一个从人体细胞分泌蛋白生产的方便，一般的表达平台

摘要

在人类后基因组时代，在本机构的重组蛋白的结构，功能和治疗的研究和发展是至关重要的。在这里，我们描述了测试和大规模的蛋白质在人类胚胎肾细​​胞293T，可用于生产各种重组蛋白表达系统。

摘要

重组蛋白在细菌中表达，通常大肠杆菌大肠杆菌 ，一直毫克的蛋白质数量表达的最成功的战略。然而，原核主机通常是不为人类，病毒或真核蛋白质由于外国高分子毒性，在蛋白质折叠机制的差异，或因缺乏特别合作或翻译后的修改，在细菌的适当表达。基于酵母（ 毕赤酵母或酵母 ^）1,2，杆状病毒感染的昆虫（S.秋行军虫或 T 妮 ）细胞^3，和无细胞体外翻译系统的表达系统^2,4已被成功地用于生产哺乳动物蛋白质。直观，最匹配的是，使用哺乳动物的主机，以确保包含正确的翻译后修饰的重组蛋白的生产。一些哺乳动物细胞株人类胚胎小子（滋肾（HEK）293，C V-1细胞在 O rigin携带的 S V40 larget T抗原（COS）中国仓鼠卵巢（CHO），和其他人）已成功地利用过度毫克数量的人体蛋白质数量^5-9。然而，使用哺乳动物细胞中的优势往往成本较高，专业实验室设备的需求，降低蛋白质产量，和漫长的时间发展稳定表达细胞株的反击。提高产量和生产蛋白质的速度，同时保持成本低，是许多学术和商业实验室的主要因素。

在这里，我们描述了时间和成本效益，由两部分组成，附着HEK 293T细胞分泌的人类蛋白质表达过程。这个系统是能够生产微克到毫克数量的功能蛋白质结构，生物物理和生物化学研究。第一部分，是产生多个感兴趣的基因结构并行和瞬时转成小规模的附着的HEK 293T细胞。重组蛋白分泌到细胞培养液中的检测和分析，进行印迹分析，使用市售的抗体对矢量编码的蛋白质纯化标签指示。随后，适合大规模蛋白质生产结构瞬时转染使用聚乙烯亚胺（PEI）在10层的细胞工厂。成升体积的条件培养基中分泌蛋白集中到管理大量使用切向流过滤，净化，抗HA的亲和层析。这个平台的效用证明毫克量的细胞因子，细胞因子受体，细胞表面的受体，内在的制约因素，与病毒糖蛋白的表达能力。这种方法也被成功地用于三聚ebolavirus糖^5,10结构的决心。

培养箱 ，是必需的。这个过程可能会迅速扩大到更复杂的系统，如蛋白质复合物，抗原和抗体，疫苗生产的病毒样颗粒，或生产困难的细胞株转导的腺病毒或慢病毒表达。

方案

1。准备工作 - 构造和细胞培养

在开始的协议之前，应该感兴趣的基因密码子优化，在哺乳动物细胞中表达，并克隆到一个合适的表达载体，利用标准的分子生物学技术。为了确保最高的成功表达的机会，应产生多个感兴趣的基因变种。许多哺乳动物表达载体可商业化，并有各种净化标签（多聚组氨酸，血凝素，链，晕标签，谷胱甘肽S-转移，等等）。我们更倾向于使用pDISPLAY载体，强大的人类巨细胞病毒启动子，免疫球蛋白κ分泌信号，血凝素纯化标签编码，并拥有C-末端的跨膜锚定目标蛋白通过细胞膜上显示的分泌途径。我们通常插入一个终止密码子在前面的向量编码的跨膜安乔r以使蛋白质分泌到条件培养基。

人胚肾293T细胞（HEK）被广泛使用，容易培养和转染。的HEK 293T通常用于哺乳动物蛋白的表达，但被认为是生物危害性，并应在生物安全2级处理。请穿着适当的个人防护服装;工作应在批准的生物安全柜使用无菌技术进行。根据体制和政府的方针，所有废物和表面应进行消毒处理。据建议，细胞被支原体污染，在使用前进行测试。细胞可被视为与环丙沙星（10微克/毫升）为10天，以消除任何支原体菌源。污染。 传播HEK 293T细胞的总协议单独列示（1盒）。

测试和大规模蛋白表达的其他注意事项reviewe在^11-15。

讨论

10层的细胞工厂生产毫克的蛋白质数量的有效容器。使用超过其他传统的船只，如滚瓶，摇瓶或微调瓶，电池工厂的一个主要优点是，它们不需要任何额外的实验室设备的采购。一个标准的_二氧化碳培养箱（6.0立方英尺）轻松容纳4个10层的细胞工厂（ 图2）。此外，这些船只需要较少的劳动比菜，瓶或滚瓶细胞和蛋白质的产生和空间;一个10层的细胞工厂，相当于使用7.5定期滚瓶（ 见表1）。更重要的是，很好地适应HEK 293T细胞中的船只，非常适合由PEI瞬时转染的，从而提供了一种低成本和有效的选择商业的转染试剂。虽然电池的工厂被设计为一次性细胞培养塑料制品，我们有bEEN能够有效地清理和重新使用这些船只多次，没有污染问题，从而大大降低其每次使用成本。瞬态蛋白表达，使用的是10层的细胞工厂能够生产〜1-10毫克纯化蛋白（ 图4），根据蛋白质和其修改。这是可以去克隆和小规模表达大规模表达和纯化约3-4周完成。总之，这是一种快速，一般的平台，是非常有用的人或病毒表面的蛋白质分泌的生产。此外，这个平台也可以被用来表达抗体，病毒样颗粒，腺病毒和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂名称	公司	目录编号	评论
碱性磷酸酶（BCIP / NBT）的液体底物溶液。	西格玛	B6404
抗生素/抗霉菌，100X	Invitrogen公司	15240062
抗HA的亲和力矩阵，克隆3F10	罗氏公司	1815016
鼠单克隆抗体，抗-HA克隆16B12	Covance公司	MMS-101P
细胞培养瓶的T75厘米2组织文化对待	康宁	430641
细胞培养瓶，T225厘米2组织文化对待	康宁	431082
细胞培养板,6-以及组织培养处理	康宁	3516
电池厂，10层CellSTACK的;	康宁	3312
centramate欧米茄5K盒式	鲍尔	OS005C12
centramate欧米茄30K磁带	鲍尔	OS030C12
玻璃层析柱，1.0×10厘米	kontes	4204001010
环丙沙星	西格玛	17850
的CO 2
杜尔贝科的改良Eagle的媒体（DMEM培养基）	西格玛	D5796
胎牛血清（FBS），热灭活	Invitrogen公司	12484-028
FuGENE的HD转染试剂	Promega公司	4709691001
GeneJuice转染试剂	EMD /默克	70967-6
甘氨酸	西格玛	G8898
山羊抗鼠IgG F（AB'）2碱性	Thermo Scientific的	31324
磷酸酶抗体
血凝素（HA）肽，100毫克	金斯瑞	定制合成
（序列YPYDVPDYA纯度为95％）
HEK 293T细胞	ATCC	CRL-11268
householð漂白剂（4％W / V次氯酸钠）	各种品牌
的Immobilon - P PVDF膜	Millipore公司	IPVH07850
小量质粒纯化试剂盒，快速PureLink	Invitrogen公司	K2100-11
MaxiPrep质粒纯化试剂盒，PureLink HiPure	Invitrogen公司	K2100-07
南三	西格玛	S8032
pDISPLAY表达载体;	Invitrogen公司	V660-20
青霉素/链霉素（笔/链球菌），100X	Invitrogen公司	15140-122
磷酸盐缓冲液（PBS），无菌1X	西格玛	D8537
聚乙烯亚胺（PEI），线性25 kDa的	polyscience	23966
脱脂牛奶干粉	康乃馨
stericup-GP PES真空过滤装置，	Millipore公司	SCGPU05RE
0.22微米，500毫升容量
台盼蓝	Invitrogen公司	15250061
胰蛋白酶-EDTA，0.05％（W / V）	Invitrogen公司	25300-054
吐温20	西格玛	P7949
丙戊酸	西格玛	P4543
Centramate切向流系统	鲍尔
CO 2培养箱孵化器，标准的6.0立方米。英尺。	各种品牌
电泳和转印装置	各种品牌
孵化器，37℃	各种品牌