本视频演示了使用苏木精和伊红（H&E）以及免疫组织化学（IHC）对人胰岛进行表征的实验步骤。对胰腺头、体和尾部位的组织切片分别进行H&E和IHC染色，以确定胰岛的内分泌细胞组成（胰岛素、胰高血糖素和胰多肽）、细胞增殖情况（Ki67）以及炎性浸润（H&E、CD3）。通过胰多肽的免疫组织化学染色来定位钩突区域。
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摘要
摘要
成人胰腺中胰岛面积、数量以及内分泌细胞组成的估计值差异较大，胰岛数量从数十万到数百万不等，β细胞质量范围为500至1500 mg1-3。鉴于这种已知的异质性，我们建立了一种标准化的处理和染色流程，以明确定义胰腺区域，并通过严格的组织病理学和免疫定位检测对胰岛进行表征。
本系列第1部分描述了对器官捐献者获取的人胰腺进行处理的标准操作流程。胰腺被分为3个主要区域（头、体、尾），随后进行横向切片。根据大小，胰腺头部的横切片进一步被分割，并按字母顺序编号以表示不同的亚区。该标准化流程可实现对胰腺头部区域（包括主要由胰多肽细胞组成的胰岛的钩突区域）至尾部区域的完整横断面分析。
本报告为该系列的第二部分，介绍了胰腺石蜡切片连续切片及组织病理学表征的操作步骤，重点在于胰岛内分泌细胞、细胞复制以及T细胞浸润的分析。胰腺组织切片的病理学评估旨在全面描述外分泌部、导管结构以及内分泌成分。对外分泌部的评估包括是否存在胰腺炎（活动性或慢性）、萎缩、纤维化和脂肪变性，同时评估导管系统，特别是与胰腺导管内肿瘤形成相关的病变4。胰岛的评估则通过苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学（IHC）染色，分析其形态、大小和密度、内分泌细胞情况、炎症浸润、纤维化、淀粉样物质沉积，以及是否存在增殖性或凋亡性细胞。
第2部分中描述的最后一个组分是将染色后的切片以数字化全切片图像的形式提供。这些数字化切片按照病例和胰腺区域进行组织，存储于一个在线病理学数据库中，形成一个虚拟生物样本库。目前，该在线资源库已向200多名参与1型糖尿病研究的临床医生和科研人员开放。该在线数据库为快速、全面地共享数据提供了途径，同时也使研究人员能够选择石蜡包埋或冷冻连续切片的组织块。
方案
1. 未染色切片的切片技术
- 按照常规石蜡切片法设置水浴锅和切片机。使用带正电荷的载玻片，并预先标记病例编号、胰腺区域（样本）和切片编号。将石蜡包埋块放入切片机卡盘中，使包埋盒标签位于左侧。
- 遵循常规切片程序，连续切片至组织均匀出现为止。制备一系列连续切片（厚度为 4 μm，数量为 3–6 张，具体取决于初始所需染色的种类（参见病例提交表，附录 1））。将切片带中的各张切片分开，按顺序逐一捞取并放置于载玻片上，用铅笔标注顺序编号。若某张切片未使用，仍需按确切顺序编号以作标识。切片在载玻片上的方向应与包埋盒中的方向一致，且载玻片标签朝左。室温下干燥过夜，随后进行染色或分发给研究人员。
- 用一层薄薄的石蜡重新封住石蜡块表面，以保存组织，并在室温或 -20 °C 条件下存档保存。
- 进行后续切片时，应按照上述方式保持各级连续切片的编号一致性。每块组织每约 100 μm 深度额外获取一张切片，并制备 H&E 染色切片。
2. H&E 染色
- 将每个组织块的第一张连续切片置于载玻片架中，然后放入自动染色机的第一个染色槽内。
- 选择标准的苏木精-伊红（H&E）染色程序，并按常规操作进行。
- 染色完成后，从自动染色机中取出载玻片，并置于通风橱中以进行封片。
- ....
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讨论
免疫组化（IHC）操作流程的标准化对于图像分析至关重要，尤其是在长时间内对大量切片使用基于计算机的分析算法时。本报告中描述的IHC染色程序经过改进自先前的研究5，可在8小时工作日内利用自动染色仪对同一供体的样本进行批量处理。所有染色切片的数字化全切片图像均通过基于网络的在线病理系统提供给nPOD合作研究人员。研究人员可结合切片查看供体的人口统计学信息、实验室数据及其他相关临床病史，并据此选择最适用于其研究的组织块（更多信息请参见http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php）。该在线病理系统起到了“虚拟生物样本库”的作用。未来将进一步优化该系统，通过在切片标签中引入条形码，追踪每个组织块的连续切片和不同切面，最终实现胰腺的三维重建。
选择这两种双重染色方法，主要是为了确定胰岛β细胞（胰岛素）的组成，并结合细胞增殖（Ki-67）情况进行分析，这对于理解1型糖尿病中成年β细胞.......
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致谢
作者感谢为本研究提供支持的捐赠者家属和器官获取组织，以及 Emily Montgomery、Robert Pietras、Ann Fu、Mitali Agarwal 和 Roshan Agarwal 提供的专业帮助。本研究由青少年糖尿病研究基金会（M.C-T.）资助，用于支持糖尿病胰腺器官捐赠者网络。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 30% 过氧化氢（H2O2） | 费舍尔科技公司 | H325-500 | 内源性过氧化物酶阻断 |
| ABC-碱性磷酸酶（AP） | Vector Laboratories | AK-5000 | AP 结合物 |
| 抗体稀释液 | Invitrogen | 003218 | 一抗 |
| 亲和素阻断剂 | Vector Laboratories | SP-2001 | 阻断内源性生物素 |
| 生物素化山羊抗豚鼠抗体 | Vector Laboratories | BA-7000 | 二抗 |
| 蓝化试剂 | 费舍尔科技公司 | 7301 | Leica 自动染色机 |
| 柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | 抗原修复 |
| Clarifier 1 | 费舍尔科技公司 | 7401 | Leica 自动染色机 |
| Cytoseal XYL | 费舍尔科技公司 | 8312-4 | 盖玻片封片剂 |
| DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | HRP 显色剂 |
| DEEB | Dako | S2003 | 内源性 AP 阻断试剂 |
| 醇溶伊红 Y | 费舍尔科技公司 | 71204 | Leica 自动染色机 |
| 乙醇 — 100%、95%、90%、70% | 费舍尔科技公司 | Various | 脱蜡和封片 |
| 苏木精 | Dako | S3301 | Dako 自动染色机 |
| 苏木精 7211 | 费舍尔科技公司 | 7211 | Leica 自动染色机 |
| IgG（所有一抗宿主物种） | Various | Various | 一抗阴性对照 |
| 液体永久红（LPR） | Dako | K0640 | AP 显色剂 |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | 山羊抗小鼠 AP 结合物 |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | 山羊抗小鼠 HRP 结合物 |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | 山羊抗小鼠 HRP 结合物 |
| 甲醇 | 费舍尔科技公司 | Various | H2O2 稀释液 |
| 正常山羊血清 | Vector Laboratories | S-1000 | IHC 阻断试剂 |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC 阻断试剂 |
| TBST 20X | 赛默飞世尔科技公司 | TA-999-TT | IHC 缓冲液 |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | 抗原修复 |
| 二甲苯 | 费舍尔科技公司 | Various | 脱蜡和封片 |
| 表 1. 特定试剂。 | |||
| [header] | |||
| 石蜡 | |||
| 淀粉酶 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-46657 | 小鼠 |
| 胰淀素 | Serotec | MCA11267 | 小鼠 |
| 碳酸酐酶 19.9 | Abcam | ab15146 | 小鼠 |
| 剪切型 Caspase-3 | Cell Signaling Technology | 9961 | 兔 |
| CD20 | Dako | M0755 | 小鼠 |
| CD3 | Dako | A0452 | 兔 |
| CD34 | Cell Signaling Technology | 3569 | 小鼠 |
| CD4 | Dako | M7310 | 小鼠 |
| CD45 | Dako | M0754 | 小鼠 |
| CD68 | Dako | M0876 | 小鼠 |
| CD8 | Dako | M7103 | 小鼠 |
| 嗜铬粒蛋白 A | Dako | A0430 | 兔 |
| CK17 | Dako | M7046 | 小鼠 |
| CK19 | Dako | M0772 | 小鼠 |
| CK7 | Dako | M7018 | 小鼠 |
| C 肽 | Cell Signaling Technology | 4593 | 兔 |
| Foxp3 | e Bioscience | 14-4776-80 | 大鼠 |
| Ghrelin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-10386 | 山羊 |
| Ghrelin | Abcam | ab85104 | 兔 |
| 胰高血糖素 | Dako | A0565 | 兔 |
| 胰高血糖素 | Abcam | ab10988 | 小鼠 |
| 胰高血糖素 | Bachem | T-5037 | 豚鼠 |
| Glut-1 | Abcam | ab40084 | 小鼠 |
| Glut-2 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9117 | 兔 |
| 胰岛素 | Dako | A0564 | 豚鼠 |
| Ki-67 | Dako | M7240 | 小鼠 |
| Mafa | Novus Biological | NB400-137A | 兔 |
| 胰多肽 | Invitrogen | 18-0043 | 兔 |
| Pdx-1 | Abcam | ab47308 | 豚鼠 |
| 前胰岛素 | Novocastra | NCL-proin-1G4 | 小鼠 |
| 前胰岛素 | 发育研究杂交瘤库 | GS-9A8 | 小鼠 |
| 分泌粒蛋白 | Sigma-Aldrich | HPA 006641 | 兔 |
| 平滑肌肌动蛋白 | Abcam | ab5694 | 兔 |
| 生长抑素 | Dako | A0566 | 兔 |
| 突触素 | Dako | M0776 | 小鼠 |
| 新鲜冷冻 | |||
| CD11b | Abcam | ab6332 | 大鼠 |
| CD11c | Serotec | AHP1226 | 兔 |
| CD25 | Novus Biological | NB 600-564 | 小鼠 |
| CD94 | Abcam | ab61874 | 小鼠 |
| GAD65 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-130569 | 小鼠 |
| HLA-ABC | Dako | M0736 | 小鼠 |
| 表 2. 一抗。 | |||
| [header] | |||
| Aperio Scanscope CS | Aperio Technologies | 数字切片扫描仪 | |
| DAKO Autostainer Plus | Dako | IHC 染色 | |
| Label Matrix 打印软件 | BioCarta | LM7UP57 | 切片标签软件 |
| Leica XL Autostainer | Leica Microsystems | H&E 染色 | |
| 优质盖玻片 | 费舍尔科技公司 | 12-548-5J | 盖玻片 |
| Spectrum Information Manager | Aperio Technologies | 扫描仪软件 | |
| Superfrost Plus 载玻片 | 费舍尔科技公司 | 12-550-15 | 带正电荷载玻片 |
| 蔬菜蒸锅 | Black and Decker | Various | 抗原修复 |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | 切片标签打印机 |
| 表 3. 特定耗材与设备。 |
参考文献
- In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008). ....
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