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方法文章

斑马鱼幼鱼中播散性念珠菌病的非侵入性成像

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DOI：

10.3791/4051

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2012年7月30日

 , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine

本文内容

摘要

斑马鱼发育迅速、个体小且身体透明，这些特性为其在天然免疫控制感染研究中的应用提供了巨大优势1-4。本文展示了通过显微注射技术利用真菌病原体Candida albicans感染斑马鱼幼虫的方法，该方法最近被用于揭示吞噬细胞NADPH氧化酶活性在调控真菌二型性中的作用5。

摘要

由病原体引起的播散性念珠菌病 Candida albicans 是住院患者中的一个临床重要问题，与30%至40%的归因死亡率相关6全身性念珠菌病通常由先天免疫控制，而先天免疫细胞组分（如吞噬细胞 NADPH 氧化酶）存在遗传缺陷的个体则更易发生念珠菌血症7-9关于其动态过程知之甚少 C. albicans 与天然免疫细胞的相互作用 体内 广泛的 体外 研究表明，在宿主之外 C. albicans 在巨噬细胞内萌发，并迅速被中性粒细胞破坏10-14. 体外 研究虽然有用，但无法重现复杂的 体内 环境，包含细胞因子水平的时间依赖性动态变化、细胞外基质黏附以及细胞间接触10, 15-18为了探究这些因素在宿主-病原体相互作用中的贡献，关键在于找到一种模式生物，以便在活体完整宿主中非侵入性地观察感染的这些方面。

斑马鱼幼鱼为感染研究提供了一种独特且多用途的脊椎动物宿主。在发育的前30天内，斑马鱼幼鱼仅具有先天性免疫防御机制2, 19-21，这简化了对高度依赖先天免疫的疾病（如播散性念珠菌病）的研究。斑马鱼幼鱼体型小且身体透明，使得能够在细胞水平上对宿主和病原体的感染动态进行成像观察。携带荧光标记先天免疫细胞的转基因幼鱼可用于识别参与感染的特定细胞类型22-24。修饰后的反义寡核苷酸（Morpholinos）可用于敲低多种免疫组分（如吞噬细胞NADPH氧化酶），并研究其在真菌感染应答中的变化5。除了使用小型低等脊椎动物所具备的伦理和实践优势外，斑马鱼幼鱼还提供了独特的机会，能够在活体内部以彩色方式实时成像病原体与宿主之间的激烈交战过程。

斑马鱼已被用于模拟多种人类致病菌的感染，并在深化我们对分枝杆菌感染的理解方面发挥了重要作用3, 25然而，直到最近，才开始使用真菌等更大的病原体来感染幼虫5, 23, 26，迄今为止尚无关于该感染方法的详细可视化描述。本文中，我们介绍了用于小脑室显微注射的实验技术25 斑马鱼，包括我们对先前方案的修改。我们利用幼体斑马鱼模型研究真菌感染所得的结果与 体外 研究并强调了有必要在宿主复杂的体内环境中，而非在简化的培养皿系统中，考察宿主与病原体之间的相互作用5.

方案

所有斑马鱼饲养方案和实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议 A2009-11-01 进行。

1. 形态学显微注射及幼虫注射培养皿

实验时长： * (10-15 分钟)

难度等级： *

  1. 进行卵注射时，用无菌水配制2%琼脂糖溶液并用微波炉加热。待溶液稍冷却后，倒入一个超深培养皿（Fisher Scientific）中，至培养皿一半满。将培养皿置于冰上冷却，并确保培养皿水平。
  2. 待培养皿冷却后，倒入15 mL的2%琼脂糖作为上层。用喷雾瓶向卵注射用带槽塑料模具（Adaptive Science Tools）喷洒无菌水。小心地将模具的槽面朝下放入热的琼脂糖中。待琼脂糖冷却后，使用金属平头刮刀（VWR Scientific）将模具与琼脂糖分离。缓慢地将网格从琼脂糖中取出。用Parafilm（VWR Scientific）包裹胚胎注射培养皿，倒置于4 °C保存。
  3. 进行鱼幼体注射时，按上述方法配制2%琼脂糖溶液。将溶液倒入标准尺寸的培养皿（VWR Scientific）中，静置至完全凝固。用Parafilm包裹幼体注射培养皿，倒置于4 °C保存。

2. 真菌培养物制备

实验时长： **(30 分钟)

难度等级：**

  1. 制备酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）琼脂平板：每升加入10 g酵母提取物、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖和20 g琼脂，混匀后高压灭菌。YPD液体培养基的制备方法为：每升加入10 g酵母提取物、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖，于121 °C高压灭菌20–30分钟。
  2. 在鱼类感染实验前两天，从冻存的白色念珠菌（Candida albicans）菌种中取样，在YPD琼脂平板上划线培养，以获得单菌落。
  3. 在37 °C下过夜培养。
  4. 向16 × 150 mm的培养管（VWR Scientific）中加入5 mL YPD液体培养基。
  5. 在鱼类感染实验前一天，用木棒（VWR Scientific）挑取YPD琼脂平板上的一个微小菌落，将木棒放入培养管中，轻轻旋转，使菌落重新悬浮于YPD液体培养基中。
  6. 在37 °C下，使用配备14英寸试管转轮的TC-7组织培养滚筒摇床（New Brunswick Scientific）过夜培养。
  7. 次日，取1 mL培养物，在1.7 mL离心管（Axygen）中以14000×g离心1分钟。弃去上清液，通过涡旋振荡（VWR Scientific）将沉淀物在残留液体中重新悬浮。
  8. 加入1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）（VWR Scientific），按前述方法离心。
  9. 重复PBS洗涤3次。
  10. 在1×PBS中进行1:100稀释（将10 μL洗涤后的C. albicans加入990 μL 1×PBS中）。
  11. 使用血细胞计数板（VWR Scientific）进行计数。
  12. 稀释至107 个细胞/mL。

3. 斑马鱼感染

实验持续时间： **** (1-3 小时)

难度等级： ****

  1. 根据第5节收集胚胎，并将其储存在卵水（含60 mg/L Instant Ocean盐（Fisher Scientific）的无菌去离子水中）中。
  2. 使用体视显微镜（如Olympus SZ61（Olympus）），在感染当天去除胚胎的卵膜。使用Dumont Dumoxel镊子（VWR Scientific）将卵膜27像打开薯片袋一样拉开，或在闭合状态下轻轻将镊子插入卵膜，然后缓慢打开。鱼胚应能顺利从卵膜中脱出。
  3. 轻轻旋转带盖的超深培养皿，使鱼体移动至皿中央。将鱼转移到皿盖上。吸除卵水，更换为新鲜培养基，再将鱼加入培养基中。
  4. 将幼鱼注射用培养皿置于28 °C培养箱中预热。配制三卡因甲磺酸盐（tricaine methane sulfonate）（Western Chemical Inc.）稀释液至200 μg/mL，用于麻醉鱼体。
  5. 计数所需数量的幼鱼用于感染（20–50尾）。将鱼放入三卡因甲磺酸盐溶液中，等待1–2分钟，直至其停止活动。
  6. 打开MPPI-3注射装置（Applied Scientific Instruments）。确保压力开关处于“脉冲”模式，“脉冲持续时间”设置为9，背压单元设为3 PSI。打开氮气瓶阀门，直至注射装置上的压力读数为30 PSI。
  7. 将拉制好的玻璃微针28吸取5 μL经涡旋混匀的Candida albicans菌液（浓度为1×107 个细胞/mL）。将微针插入微针夹持器（Applied Scientific Instruments）中。在空的超深培养皿中加入水。通过体视显微镜观察，移动微针使其尖端刚好接触水面并进入视野，使用Dumont Dumoxel镊子（VWR Scientific）在距拉制微针尖端约3 mm处剪断针尖。
  8. 踩下脚踏开关（Applied Scientific Instruments）以确认针尖已剪断。若操作成功，应可见液体扩散。液滴体积直径不应超过原始25斑马鱼幼鱼瞳孔的直径（0.21 mm，对应体积约为4.9 nL的球体）。若液滴过大或过小，需相应调整压力。
  9. 用三卡因甲磺酸盐（200 μg/mL）麻醉鱼体。待鱼停止活动后，盖上皿盖轻轻旋转培养皿，使鱼集中于中央。使用移液管（Fisher Scientific）吸取50尾鱼，轻敲管壁使鱼沉降至管尖。尽可能少地携带液体，将鱼轻柔地转移至幼鱼琼脂糖注射皿上。
  10. 用光滑的玻璃棒将鱼排列整齐（注意不要压碎鱼体！）。尽可能吸除皿中多余液体，并用KimWipe纸巾吸走残留水分。
  11. 将带有鱼体的幼鱼琼脂糖皿置于显微镜下，调整位置以同时清晰观察鱼体和微针。将玻璃微针移向鱼体，在移动过程中同时放大观察鱼体和微针。小心地将玻璃微针插入第一尾鱼的耳泡27, 29（内耳）中。当微针进入鱼体时，踩下脚踏开关（Applied Scientific Instruments）后会观察到后脑室轻微隆起，即可确认到位。
  12. 踩下脚踏开关（Applied Scientific Instruments），观察液体在鱼体后脑室27内的扩散情况。将微针从鱼体内撤出，移至下一尾鱼。重复此操作，直至完成该皿中所有鱼的注射。及时移除死亡个体，并补充新鱼以保持总数准确（50尾）。每注射一组50尾鱼，必须更换新的微注射针，否则C. albicans会沉积在针尖底部，导致堵塞或注射浓度不均。
  13. 将培养皿倾斜，用卵水冲洗鱼体，将其冲入一个含有60 mL卵水的洁净超深培养皿中。注意不要让鱼在琼脂糖上停留超过15–20分钟，否则会因脱水而死亡。
  14. 重复整个注射过程直至完成。切勿遗漏PBS对照组和非致病菌注射对照组。
  15. 操作结束后，将鱼置于28 °C条件下继续培养。
  16. 关闭氮气瓶阀门。将注射装置开关从“脉冲”切换至“连续”模式，以释放管路压力，此时压力应降至零。再将开关切换回“脉冲”模式，关闭注射装置，并清理工作区域。

4. 准备用于成像的鱼类

实验持续时间： ** (30 分钟)

难度等级： **

  1. 按之前方法配制三卡因甲烷磺酸盐溶液（200 μg/mL）。取出感染的鱼，转移至三卡因溶液中。
  2. 配制 47.9 mL 的 0.4% 低熔点琼脂糖（VWR scientific）卵水溶液。用微波炉加热溶解，冷却至 37 °C 后，向其中加入三卡因甲烷磺酸盐（200 μg/mL）。
  3. 当鱼在三卡因甲烷磺酸盐溶液中完全 immobilized（失去活动能力）后，用移液器将单条鱼转移至含有 0.4% 低熔点琼脂糖（VWR Scientific）的培养皿（VWR scientific）中。
  4. 随后，将鱼从低熔点琼脂糖中转移至玻璃底培养皿（MatTek Corporation）的各个孔中，用于成像。应尽量减少低熔点琼脂糖的用量，使鱼平躺在培养皿底部。仅需使用足够填充玻璃底培养皿内圈的三卡因-琼脂糖混合物即可。

5. 与 JoVE 实验方案相关的修改

用于显微注射的微量移液器

实验时长： * (10-15 分钟)

难度等级： *

  1. 根据Yuan et al.30 的方法，使用Flaming Brown微电极拉制仪P-97型（Sutter Instruments）拉制空心玻璃毛细管BF120-69-10（Sutter Instruments）。选择程序#7，设置如下参数：加热温度 = 470，拉速 = 120，时间 = 200。所得针尖从斜面到尖端长度为8 mm，于尖端上方3 mm处折断后，其直径约为10 μm。
  2. 将玻璃微电极装入夹持架中，选择“拉制”选项。加热丝将根据程序参数加热针管，玻璃毛细管随后分离成两根拉制好的微电极。将制备好的微电极存放于微电极储存盒（Sutter Instruments）中。

胚胎收集、吗啉代注射与维持

实验时长： *** (1-2 小时)

难度等级： ***

  1. 根据Rosen的方法收集胚胎 等31使用塑料筛网（Wares of Knutsford）从产卵缸（Aquatic Habitats）中收集卵。将筛网倒置于一个超深培养皿上，用养殖水冲洗以收集卵。
  2. 用于制备吗啉代寡核苷酸，加入 300 μL 无菌水至300 纳摩尔的吗啉代寡核苷酸（GeneTools, LLC），得到1.0 mM的工作液。
  3. 使用 Nanodrop（Thermo Scientific）检测吗啉代寡核苷酸的浓度。选择“核酸”选项，将样品类型更改为“其他”，波长设为 265。通过将吗啉代寡核苷酸的分子量乘以 1000 再除以该吗啉代寡核苷酸产品说明书上列出的吸光系数，计算得到常数并输入。
  4. 用空白样品校准纳米分光光度计 2 μL 0.1 N HCl。稀释 5 μL 将吗啉寡聚体溶液注入 95 μL 0.1 N HCl（20倍稀释）。放置 2 μL 将稀释后的样品置于 Nanodrop 样品台，点击测量。将测得浓度乘以稀释倍数（20），得到 Morpholino 的工作浓度。为计算毫摩尔浓度，将所得浓度除以 Morpholino 的分子量。
  5. 在Danieau缓冲液（58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO₄, 0.6 mM Ca(NO₃)₂, 5 mM HEPES）中配制吗啉代工作液4，0.6 mM Ca(NO3)2，5.0 mM HEPES，pH 7.6）和0.01%酚红（VWR Scientific）。
  6. 根据Rosen的方案进行吗啉代注射实验 等31 和 Yuan 等30. 用卵水冲洗吗啉寡核苷酸注射用培养皿，并在温育条件下放置 28 °C 孵育15分钟。移除注射皿中的水，并用移液管将处于单细胞期的胚胎排列至注射皿的凹槽中（来自第1节的制备）。每块培养皿可容纳约250枚卵。对1-2细胞期胚胎注射吗啉代寡核苷酸。卵子将保持在单细胞期15分钟27.
  7. 注射完成后，用卵水冲洗卵（含60 mg/L Instant Ocean盐的无菌去离子水），并将其置于额外深度的培养皿中，加入60 mL卵水。注射用培养皿可重复使用，使用后用卵水冲洗，并倒置存放于 4 °C.
  8. 为保存胚胎，向培养皿中加入 60 mL 胚胎培养液。用移液管将 110 枚胚胎分别转移至额外加深的培养皿中，每皿含 60 mL 胚胎培养液。加入 0.00003% 亚甲蓝以抑制微生物生长，并将胚胎在 28 °C.
  9. 为加快胚胎发育，将胚胎培养皿置于 33 °C 孵育24小时，并根据Kimmel标准进行分期 等27，使胚胎发育至头躯角 75° (Prim 25 时期27).
  10. 进行幼虫感染实验时，将胚胎保存于 28 °C 注射后 C. albicans
  11. 每天用 60 mL 新鲜的蛋水更换胚胎培养皿中的液体。

成像

实验持续时间： *****(1-5 小时)

难度等级： ***

  1. 按照第4.2节所述方法，将鱼置于含有三卡因的低熔点琼脂糖中，并放入玻璃底成像培养皿（MatTek Corporation）中。将培养皿置于Olympus IX-81（Olympus）倒置显微镜载物台上。在微分干涉差（DIC）光下以4倍物镜聚焦鱼体。可在DIC、TRITC（四甲基罗丹明异硫氰酸酯）和FITC（异硫氰酸荧光素）滤光片设置下，以4倍、20倍和40倍物镜进行图像采集。
  2. 使用配备FV-1000激光扫描共聚焦系统的Olympus IX-81倒置显微镜，操作方法参照Ariga et al.32。设置Z轴层扫，感染期间每小时采集一次，切片厚度为1–1.5 μm，物镜倍数为40倍。
  3. 对于持续2小时或更长时间的延时成像，每2–3小时在成像培养皿中的鱼体上方添加一层低熔点琼脂糖，以防止琼脂糖干燥并压伤鱼体。在长时间成像过程中，若样本鱼数量较少，可使用加热载物台（Bioptechs Inc.）维持感染期间温度为28 °C。

6. 代表性结果

在感染后5小时（hpi）和24小时（hpi）的斑马鱼幼鱼中，成功建立的后脑室C. albicans感染示例见（图1）。在5 hpi时，可在后脑室观察到吞噬了C. albicans的类似巨噬细胞的细胞。到24 hpi时，C. albicans已进入尾部背侧组织中的类似巨噬细胞的细胞内，提示发生播散性念珠菌病。该感染结果高度依赖于将10–15个酵母形态的C. albicans准确注射至后脑室。在注射后立即对感染鱼进行筛选可确保注射准确性。

显示细胞结构的斑马鱼胚胎荧光显微镜图像，绿色和红色标记物标记。
图 1. 转基因 fli1:EGFP22, 33 幼鱼感染 CAF2-yCherry Candida albicans 后通过共聚焦显微镜进行活体成像。（A-C）感染后 5 小时（A）在感染部位（后脑室）可见表达 EGFP 的类似巨噬细胞的细胞。比例尺 = 100 μm。（B 和 C）同一条鱼的高倍放大图像，显示吞噬细胞内的 C. albicans。B 的比例尺 = 100 μm，C 的比例尺 = 10 μm。（D-F）感染后 24 小时（D）感染幼鱼出现播散性念珠菌病，背尾组织中 EGFP 标记的类似巨噬细胞内可见 CAF2-yCherry C. albicans。比例尺 = 100 μm。（E 和 F）同一条鱼的高倍放大图像，显示尾部组织中的 C. albicans。比例尺 = 100 μm。

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讨论

本文所展示的斑马鱼显微注射方法与 Gutzman 等人et al.34 的方法不同，我们在此演示了通过耳囊向 36 至 48 小时受精后（hpf）幼鱼的后脑室进行注射。我们描述的方法能够稳定地将 10–15 个酵母细胞注入后脑室，同时减少组织损伤。该方案可建立初始的局部感染，感染在 24 小时后（hpi）扩散至全身（图 1），并导致显著的死亡率/发病率5。后脑室直到 48 hpf 才完全封闭27, 29。在此发育早期阶段，巨噬细胞和中性粒细胞会迁移至感染部位，吞噬C. albicans，并可能迁移至身体其他部位5。

该系统真正的优势在于能够将斑马鱼转基因技术与表达荧光蛋白的微生物相结合。我们已构建了野生型和突变型菌株 C. albicans 组成型表达 mCherry、dTomato 和 eqFP650。将这些表达载体与氧化应激响应型启动子结合，可在活体斑马鱼幼鱼中实现氧化应激的比率定量检测5

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致谢

作者谨此感谢 Carol Kim 博士实验室提供的显微注射技术培训，Clarissa Henry 在加快胚胎发育方面的建议及仪器设备的使用支持，以及 Nathan Lawson 提供的 fli1:EGFP 转基因斑马鱼。我们感谢 Wheeler 实验室成员及 Shawn Walls 对 manuscript 的审阅意见。同时感谢 Mark Nilan 在斑马鱼饲养和实验建议方面的帮助，以及 Ryan Phennicie 和 Kristin Gabor 在本项目中的技术指导。本研究由 K. Brothers 获得的 MAFES 研究助理资助、MAFES Hatch 项目资助 E08913-08 及 R. Wheeler 获得的 NIH NCRR 资助 P20RR016463 支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
产卵缸水生环境2L
1.7 mL 离心管AxygenMCT-175-C
Instant Ocean费舍尔科技S17957C
超深培养皿费舍尔科技08-757-11Z
标准培养皿VWR 科学25384-302
移液管费舍尔科技13-711-7M
酵母提取物VWR 科学90000-726
蛋白胨VWR 科学90000-264
葡萄糖费舍尔科技D16-1
琼脂VWR 科学90000-760
一次性血细胞计数板VWR 科学82030-468
磷酸盐缓冲液VWR 科学12001-986
Dumont Dumoxel 镊子VWR 科学100501-806
木棒VWR 科学10805-018
KimWipes 擦拭纸VWR 科学300053-964
低熔点琼脂糖VWR 科学12001-722
注射用培养皿琼脂糖VWR 科学12002-102
Flaming Brown 微量移液器拉制仪Sutter InstrumentsP-97
中空玻璃棒Sutter InstrumentsBF120-69-10使用本生灯加热使玻璃棒表面光滑
移液器储存盒Sutter InstrumentsBX10
MPPI-3 注射系统应用科学仪器公司MPPI-3
背压单元应用科学仪器公司BPU
微量移液器夹持器套件应用科学仪器公司MPIP
脚踏开关应用科学仪器公司FSW
显微操作器应用科学仪器公司MM33
磁性底座应用科学仪器公司Magnetic Base
三卡因甲磺酸盐Western Chemical 公司MS-222
解剖显微镜奥林巴斯SZ61 顶部配 SZX-ILLB2-100 底座
共聚焦显微镜奥林巴斯IX-81 配 FV-1000 激光扫描共聚焦系统
TC-7 组织培养滚筒式摇床（带 14 英寸试管轮）New Brunswick 科学TC-7
成像培养皿MatTek 公司P24G-1.0-10-F
用于装载注射针头的移液器吸头艾本德930001007
平板倾注网格Adaptive Science ToolsTU-1
加热载物台Bioptechs 公司Delta T-5
平头刮刀VWR 科学82027-486
塑料筛网Wares of Knutsford 在线12 cm
Parafilm 封口膜VWR 科学52858-000
Vortex Genie 涡旋振荡器VWR 科学14216-184
16 x 150 mm 培养管VWR 科学60825-435
Nanodrop 超微量分光光度计赛默飞世尔科技ND 2000
酚红VWR 科学97062-478
HClVWR 科学87003-216
NaClVWR 科学BDH4534-500GP
KClVWR 科学BDH4532-500GP
MgSO4VWR 科学BDH0246-500GP
Ca(NO3)2VWR 科学BDH0226-500GP
HEPESVWR 科学BDH4520-500GP
Morpholino 寡核苷酸GeneTools 公司

参考文献

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