我们描述了一种在小鼠前脑中进行神经元迁移实时视频成像的实验方案。通过在急性活体脑片中利用宽场荧光成像技术，并以相对较短的时间间隔快速采集图像，记录经病毒标记或移植的神经前体细胞的迁移过程，以研究细胞迁移的不同阶段，包括静止期和迁移期的持续时间以及迁移速度。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
大量证据表明，成年哺乳动物大脑的特定区域存在内源性神经干细胞池，能够持续生成新的功能性神经元。源自脑室下区（SVZ）的新生神经母细胞沿吻侧迁移流（RMS）迁移到嗅球（OB）的最终位置1。在RMS中，神经母细胞以链状结构进行切向迁移，这些链状结构被星形胶质细胞突起包绕2,3，并以血管作为结构支撑以及迁移所需分子因子的来源4,5。到达OB后，神经母细胞脱离链状结构，转为径向迁移，进入嗅球的不同层次，在那里分化为中间神经元并整合到已有的神经网络中1,6。
本文中，我们描述了在啮齿类动物脑组织急性切片中监测细胞迁移的实验方法。利用急性切片可评估细胞在高度接近体内真实微环境条件下的迁移行为。 体内 条件以及难以触及的脑区中 体内 成像。此外，该方法避免了类器官和细胞培养所需的长期培养条件，而这些条件最终可能改变细胞的迁移特性。在急性脑片中，可使用微分干涉差（DIC）光学或荧光蛋白对神经前体细胞进行可视化。通过病毒标记侧脑室下区（SVZ）中的神经前体细胞、将报告基因小鼠的成神经细胞移植到野生型小鼠的SVZ中，或使用在成神经细胞中表达荧光蛋白的转基因小鼠，均为可视化成神经细胞并追踪其迁移的有效方法。然而，后一种方法由于标记细胞密度较高，难以对单个细胞进行长时间追踪。我们采用配备CCD相机的宽场荧光直立显微镜，以实现相对较快的图像采集间隔（每15或30秒采集一幅图像），从而可靠地识别静止期和迁移期。准确判定静止期与迁移期的持续时间，对于结果的明确解读至关重要。我们还进行了多步z轴采集，以在三维空间中监测成神经细胞的迁移。宽场荧光成像已被广泛用于可视化神经元迁移过程7-10在此，我们详细描述了标记神经母细胞、对成年小鼠前脑急性脑片中的神经母细胞迁移进行实时视频成像以及分析细胞迁移的方法。尽管本方案以成年小鼠喙侧迁移流（RMS）中神经母细胞的迁移为例进行说明，但该方法同样适用于胚胎期及出生后早期脑组织中细胞迁移的观察。
方案
1. 标记神经前体细胞
可以利用转基因小鼠来观察神经母细胞，这些小鼠可在神经母细胞中特异性表达荧光蛋白（即，Dcx-GFP，Gad67-GFP），通过立体定位将编码荧光蛋白的病毒颗粒注射至侧脑室下区（SVZ）或喙侧迁移流（RMS），或移植报告基因小鼠的神经前体细胞即，Dcx-GFP，Gad67-GFP）注射至野生型小鼠的脑室下区（SVZ）。本文描述了神经前体细胞移植及病毒标记的操作步骤。
从报告基因小鼠的脑室下区（SVZ）分离神经母细胞
- 神经母细胞解离需要以下溶液。
40倍浓缩液
10 ml 青霉素/链霉素（青霉素储存液 10,000 u/ml/链霉素 1,000 ug/ml）
10 ml 葡萄糖（储备液 200 mg/ml）
20 ml 丙酮酸钠（储存液 100 mM）
10 ml H2O
制备 1 ml 分装液
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
神经前体细胞正确迁移到相应脑区是神经环路正常组装和功能实现的基本过程。绝大多数细胞仅在胚胎发育期间发生迁移，而在出生后的脑组织中，只有少数区域（如嗅球、齿状回和小脑）仍存在神经元的迁移活动。然而，调控出生后脑内细胞迁移的机制目前仍不清楚。深入了解成熟神经系统中引导细胞迁移的相关机制和分子通路，将有助于我们更好地理解出生后脑内神经元的靶向定位，并可能为开发诱导神经元募集至脑部病变区域的新策略提供临床意义。
在本文中，我们描述了一种用于监测成年小鼠前脑急性脑片中细胞迁移的实验方案。尽管我们以成年小鼠的SVZ-OB通路作为模型系统，但该技术同样可用于追踪胚胎期及出生后早期脑组织中的细胞迁移，以及成年脑损伤后的细胞迁移过程。我们已利用该方案成功追踪了出生后早期喙侧迁移流（RMS）12、小脑以及成年卒中后纹状体中的细胞迁移（Eiriz, Grade, Malva 和 Saghatelyan，未发表数据）。
使用急性活体脑片进行神经母细胞迁移成像，该方法可在高度模拟体内微环境的条件下研究细胞迁移 体内
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）向 A.S. 提供的资助。J.K. 获得了拉瓦尔大学博士后奖学金的部分支持。A.S. 获得了加拿大产后神经发生领域研究讲席职位。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蔗糖 | Sigma | S9378 | |
| 葡萄糖（ACSF） | EMD | DX0145-3 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO₃3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| 德克萨斯红葡聚糖 | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| 葡萄糖（40倍溶液） | Sigma | G8769 | |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 15140-122 | |
| 氯胺酮/赛拉嗪 | CDMV | 5230 | |
| 巴斯德吸管 | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml 锥形管 | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml 离心管 | Sarstedt | 62.547.205 | |
| 玻璃毛细管（立体定位注射） | WPI | 4878 | |
| 石蜡油 | EMD | PX0045-3 | |
| 聚维酮碘 | Rougier | 65655-1370 | |
| 缝合 | 斯托尔廷 | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc 注射器 | VWR | SS-20L2 | |
| 培养皿 | VWR | 25384-094 | |
| 琼脂 | 马特实验室 | AP-0108 | |
| 胶水 | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO₂2 | Linde | 24068835 | |
| 刀片 | WPI | 501901 | |
| 尼龙网 | Warner Instruments | 64-0198 | |
| 离心 | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| 拉针仪 | Sutter Instrument | P-97 | |
| 纳升级注射器 | WPI | B203MC4 | |
| 立体定位注射装置 | WPI | 502900 | |
| 微型钻孔系统 | WPI | 501819 | |
| 振动切片机 | 赛默飞世尔科技 | 920110 | |
| 宽场荧光显微镜 | Olympus | BX61WIF | |
| CCD相机 | 光度测量 | CS-HQ2-D | |
| 超静音成像室 | 哈佛仪器公司 | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 加热平台 | 哈佛仪器公司 | 64-0284 | |
| 加热系统 | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40倍水浸物镜 | 奥林巴斯 | 1-UM587 | |
| 10倍水浸物镜 | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph 软件 | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris 软件 | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
参考文献
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
