扩散荧光断层成像为临床前研究提供了一种相对低成本且潜在高通量的方法 体内 肿瘤成像。本文介绍了在小鼠胶质瘤模型中，利用荧光靶向肿瘤生物标志物表皮生长因子受体，结合计算机断层扫描引导的非接触式时间域系统，进行光学数据采集、校准及图像重建的方法学。
本文内容
摘要
摘要
小动物荧光分子成像（FMI）可成为临床前药物发现与开发研究中的强大工具1。然而，组织中的生色团（如血红蛋白、水、脂质、黑色素）对光的吸收通常会限制光信号在数毫米以上厚度组织中的传播2。与其他可见光波长相比，红光和近红外（近-IR）光在组织中的吸收显著降低，非弹性散射成为光与组织相互作用的主要机制。近年来，随着能够吸收并发射近红外范围（600–1000 nm）光的荧光探针的出现，推动了成像系统及光传播模型的发展，使得在小动物体内实现全身三维成像成为可能3。
尽管该领域已取得显著进展，但漫射荧光断层成像的病态性问题仍然是影响图像重建技术稳定性、对比度恢复能力及空间分辨率的主要障碍，目前尚未就小动物荧光分子成像（FMI）的最佳方法达成共识。大多数研究团队采用基于电荷耦合器件（CCD）的系统，这类系统可提供丰富的组织采样，但灵敏度次优4-9；而我们团队及少数其他团队10-13则致力于采用极高灵敏度探测器的系统，但目前这类系统仅能在牺牲较低成像通量的前提下实现密集的组织采样。本文展示了在荧光断层成像系统中应用单光子探测技术，以在小鼠模型中定位脑部癌性病灶的方法学。
采用单光子计数光电倍增管（PMT）和信息丰富的时域光检测的荧光断层成像（FT）系统，以非接触构型工作11这实现了激发光和发射光的同步采集，并包含自动荧光激发曝光控制功能14，激光定位，以及与小动物计算机断层扫描（microCT）系统的共配准15采用裸鼠模型进行成像。将人胶质瘤细胞系（U251）原位接种于小鼠左侧大脑半球，两周后进行成像。通过注射靶向表皮生长因子受体（一种在U251肿瘤细胞系及多种其他癌症中高表达的细胞膜蛋白）的荧光示踪剂IRDye 800CW-EGF（LI-COR Biosciences, Lincoln, NE），使肿瘤产生荧光信号。18另一种非靶向性荧光示踪剂Alexa Fluor 647（Life Technologies，Grand Island，NY）也被注射，以校正非受体介导的示踪剂摄取效应，从而提供一种量化示踪剂结合及受体可用性/密度的方法。27采用CT引导的时域算法重建两种荧光示踪剂的位置即，小鼠脑内肿瘤的位置），并通过对比增强磁共振成像验证了其定位肿瘤的能力。
尽管本视频中展示的是在胶质瘤小鼠模型中的荧光成像应用，但该方法可拓展至多种小型动物模型中的不同肿瘤模型，潜在适用动物体型可达大鼠大小17。
方案
1. 动物准备
- 通过腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪（100 mg/kg : 10 mg/kg i.p.）对裸鼠（Charles River, Wilmington, MA）进行麻醉。
- 将小鼠固定于立体定位仪中，在颅骨左侧头皮做一切口，并使用18号针头在距中线2 mm、前囟后方2 mm处钻出直径为1 mm的颅骨孔。
- 将5×105个U251人源神经胶质母细胞瘤细胞（由美国新罕布什尔州汉诺威达特茅斯学院Mark Israel博士惠赠）悬浮于5 μL磷酸盐缓冲液中，注入左侧大脑半球，进针深度约为脑表面下2 mm。使用Hamilton微量注射器18和钝头27号针头植入细胞，针尖插入颅骨外表面以下3 mm，然后回撤1 mm，以形成供细胞植入的腔隙。
- 缝合切口，并让小鼠术后恢复。
- 等待约14天，使肿瘤充分生长，然后进行成像。
2. 荧光断层成像系统校准
- 在小鼠成像当天，启动系统并让激光器和光探测器预热约20分钟，以避免系统灵敏度发生漂移。
- 将一个100°×4°的工程线性扩散器（Thorlabs, Newton, NJ）置于成像支架正中央，使其垂直于激发激光：即一个皮秒脉冲、80 MHz多模635 nm激光二极管（PicoQuant Photonics North America Inc., Westfield, MA）。调节扩散器的角度，以最大化所有五个光收集通道检测到的信号量。有关成像几何结构的完整描述见其他文献11,14,15。
- 在所有荧光检测用光电倍增管（PMT）前方放置OD 2中性密度滤光片（Thorlabs, Newton, NJ），在所有透射检测用PMT前方放置OD 1中性密度滤光片（Thorlabs, Newton, NJ）。采集100次激光的时间脉冲展宽曲线（TPSF），每次积分时间为1秒。
- 使用激光参考信号对每个TPSF进行归一化，校正激光参考信号的时间漂移，并对每个探测器的所有迭代结果取平均。这些平均后的TPSF即为光学图像重建中所用的探测器特异性仪器响应函数（IRF）。
3. 成像方案
- 使用氧气（1 L/min）中的 2% 异氟烷对小鼠进行麻醉。
- 注射1纳米摩尔IRDye 800CW-EGF和1纳米摩尔Alexa Fluor 647 100 μl 在成像前12小时，通过腹腔注射磷酸盐缓冲液，以靶向肿瘤中表皮生长因子受体的过表达。
- 将小鼠放置于成像床的玻璃纤维支撑上，调整小鼠位置，使其鼻部保持在输送异氟烷麻醉气体的鼻锥内。
- 确保小鼠在床面上的位置适当： 即，当床体固定到荧光断层成像系统时，小鼠应大致位于成像机架的中心位置。该定位可通过旋转激发激光器进行引导 180° 确保激光的焦点从激光器各个角度照射时，均大致位于小鼠的中心位置。
- 定位完成后，小心地将成像床及小鼠转移至 microCT（eXplore Locus，GE Healthcare，London，ON）扫描仪中，并以 93- 的分辨率采集解剖学信息μm 小鼠整个头部的各向同性
- 可视化 CT 图像序列，并选择需使用荧光断层成像系统进行成像的切片。
- 小心地将成像床和小鼠移回荧光断层成像系统。从步骤3.6的CT图像序列中选择每个成像切片所需采集的小鼠数据的光源位置数量（32）、每次TPSF测量的积分时间（1 s）、每个光源位置的迭代次数（10），以及目标成像切片的位置和数量。括号中的数值为各成像参数的典型取值，可使每个成像切片的数据采集时间约为5分钟。
- 在荧光检测PMT前放置三陷波滤光片（Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT），以阻止激光进入荧光检测器，同时在透射检测PMT前放置OD 2中性密度滤光片，以避免这些检测器发生饱和。
- 运行数据采集软件，在每个定义的光源-探测器位置以及每个激发波长（635 nm 和 755 nm，分别用于激发 Alexa Fluor 647 和 IRDye 800CW-EGF 示踪剂）下采集荧光和透射率TPSFs。对于每组采集的TPSFs，使用参考PMT通道监测并记录激光强度。
4. 图像重建
- 根据CT图像确定小鼠的外表面以及成像床支撑杆的位置，并分别创建覆盖小鼠轮廓和成像杆区域的掩膜。
- 利用小鼠掩膜，使用NIRFAST软件19生成动物的有限元网格。
- 基于微CT与荧光空间配准坐标20，将荧光断层成像系统的光源和探测器位置定位在网格表面。
- 剔除与成像床支撑杆位置相互重叠的光源或探测器所对应的光学数据点。
- 以激光参考信号对每个源-探测器位置采集的数据进行归一化，校正激光参考信号的时间漂移，并根据采购时通过实验测定的滤光片灵敏度进行校正15。
- 对每个源-探测器位置的数据计算Born比值（荧光信号除以透射信号），并乘以基于有限元动物网格在均匀光学参数条件下模拟的透射前向模型。该步骤用于减小光源或探测器与组织耦合相关误差21，实现数据与模型的校准22，并校正其他因素引起的模型与数据不匹配23,24。
- 构建一个数据向量，其成分为两个波长下采集的Born比值数据的缩放差值。缩放因子的选择旨在最大化EGFR结合对比度。以每个检测通道的时间域点扩散函数（TPSF）作为输入，使用校准后的差分数据进行时间域图像重建，并生成对比增强靶向示踪剂的荧光分布图15。
5. 代表性结果
小鼠头部U251原位胶质瘤模型的荧光重建图像与共同配准的CT解剖图像叠加示例展示如下 图1b由荧光重建确定的胶质瘤质心图1b）位于通过对比增强磁共振成像确定的肿瘤质心1 mm范围内图1a）。CT 与 MRI 图像基于互信息变换进行配准。
图 1. 小鼠头部的增强对比（钆剂）磁共振成像（a）。该小鼠通过原位接种人胶质瘤细胞系 U251 建立模型。肿瘤位于左脑半球（图像右侧），因吸收的对比剂多于正常脑组织，可在图像中清晰可见，并由白色箭头指示。图（b）显示了同一小鼠头部位置的相应计算机断层扫描图像，其中叠加了靶向表皮生长因子的荧光信号减去非靶向荧光重建的结果。荧光信号的单位为 mm⁻¹，其数值与结合态靶向荧光的吸收系数、量子效率及其浓度的乘积相关。
讨论
荧光断层成像（FT）是一种基于可见光和近红外光在生物组织中传输的敏感、无电离辐射的分子成像方式。目前对FT的研究兴趣主要集中在其加速小动物实验模型中药物发现与开发的潜力1，其中一个重要研究方向是癌症生物标志物表达及其对分子治疗的响应26。目前，FT系统设计存在两种相互竞争的技术路线。最常见的设计采用冷却式电荷耦合器件（CCD）相机进行荧光检测4-9。该设计可提供高密度的测量数据，从而最大化组织采样，因为CCD相机的每个像素均可检测到穿过组织特定路径的光信号。然而，CCD相机的动态范围有限，且读出噪声限制了其最终灵敏度。第二种设计则通过采用基于光电倍增管或雪崩光电二极管等探测器的高灵敏度单光子计数技术，避免了CCD相机检测的潜在局限10-13。这些更高灵敏度检测方法的缺点在于每个探测器只能在单一点位收集光信号；因此，为了实现密集的组织采样，要么需使用大量探测器（成本极高），要么需用同一探测器采集多个投影（耗时较长）。尽管目前尚未就小动物FT所需的理想组织采样水平达成共识，且该水平可能因具体情况而异，但学界普遍认为，单光子计数仪器更适合用于探索FT在检测低浓度分子标志物方面的灵敏度极限。在本研究中，我们提供了一种利用单光子计数检测仪器在小鼠中定位肿瘤的荧光断层成像方法。
利用时间相关单光子计数荧光断层成像技术（FT）生成可靠数据集包含四个关键步骤。第一步是采用适当且简便的校准程序。在本方法中，通过采集激发光穿过线性漫射器后的基线信号来校正各检测通道的相对灵敏度，该漫射器可将等量的光引导至每个探测器15。此外，通过激光参考通道的操作，实验过程中检测到的光信号在强度和平均时间两个方面持续相对于激光参考进行校准，以补偿随时间可能发生波动的激光输出11,15。第二步是精确采集并共同配准解剖结构图像，以指导荧光重建。仅凭FT数据本身无法提供解剖信息；因此，为了建立光传输模型，从而根据样品表面检测到的荧光信号重建样品内部荧光源的位置，必须准确定义样品相对于FT系统的解剖结构。在本系统中，解剖信息由微型计算机断层扫描系统获取，并且其空间坐标已与FT系统的坐标实现空间配准15,20。第三步是确保在每个光源-探测器位置均采用最佳曝光（即每个激光投射对应的总光子检测时间）。这一步至关重要，原因有二：一是确保每个检测位置具有足够的信噪比，二是避免探测器饱和，后者可能损坏检测单元。为在每个探测器位置实现最佳曝光，系统采用了自动曝光控制技术，该技术本质上通过两次低信号曝光来三角定位最优曝光参数14。该方法的第四步是将采集的荧光数据归一化至透射激发光的强度。这种归一化处理通常称为Born比，为荧光断层成像带来诸多优势，最主要的是可显著减轻模型与数据之间的不匹配误差23,24。本系统设计为可同时检测荧光信号和透射激发光，方法是将每个检测通道的光路分别导入两个独立的光电倍增管。通过这种方式，我们避免了样品移动对Born比准确性的影响。
在拥有可靠数据集的情况下，时域数据的图像重建涉及求解具有如下表达式的有限元网格的逆问题：
d=Jx
其中 d 是一个向量，具有 n x m n 个源-探测器投影的元素 m TPSF 时间门控； J 是一个 n x m-由-l 灵敏度矩阵（或雅可比矩阵），用于 l 网格中的节点；以及 x 是每个节点中荧光光学特性的向量，具有大小 l. d 是实验过程中收集的校准数据 J 采用有限元法对荧光传输的时间域扩散近似进行求解，以实现模拟25时间维度 J 还与探测器特定的仪器响应函数进行卷积。 x 是所关注的荧光图谱的表征，通过采用Tikhonov正则化的Levenberg-Marquardt非负最小二乘法求解。15.
本文所述方法采用高灵敏度光子计数荧光检测技术，可实现对小鼠体内荧光标记肿瘤的定位，有望突破荧光成像（FT）的技术极限。在先前的研究中，已证实该方法在大于小鼠的动物模型（如大鼠）中的应用潜力，以及在小鼠尺寸样本中相比现有系统设计所具备的更高灵敏度。17该方法的直接应用将是用于生物标志物表达的监测 体内 在小型动物肿瘤模型中以高通量方式评估药物疗效。该系统能够在多个波长下激发并检测荧光，从而实现对多种荧光标记物的同步检测。额外的荧光标记物可同时用于探究病理学的多个方面，或如本研究所示，用于采用更定量的成像方法，例如双报告基因检测法进行测量 体内 结合势能，一种受体密度的标志物26,27.
致谢
本工作获得了美国国家癌症研究所资助项目 R01 CA120368、R01 CA109558（KMT、RWH、FEG、BWP）、RO1 CA132750（MJ、BWP）和 K25 CA138578（FL），以及加拿大卫生研究院博士后奖学金（KMT）的支持。荧光断层成像系统的开发部分由加拿大魁北克省蒙特利尔市的Advanced Research Technologies公司资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| IRDye 800CW-EGF | LI-COR 生物科学 | 926-08446 | |
| Alexa Fluor 647 琥珀酰亚胺酯 | Life Technologies | A20106 | 与水反应以尽量减少非特异性结合 |
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