泳缓冲液 配制 1 L 水溶液：3.0 g Tris 碱，14.4 g 甘氨酸，1.0 g SDS。

SDS-PAGE 还原性上样缓冲液 配制 10 ml 溶液：0.6 g SDS，3 ml 甘油，1.8 ml 1.0 M Tris-HCl（pH 6.8），1 mg 溴酚蓝，5%（v/v）2-巯基乙醇。

方框 1. 细胞传代培养的一般方案

1. 在添加了10% (v/v) 胎牛血清（FBS）和1×青霉素-链霉素（pen/strep）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO₂ 湿润环境中培养HEK 293T细胞。
2. 在倒置显微镜下观察细胞。当细胞达到100%汇合度时，移除并弃去培养基。
3. 用5 ml无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，以去除残留血清。弃去PBS冲洗液。
4. 向T225 cm² 培养瓶中加入2 ml 0.05% (w/v) 胰蛋白酶-EDTA溶液（或向T75 cm² 培养瓶中加入1 ml 0.05% (w/v) 胰蛋白酶-EDTA溶液），室温孵育至细胞从培养表面脱落。也可使用无菌1×PBS-EDTA溶液使HEK 293T细胞脱落。
5. 向T225 cm² 培养瓶中加入13 ml含10% (v/v) FBS的DMEM（或向T75 cm² 培养瓶中加入9 ml含10% (v/v) FBS的DMEM），以终止胰蛋白酶反应。
6. 按1:5比例传代细胞。对于T225 cm² 培养瓶，将3 ml细胞悬液加入含有1×青霉素-链霉素和10% (v/v) FBS的新鲜DMEM培养基27 ml中；对于T75 cm² 培养瓶，将2 ml细胞悬液加入8 ml新鲜生长培养基中。将细胞培养物置于37 °C、5% CO₂ 湿润环境中孵育。细胞应在两天内生长至100%汇合度。

方框 2. 蛋白质印迹分析

1. 向30 μl细胞培养上清液中加入10 μl SDS-PAGE还原性上样缓冲液。将样品和预染蛋白分子量标准品加入聚丙烯酰胺凝胶中，使用1× SDS-PAGE电泳缓冲液在175 V条件下电泳1小时，或直至分子量标准品条带清晰分离。
2. 将PVDF Immobilon-P膜浸入100%甲醇中1分钟以活化。
3. 组装蛋白质印迹转膜装置。确保PVDF膜朝向正极，并始终保持所有组件被1×转膜缓冲液浸湿。避免聚丙烯酰胺凝胶与膜之间产生气泡。
4. 将电泳槽完全充满1×转膜缓冲液，在100 V条件下转膜1小时。
5. 用含5%（w/v）脱脂奶粉的1× PBS-Tween20溶液室温封闭膜1小时，或4 °C过夜。
6. 加入用含5%（w/v）脱脂奶粉的1× PBS-Tween20溶液稀释的一抗单克隆抗体（例如1:1000稀释的抗HA单克隆抗体或其他合适的抗体），室温孵育1小时，或4 °C过夜。
7. 用1× PBS-Tween20溶液洗涤膜10分钟，重复洗涤两次。
8. 加入碱性磷酸酶标记的单克隆二抗（用含5%（w/v）脱脂奶粉的1× PBS-Tween20溶液按1:1000稀释），室温孵育1小时，或4 °C过夜。
9. 用1× PBS-Tween20溶液洗涤膜10分钟，重复洗涤两次。
10. 将膜放入一个小容器中，加入5 ml碱性磷酸酶底物（BCIP/NBT）溶液。显色反应应在1–5分钟内出现。当条带达到理想强度后，用去离子水洗涤并自然晾干。颜色可能随时间褪去；膜干燥后应立即进行电子扫描保存图像。

方框 3. 细胞培养器皿的清洗与回收

尽管细胞工厂设计为一次性使用，但这些容器可通过以下清洗方案进行回收，用于额外的大规模转染：

1. 从10层细胞工厂中倾倒上清液后，立即加入20% (v/v) 次氯酸钠溶液并剧烈振荡以使细胞脱落。室温孵育三小时。
2. 排空容器，加入新鲜的20% (v/v) 次氯酸钠溶液，室温下过夜孵育。
3. 排空容器，用1.5 L去离子水清洗，重复三次。
4. 排空10层细胞工厂，加入0.5 L无菌1× PBS缓冲液，其中添加10×抗生素/抗真菌溶液。将容器在室温下储存，并在下次使用前将通气盖更换为填充口盖（标准33 mm螺纹盖）。注意：清洁后所有层应完全透明，若未达到此标准，请勿使用，并根据机构规定处理废弃细胞工厂。

讨论

10层细胞工厂是生产毫克级蛋白质的有效容器。相较于滚瓶、摇瓶或搅拌瓶等传统容器，使用细胞工厂的一个主要优势在于无需购置任何额外的实验设备。一个标准的CO₂培养箱（约6.0立方英尺）可轻松容纳四个10层细胞工厂（图2）。此外，这些容器在细胞与蛋白生产过程中所需的人力和空间均少于培养皿、培养瓶或滚瓶；一个10层细胞工厂相当于7.5个常规滚瓶的产量（表1）。更重要的是，HEK 293T细胞在这些容器中适应良好，并且非常适合通过PEI进行瞬时转染，从而为商业转染试剂提供了一种低成本且高效的替代方案。尽管细胞工厂设计为一次性使用的细胞培养塑料器皿，但我们已能够多次高效地清洗并重复使用这些容器，且未出现污染问题，从而显著降低了每次使用的成本。利用10层细胞工厂进行瞬时蛋白表达，可获得约1–10 mg的纯化蛋白（图4），具体产量取决于目标蛋白及其修饰情况。从克隆和小规模表达到完成大规模表达与纯化，整个过程大约需要3–4周。总之，这是一种快速、通用的表达平台，在分泌型人源或病毒表面蛋白的生产中具有很高的应用价值。此外，该平台还可用...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
碱性磷酸酶（BCIP/NBT）液体底物溶液	Sigma	B6404
抗生素/抗真菌素，100倍浓缩液	Invitrogen	15240062
抗HA亲和层析基质，克隆株3F10	Roche	1815016
抗HA小鼠单克隆抗体，克隆株16B12	Covance	MMS-101P
细胞培养瓶，T75 cm2，组织培养处理	Corning	430641
细胞培养瓶，T225 cm2，组织培养处理	Corning	431082
细胞培养板，6孔，组织培养处理	Corning	3516
细胞工厂，10层CellSTACK	Corning	3312
Centramate Omega 5K 转流过滤盒	Pall	OS005C12
Centramate Omega 30K 转流过滤盒	Pall	OS030C12
层析玻璃柱，1.0×10 cm	Kontes	4204001010
环丙沙星	Sigma	17850
CO2
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma	D5796
胎牛血清（FBS），热灭活	Invitrogen	12484-028
FuGENE HD 转染试剂	Promega	4709691001
GeneJuice 转染试剂	EMD/Merck	70967-6
甘氨酸	Sigma	G8898
山羊抗小鼠IgG F(ab')2 碱性	Thermo Scientific	31324
磷酸酶偶联抗体
血凝素（HA）肽，100 mg	Genscript	定制合成
（序列：YPYDVPDYA；纯度95%）
HEK 293T 细胞	ATCC	CRL-11268
家用漂白剂（4% w/v 次氯酸钠）	多个品牌可选
Immobilon-P PVDF 膜	Millipore	IPVH07850
质粒小量提取试剂盒，PureLink Quick	Invitrogen	K2100-11
质粒大量提取试剂盒，PureLink HiPure	Invitrogen	K2100-07
NaN3	Sigma	S8032
pDISPLAY 表达载体	Invitrogen	V660-20
青霉素/链霉素（青/链），100倍浓缩液	Invitrogen	15140-122
磷酸盐缓冲液（PBS），无菌1倍浓度	Sigma	D8537
聚乙烯亚胺（PEI），线性，25 kDa	Polyscience	23966
脱脂奶粉干粉	Carnation
Stericup-GP PES 真空过滤装置，	Millipore	SCGPU05RE
0.22 μm，500 ml 容量
台盼蓝	Invitrogen	15250061
胰蛋白酶-EDTA，0.05%（w/v）	Invitrogen	25300-054
Tween-20	Sigma	P7949
丙戊酸	Sigma	P4543
Centramate 切向流系统	Pall
CO2 培养箱，加湿，标准6.0立方英尺	多个品牌可选
电泳及转膜装置	多个品牌可选
培养箱，37 °C	多个品牌可选