急性片的成年小鼠前脑的神经细胞迁移的延时成像

1。标记神经元前体细胞

神经母细胞可以可视化使用转基因小鼠，选择性地表达荧光蛋白在神经母细胞（ 即 ，DCX-GFP，GAD67-GFP），立体定向注射的SVZ或RMS编码荧光蛋白的病毒颗粒，或通过嫁接记者小鼠的神经前体（ 即 DCX-GFP，GAD67-GFP）的野生型小鼠的SVZ。我们描述的程序的嫁接和病毒标记的神经元前体。

记者小鼠的SVZ的神经母细胞的离解

1. 以下解决方案所需要的神经细胞分离。

40X的解决方案

10毫升笔/链霉（股票笔10,000单位/毫升/链霉1000微克/毫升）

10 ml葡萄糖（股份200毫克/毫升）

20毫升丙酮酸钠（股票100毫米）

准备1ml等分

夹层溶液（100毫升）

HBSS 1X - 97.4毫升

HEPES（1 M） - 0.1毫升

40X的解决方案 - 2.5毫升

DNA酶溶液（20K单位/ ml）

从牛胰腺DNA酶I，typeIV

15万单位溶于7.5毫升H _{2 O}

过滤0.22微米

准备1ml等分

胰蛋白酶-DNA酶I溶液（10毫升）

HBSS - 8.6毫升

DNA酶I（20K单位/ ml） - 0.15毫升

胰蛋白酶-EDTA（0.5％） - 1毫升

40X的解决方案 - 0.25毫升

一起研磨液（50毫升）

BSA（300毫克/毫升） - 332.5微升

40X的解决方案 - 1.25毫升

DNA酶I（20K单位/ ml） - 0.66毫升

2. 麻醉2到3个月大的表达荧光蛋白在神经母细胞的成年小鼠腹腔注射氯胺酮/甲苯​​噻嗪（10毫克/ 1毫克，每10克的机身重量）100微升，然后斩首。我们使用GAD67-GFP小鼠^11。使用手术刀，切片大脑冠状侧脑室水平，并解剖出的SVZ在冰冷夹层介质。微量离心管中放置的SVZ用500μl的胰蛋白酶-DNA酶溶液，并保持在冰上20分钟。
3. 的SVZ转移到15毫升锥形管中含有5毫升预热的（37℃）胰蛋白酶-DNA酶溶液和孵育在37℃下30分钟，在5％的CO _2。
4. 入50毫升的锥形管中含有15毫升的trit中传送整个内容掩膜溶液和离心机在1000×g离心1分钟。吸弃上清，加入10ml的研磨溶液，细胞转移到一个新的15毫升锥形管，和离心机在1000×g离心1分钟。
5. 消防抛光与研磨介质巴斯德吸管，以减少针尖大小和外套。离心尽可能除去尽可能多的上清液，并加入2毫升新鲜磨碎的锥形管中的溶液。捣碎的磨碎溶液（大约50倍的向上和向下用巴斯德移液管）中的单元格。以上清液的上半部分，以及包含游离细胞，并转移到一个新的15毫升锥形管含有10毫升溶液研磨。
6. 消防抛光巴斯德吸液管，以进一步减少针尖大小。添加另一1毫升研磨溶液的管中剩余的未解离的细胞，继续研磨（向上和向下大约10倍），并且其全部内容转移到15毫升锥形管containin克以前游离细胞。离心机在1000×g离心7分钟。丢弃上清液，重新悬浮沉淀的细胞在50毫升neurobasal培养基，加载到计数室，并计数细胞。

移植所需的细胞数的SVZ使用过程如下所述。

立体定向注射病毒和游离细胞移植

7. 消毒珠灭菌器在手术开始之前，所有的仪器。
8. 立体定向注射，使用非常薄的提示（1-2微米），以减少脑损伤的玻璃微。为了使移液管拉玻璃毛细管用吸管拉马的。回填用石蜡油的吸管，直到半满的，和未处理的吸管插入的纳升注射器的柱塞（世界精密仪器）。
9. 使用纳升进样器控制器，迫使油与柱塞向下，直到一个小DROp的石蜡油挤出瘦尖。降低到无菌容器中吸移管，用0.5-1微升的溶液含有病毒颗粒（1×10 ⁶ 1×10 ⁸ TU /毫升）或离解SVZ细胞。使用纳升喷射器退出的功能，以填补的吸移管与所需的解决方案。确保没有气泡内的吸管。
10. 麻醉两到3个月大的成年C57BL / 6小鼠腹腔注射氯胺酮/甲苯​​噻嗪。使用电动剃须刀刮胡子的手术部位在头部。用湿纱布清洁，以去除任何粘附的头发。
11. 把鼠标放在一个立体框架，固定在头部。洗净头发自由注射部位消毒肥皂（洗必泰），然后用70％酒精（纱布或喷雾）。网站Proviodine（纱布或喷雾）消毒和外科手术领域涵盖了动物。
12. 在无菌小鼠的皮肤，小心地暴露皮肤作一小切口底层的头骨。擦干表面的头骨。使用囟和中线作为零坐标，分别设置左前 - 后侧（AP）和 - 外侧德尔梅迪奥（ML）的立体定向。
13. 在每个半球的头骨上钻一个小孔，在适当的坐标。避免损坏下面的脑组织。钻仔细，直到只剩下骨头已被违反。清洁孔和设置零背腹（DV）的立体定位的大脑的表面上的坐标的坐标。我们使用以下坐标（单位:mm）的SVZ的成人或RMS（22-24克）C57BL / 6小鼠注射SVZ:0.70，1.20 ML AP和DV 1.90，RMS:AP 2.55，0.82 ML和DV 3.15。
14. 慢慢插入玻璃微尖进入大脑使用适当的DV坐标作为指南，慢慢注入少量（我们注入100-500 NL在5升/秒）的细胞悬浮液（脱离SVZ的记者小鼠）或含有病毒颗粒的溶液。我们通常使用慢病毒或逆转录病毒颗粒的1×10 ⁶ 1×10 ^8:TU /毫升。
15. 玻璃微吸管慢慢收回，在颅骨缝合皮肤，恢复快，将鼠标放在一个加热垫。当鼠标唤醒手术后，管理镇痛药（ketaprofen 10毫克/公斤，SC，每天1次注射后3天操作）。

2。准备急性片

1. 下面的解决方案需要以制备急性切片:a）一种人工脑脊髓液（ACSF）蔗糖为基础的解决方案，以下简称为切割的解决方案，其中的NaCl取代蔗糖，遏抑神经元的兴奋性增加切片的制备过程期间，和b）学联含有NaCl，温热至32℃下，在水浴中，片被转移到其中的，并保持，直到成像。
2. 该解决方案包含以下（毫米）:切削液:210.3蔗糖，3 KCI，1.3 MGCI ₂ x6H _{2 O} 2 CACI ₂ 分> X2H ₂ O 26 _碳酸氢钠 ，1.25的NaH ₂ PO _4，20葡萄糖;学联:125氯化钠_{，2，2，1.3} MGCI ₂ x6H _{2 O} 3 KCI CACI X2H _{2 O，26碳酸氢钠} ，1.25的NaH ₂ PO _4， 20葡萄糖。维护的解决方案，在7.3-7.4的pH值，并不断由鼓泡用95％O _{2/5％CO 2的}含氧化合物。
3. 腹腔内注射氯胺酮/甲苯​​噻嗪麻醉小鼠。果冻状的外观采用液氮准备冰冷的裁剪解决方案。灌注到鼠标intracardiacaly与此解决方案，使用20毫升注射器。
4. 此过程应迅速，通常为1-2分钟20毫升的解决方案。如果血管灌流裁剪解决方案，而不是需要加贴标签，，注入transcardiacally 200微升的葡聚糖德克萨斯红（10毫克/毫升），进入左心室的心脏，然后等待2-3分钟前斩首鼠标。
5. 斩首米乌斯和迅速的头部浸入冰冷的切割溶液。用剪刀去除头皮，头骨从后到前轴沿切中旬矢状缝小脑OB。轻轻地取出颅盖使用产钳。
6. 海关的尾侧部的大脑用手术刀。切大脑沿intrahemispheric裂，并且使每个半球（ 图1A）上的最外侧的部分的2个矢状削减。用刮刀轻轻地取出大脑，并将其放置在冰冷的裁剪解决方案。
7. 分别将两个半球背侧接触琼脂，4％的琼脂块胶块两个半球的的vibratome平台的。胶横向切侧半球的平台，使内侧朝上（ 图1B）。将在的vibratome室的平台，并填写切削液。保持整个SLI氧化的解决方案策由鼓泡用95％O _{2/5％CO 2的}制备。
8. 准备使用vibratome的250微米厚的切片。我们使用MICROM，HM 650 V vibratome（Thermo Scientific的），切割片的频率为100 Hz和1毫米/秒的速度。应该使用低切削速度和高频率叶片振动，获得高品质的部分。只要一个片被释放的刀片，轻轻地取下它的裁剪解决方案，并将其放置在孵化室充满了充氧ACSF保持在32°C的水浴中（ 图1C）。

这个过程应尽可能快地进行，以确保最优质的片。

3。延时成像的神经细胞迁移

在的迁移神经母细胞成像内进行编制片和3-10天6-8小时后，神经母细胞标记。为了避免在迁移参数的变化由于立体定向注射可能引起脑损伤和神经胶质激活使用细尖的玻璃微电极（1-2微米），以尽量减少脑损伤，并进行成像的地区，远离注射部位（ 即图像中的RMS以下的SVZ或RMS中的嗅球注射后注射到RMS）。虽然成像可以进行长达21天的SVZ慢病毒颗粒注射后，我们建议使用较短的后喷射的时间间隔（3-10天），因为它允许可视化和跟踪每个视场的多个单元格。

我们使用宽场荧光机动BX61WI显微镜（Olympus）配用CCD照相机（CoolSnapHQ2，配光），用0.8的数值孔径（奥林巴斯）和40X水浸物镜。具有较高的NA的目标将提供更好的分辨率的图像。标记兴奋神经母细胞（接枝记者从供体小鼠或病毒标记）一个Lambda DG-4配备了一个175 W氙灯为30-100毫秒每Ž收购（萨特工具）。多波长成像使用，也可以进行适当的过滤器集（色度）来追踪神经元的迁移以及其他细胞成分的有效值，如荧光标记的星形胶质细胞或血管。 MetaMorph软件（Molecular Device公司），允许在不同的参数设置的时间推移采集程序（见下文）所控制的显微镜，CCD摄像机和DG-4。片被转移到一个PH1 20系列超静音成像室（哈佛大学设备）内置在显微镜。被连接到该腔室的自动加热系统（TC-344B，哈佛器具）和连续灌注含氧学联（ 图1D）。腔室中的温度保持在31-33℃下，和学联的流速为每分钟1-2毫升。

1. 小心地将切片的显微镜成像室。对避免漂移的切片在成像过程中，稳定通过仔细放置切片上的尼龙筛（华纳器械）。该网格为0.12毫米厚，开口部的范围从0.3至1.13毫米。网格的位置，以便它不妨碍摄像视场（ 图1D）。使用10倍的目标是要找到一个感兴趣的领域，再搞40倍的目标和调整的重点。
2. 确保连续灌流学联和有足够的解决方案的目标和切片，切片。 ACSF灌流，不规则的灌注，或温度急剧变化导致在焦平面上成像过程中的漂移和变化率的变化。
3. 设置时间推移采集参数（ 即励磁时间，z平面的数量，每个z节之间的距离，时间间隔，和持续时间的记录）使用MetaMorph软件，该控制采集系统和启动时间失效的收购。大ta的自动保存用MetaMorph与每个文件对应的一个时间点所获取的时间推移视频作为一个TIFF文件。
4. 进行成像至少1-2小时，并考虑被中断的迁徙阶段，由两个固定相。成像可以进行4小时（我们没有进行成像会议，历时4个多小时）的神经母细胞的迁移性没有任何改变。不要图像细胞的表面处的切片。我们通常在20至100微米的深度图像。我们建议使用短的采集时间间隔（15 - 30秒），以可靠地确定的固定和迁移阶段的开始和结束。
5. 为了评估在迁移中的神经前体的特定的分子因素参与学联含有任何所需的药理活性剂中（ 即 ，不同的激动剂，拮抗剂，β受体阻滞剂，生长因子等），可以被取代的，正常学联。至少进行成像在控制条件下，1小时，然后药理活性剂的存在下，在1小时。

4。分析神经细胞迁移

我们使用Imaris软件（位面）的数据进行分析。这使我们能够在3D自动跟踪新生细胞迁移。 Imaris的7.0F1包的MeasurementsPro，Imaris跟踪，ImarisColoc，ImarisXT，纤维示踪，和InPress模块​​。

1. 要打开电影在Imaris，将通过简单的拖放的第一个时间点上的程序图标上的视频图像采集的图像（TIFF文件）。
2. 一旦电影被加载时，显示调节窗口中的信号的亮度和对比度的调整，并设置在图像属性的参数的获得的视频（体素大小和时间间隔）和设置等距离的时间点的窗口（图4A） 。在指定的体素的大小，它是可以看到的帧，以及在3D中的时间和规模的视频。
3. 要自动跟踪记录单元，每个单元格创建一个点，在该领域中的超越"窗口中，选择的景点功能。按照下面的步骤，和设置的参数的基础上的成像的对象（ 图4B）。的参数之一是在切片窗口可以被测量的小区的直径。
4. 检查所检测到的对象的可靠性随着时间的推移。如果未自动检测到所有的细胞迁移，改变阈值检测（ 图4B），并确保已选定的所有单元格，在所有时间点与点。
5. 在自动跟踪过程中，如果从相邻的时间点有两个对象之间的任何重叠的边界/边缘，将轨道​​连接每个重叠。的最大距离和最大间隙尺寸（ 图4C）的两个点之间，表示相邻的时间点的相同的轨道必须被指定，从而使该程序可以连接的时间POINTS。的最大的距离，确定由在其后的时间点之间的距离相同的对象。
6. 一旦轨道，它是可能的过滤轨迹和通过简单地删除（ 图4C），除去不相干的轨道。音轨可以校正由不同的轨道和不同的时间点的相同的轨道上（ 图4C）的连接和断开连接。
7. 一旦作出更正，最后看了在轨道和导出数据（细胞每个时间点的位移，轨道长度，位移长度，跟踪时间等）到一个Excel文件（ 图4D）。

5。代表性的成果

我们的测试和优化的神经细胞迁移的宽视场时间推移成像。病毒标记或荧光标记的神经母细胞鲁棒迁移细胞的GFP表达（ 图2）允许的SVZ接枝。多波长成像可以ë施加到沿其他细胞成分，如葡聚糖TexasRed填充血管^4（ 图3和电影1），星形胶质细胞与神经胶质细胞特异性启动子（ 图^2B）12通过立体定位注射病毒荧光标记的RMS可视化成神经细胞迁移，特别标记的星形胶质细胞在转基因动物。

急性切片神经细胞迁移的宽视场视频成像揭示了跳跃式的行为，迁移神经元前体组成的两个不同的阶段:神经元的细胞体位移对领先的固定相分离的过程（ 图3，电影1和2） 。为了可靠地识别的静止和迁徙阶段的持续时间和获得其他的细胞迁移的参数，如位移率（计算仅在迁移过程中的阶段），在3D成像进行使用短的采集间隔（每15或30秒）。固定和迁移阶段的持续时间的精确识别是非常重要的数据明确的解释。例如，在一个给定的时间周期期间的迁移的距离的差异，可以被诱导中的迁移率的变化，或通过修改在迁移相和固定相的持续时间或周期性。不能区分这些不同的可能性使用长采集间隔。

imaris软件被用来分析在3D中的成神经细胞的迁移和细胞迁移，如轨道持续时间和轨道长度，以及轨道位移长度，这是一个矢量的位移，以获得额外的参数。的轨道直线度还可以计算由轨道位移长度除以磁迹长度，并表示个别成神经细胞的迁移路径的平直度。

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图1。急性现场片的准备。示意图 A）示意图的尾鳍，intrahemispheric，和两个矢状削减。 B）示意图的小鼠大脑的琼脂块和的vibratome平台。 C）示意图急性切片孵化室。 D）的示意图的摄像室建在直立显微镜。

图2。标记的神经母细胞中的RMS A）放大图像的神经母细胞和血管在成人RMS显示出强大的标签。逆转录病毒编码绿色荧光蛋白注入SVZ，在RMS检测后3天（左图）和GFP表达细胞（绿色）。由注射右旋糖酐TexasRed的鼠标（红色，右侧面板）到心脏，血管被打成。插图显示了高荡气回肠ATION血管和病毒标记神经母细胞与血管的图像。 B）不同的细胞成分，在成人RMS标签。 mCherry编码慢病毒注射在SVZ（红色）被标记的神经母细胞，星形胶质细胞在RMS（绿色）中的一个GFAP启动子的控制下，通过注入一种慢病毒编码GFP标记，注入:葡聚糖CascadeBlue（蓝色标记和血管）的心脏。 C）GAD67-GFP细胞分离的成年野生型小鼠的SVZ的SVZ的一个GAD67-GFP鼠标的注射示意图。 D）移植GAD67-GFP细胞（绿色）中检测到后的RMS 7天，嫁接在SVZ。 RMS的免疫组化染色和GFAP（蓝色）。 E）移植GAD67-GFP细胞（绿色）分别为阳性的DCX（红色），GFAP（蓝色），但无免疫反应。 点击此处查看大图。

图3。时间的推移，神经母细胞成像。时间的推移迁移沿血管成像的神经细胞（绿色）（红色）。图中箭头表示的成神经细胞的迁移阶段，和箭头表示的固定相。

图4。分析神经细胞迁移。（AD）的神经母细胞迁移分析的不同的步骤。文中提到的红色圆圈表示不同的功能。 点击此处查看大图 。

视频1。时间推移成像病毒标记神经母细胞（绿色）迁移沿着葡聚糖TexasRed标记的血管（红色）。 Ç舔在这里观看视频。

视频2。Imaris软件跟踪神经细胞迁移。绿色圆点表示的胞体和轨道表示距离的迁移。 点击此处查看视频 。

没有利益冲突的声明。