荧光原位杂交（FISH）可用于鉴定单个细胞中的mRNA转录本，从而分析多基因活性，例如在恶性疟原虫感染的红细胞中同时转录var多基因家族中的多个成员1。该技术具有可适应性，可应用于不同类型的基因、细胞和生物体。
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摘要
摘要
疟疾感染期间，Plasmodium falciparum 感染的红细胞（IE）与人类内皮受体的黏附由var基因编码的PfEMP1蛋白变体的表达所介导。
单倍体 P. falciparum 基因组包含约 60 个不同的 var 基因，过去认为在感染的血液阶段，每个细胞每次仅有一个 var 基因被转录。这种 var 基因转录的相互排斥性调控机制如何实现尚不清楚，与不同受体相关的单个 var 基因或 var 基因亚群的鉴定，以及差异性结合对 P. falciparum 感染临床结局的影响亦不明确。最近，通过对单个感染红细胞中 P. falciparum 转录本的鉴定，利用 RNA 荧光原位杂交（FISH）分析寄生虫在单个 P. falciparum 感染红细胞核内 var 基因的转录情况，该相互排斥的转录范式受到了质疑1。
在此，我们提供一种用于分析单个核中恶性疟原虫感染红细胞内 var 基因转录的 RNA-FISH 方法的详细实验方案 var 单个核内基因转录 P. falciparum 感染的人类红细胞。该方法基于使用地高辛和生物素标记的反义RNA探针，并结合TSA Plus荧光调色板系统2 （Perkin Elmer）、显微分析以及新鲜筛选的 P. falciparum IE。该 原位 杂交方法可用于监测恶性疟原虫生活周期不同阶段所表达的多种基因的转录与调控 P. falciparum 生活周期，并可适用于其他疟原虫物种以及其他生物体和细胞类型。
方案
1. 新鲜选择感染红细胞的制备
进行本实验时，使用经新鲜筛选、表达PfEMP1蛋白的培养物可获得最佳结果。在本实验中，3D7 P. falciparum 虫株系通过特异性抗体进行筛选，方法如前所述1。
第1天
- 收获 200 μl 个浓缩血细胞 P. falciparum 通过在室温下以800 × g离心8分钟，收集含有2-5%晚期阶段IE的培养物。
- 将血细胞沉淀重悬于 2 ml 37 °将 0.75% 明胶溶液在 14 ml 无菌管中预热至 37 ℃，静置 15–20 分钟 °C：让未感染的红细胞和环状体期感染红细胞自然沉降。
- 收获晚期阶段的感染红细胞（IE）， 即 上相转移至新的14 ml离心管中，用10 ml 37℃预温的洗涤液洗涤两次 °预热RBC洗涤液至37°C。
- 稀释50 μ2 ml 37℃的特定抗 PfEMP1 抗体溶液 °将RBC洗涤培养基预热至37°C并进行无菌过滤。
- 将洗涤后的晚期感染红细胞与灭菌稀释的抗血清在14 ml无菌管中混合，37℃孵育30分钟 °在轻柔振荡条件下于 C。
- 在室温下以 800 × g 离心 8 分钟，并用 10 ml 37 ℃预温的培养基洗涤两次 °预热RBC洗涤培养基至37°C。
- 洗涤 50 μ使用 DynaMaq-15 磁铁，用红细胞洗涤液将 Dynabead Protein A 悬液洗涤两次。
- 将Dynabeads重悬于300 μl RBC洗涤液，并加入经洗涤的晚期阶段感染红细胞中。在37℃孵育30分钟 °C，轻柔振荡。
- 将试管转移至 DynaMaq-15 磁架上，静置 1–2 分钟，吸除全部液体。
- 将Dynabeads重悬于4-5 ml红细胞洗涤培养基中。将离心管放回磁力架上，静置1-2分钟后吸除全部液体。重复洗涤一次。
- 将洗涤后的珠子转移至25 cm2 含200的无菌培养瓶 μl 新鲜浓缩的红细胞。向培养物中加入 5-6 ml Albumax 培养基。在 5% CO₂ 条件下过夜保存2 37℃ °C.
第2天
- 当被选择的感染红细胞重新侵入新鲜红细胞后，将全部培养物转移至一个14 ml无菌管中，以去除Dynabeads。将该管置于DynaMaq-15磁铁上，静置1–2分钟，然后将全部液体倒回培养瓶中。
- 培养尽可能少的周期，直至寄生率达到5-10%，且疟原虫处于环状体阶段。
- 应通过流式细胞术（FACS）分析感染红细胞（IE），以确保其表面表型正确， 即 已获得 PFD1235w 和/或 PF11_0008 的蛋白表达1.
2. 探针的制备
反义RNA探针由PFD1235w和PF11_0008的最可变区域生成 var 基因来自 P. falciparum 3D7 基因组 DNA。根据制造商说明（Roche），通过 PCR 扩增 DNA 并分别克隆至 pSPT18 或 pSPT19 载体用于转录。探针长度分别为 580 个碱基对（bp）和 590 个碱基对（bp），分别使用 DIG RNA 标记试剂盒或 Biotin RNA 标记混合物标记为地高辛（DIG）或生物素（Biotin）。我们通过 Northern 印迹分析和单标记 FISH 分析验证了探针的特异性。1.
3. 染色前疟原虫的薄血涂片制备与固定 原位 杂交
第1天
所有步骤均需在无RNase的环境中进行，所有试剂均须为无RNase的试剂，或经焦碳酸二乙酯（DEPC）或RNase Zap（Invitrogen）预处理。载玻片和盖玻片应使用酒精清洗，以去除残留的制造用润滑油脂。为最大限度降低核酸酶污染风险，实验过程中应连续操作，避免在步骤之间中断。
- 采用标准涂片法制备薄血膜3使用显微镜的100倍油镜物镜，计数感染红细胞（IE）并计算培养物中IE的百分比。检查寄生虫发育阶段是否大致同步，处于环状体和早期滋养体阶段。这些是复制前的单核阶段，表达 var 基因mRNA，适用于此类单细胞FISH转录分析。
- 转移 50 μ将5-10%寄生率的寄生虫培养物1 l转移至1.5 ml无RNase的Eppendorf管中，在室温下以2,000 rpm离心1分钟。
- 移除培养基，加入 50 μl PBS，pH 7.2，使用经DEPC处理的水配制。轻轻振荡试管。重复离心沉淀步骤两次，以彻底洗去培养基和细胞碎片。
- 制备四张质量良好的薄血涂片。每张涂片分别制备于一块4孔玻片的直径为11 mm的孔中。 即 总共四个载玻片，置于无RNase的超净台中（a 关键步骤将载玻片短暂置于空气中晾干。额外制备三张阴性对照载玻片：一张用于使用特异性探针针对任何其他无关基因进行单探针染色，一张用于RNase处理，第三张载玻片含有不表达目标基因的感染红细胞（IE）。将载玻片置于实验台上干燥10–20分钟。
- 通过加入60固定薄层 μ向孔中加入含4%多聚甲醛和5%冰醋酸的固定液l。室温下静置10分钟。
- 用2x SSPE缓冲液在室温下轻轻振荡洗涤载玻片5分钟。用纸巾轻轻接触含有细胞的孔，短暂吸去多余液体。
- 用含有 0.01 % 胃蛋白酶的 0.01 M HCl 溶液覆盖载玻片，37 ℃ 孵育 2 分钟 °C（一个 极为关键的步骤用2x SSPE缓冲液在室温下洗涤载玻片5分钟。
- 将RNase溶液稀释至终浓度为10 μg/ml。用60覆盖阴性对照涂片 μRNase 溶液的量。在 37 °C 下孵育 30 分钟 °C，然后在室温下用2x SSPE洗涤载玻片5分钟。
- 立即进入杂交步骤。
4. RNA探针与固定载玻片的杂交
第1天
- 使用 RNase Zap 喷洒并用纸巾擦拭清洁杂交室（例如 ThermoStar 100 HC4 或置于洁净烘箱中的空移液枪吸头盒），以准备杂交室。在杂交室的槽道或盒底加入经 DEPC 处理的水，确保载玻片在杂交过程中不会干燥。关闭杂交室，并预热至 48 °C。
- 将探针稀释于杂交溶液中，使其终浓度为 12 ng/μl。在加热块中于 65 °C 下使探针溶液变性 5 分钟，随后立即置于冰上冷却。
- 在 2x SSPE 洗涤后，将载玻片短暂空气干燥。用纸巾小心吸除孔周围多余的液体。
- 打开杂交室，将载玻片放入其中。每孔加入总体积为 60 μl 的一种或两种探针溶液。使用无菌镊子小心地用无 RNase 的盖玻片覆盖液滴。
- 关闭杂交室，在 48 °C 下杂交至少 16 小时（过夜）。
5. 抗体偶联与荧光信号放大
第2天
以下步骤基于 Perkin Elmer 的 TSA Plus 荧光调色板系统。所有步骤均在室温下进行。
- 用 TNT 缓冲液轻轻振荡洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
- 每孔加入 150 μl TNB 缓冲液封闭 30 分钟。
- 将 HRP 偶联的 α-DIG 抗体用 TNB 缓冲液按 1:100 比例稀释，HRP 偶联的 α-生物素抗体用 TNB 缓冲液按 1:500 比例稀释。用纸巾小心去除载玻片上多余的 TNB 缓冲液。若需同时检测两种转录本，可同时加入两种抗体。每孔加入总共 100 μl 抗体-TNB 溶液，小心加盖盖玻片，于室温孵育 2 小时。
- 小心移除盖玻片，将载玻片在 TNT 缓冲液中轻轻振荡洗涤 3 次，每次 5 分钟。
- 将 FITC 荧光染料按 1:500 比例稀释于酪酰胺信号放大试剂中，每孔加入 100 μl 该溶液。加盖盖玻片后孵育 12 分钟。
- 小心移除盖玻片，用 TNT 缓冲液轻轻振荡洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。
- 将 Cyan3 荧光染料按 1:500 比例稀释于酪酰胺信号放大试剂中，每孔加入 100 μl 该溶液。加盖盖玻片后孵育 12 分钟。
- 小心移除盖玻片，随后将载玻片迅速浸入 TNT 缓冲液中漂洗。
- 用 TNT 缓冲液洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。
- 迅速将载玻片浸入经 DEPC 处理的水中。
- 让载玻片自然风干。加入含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂封片，并用指甲油密封盖玻片四角。
- 载玻片现已可用于显微镜观察。若实验需次日完成，请用铝箔包裹载玻片并置于 4 °C 保存。在加入抗荧光淬灭封片剂 24 小时后，可对载玻片边缘进行完全密封，以便在实验完成后一周内仍可进行成像分析。
6. 杂交探针的可视化
- 打开显微镜。本实验使用标准的免疫荧光显微镜即可，但如果有共聚焦显微镜，也可用于获取三维图像或染色细胞的视频。让显微镜预热15-30分钟。打开计算机和相关软件。
- 在免疫荧光显微镜下检查染色质量。选择一个含有少量寄生虫的区域。
- 手动调节每个激光器的增益。将像素驻留时间调整为4-6 m-1s-1，分辨率设为512 x 512像素。
- 使用Frame Lambda拍摄一张测试图像，并重新调整激光增益。
- 至少拍摄20张质量良好的单细胞荧光图像。为准确评估阳性寄生虫的比例，至少需要拍摄2-5张包含5-20个寄生虫的视野图像。
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结果
图1 展示了RNA FISH方法主要步骤及其时间流程的示意图。
使用单重标记mRNA FISH实验对保存良好与保存较差样本的一系列代表性图像 P. falciparum IE 在下图中显示 图2。这种细胞内原生动物体型微小（1-1.5 μm 直径）的细胞核，经DAPI染色呈蓝色。红细胞侵袭后24小时 P. falciparum 裂体增殖过程， 即 核分裂开始。FISH检测的最佳时机 变量 基因转录发生在红细胞内裂解周期开始后约10-22小时，该周期总时长为48小时。探针通常与出现在主核体附近mRNA物种杂交，该位置可能为与核膜相关联的内质网。A行中的高质量图像显示了分别标记FITC（绿色）和Cyan3（红色）的探针，对应于PFD1235w和PF11_0008 变量 分别在双重筛选中 P. falciparum 亚克隆，3D7 PFD1235w/PF11_0008. 基因的共定位现象明显，...
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讨论
与Northern印迹法和RT-PCR等方法相比，RNA FISH分析能够在单细胞水平上区分特定的mRNA转录本。这使得我们能够区分转录活跃与非活跃的细胞，在本例中即为人类红细胞内的P. falciparum寄生原虫。此类全细胞观察通常是必要的，可能揭示重要且新颖的转录模式1。
尽管已有其他RNA FISH方法被报道4-10，但仍需建立一种新的、优化的方案，用于研究P. falciparum中var mRNA的同步转录。通过使用反义RNA（asRNA）探针作为检测工具，可轻松定位细胞内mRNA活动的时间-空间模式。此外，asRNA探针也可用于其他实验系统，从而支持其特异性1。在开发新方案时，其他关键参数还包括细胞的固定与通透处理。这些步骤通过实证方式确定，即参照其他研究者建议的方法测试多种化学试剂5。我们发现，将作用较慢的交联剂多聚甲醛与凝固性固定剂乙酸联合使用，可良好地保持组织形态结构。此外，与已报道的其他RNA FISH方案类似...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢Michael Alifrangis和Ulla Abildtrup在寄生虫基因分型方面的帮助，以及Christina Holm提供的出色技术协助。本工作由霍华德·休斯医学研究所（资助号55005511）、伦德贝克基金会（资助号R9-A840）以及尼尔斯·玻尔基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
| 含Albumax的培养基： RPMI 1640 谷氨酰胺溶液 | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml 谷氨酰胺溶液 |
| 白蛋白培养基： 庆大霉素硫酸盐 Albumax溶液 | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml 硫酸庆大霉素 50 ml Albumax溶液 |
| 白蛋白溶液 次黄嘌呤 | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g 次黄嘌呤 |
| 白蛋白溶液： AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
| 白蛋白溶液： RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4升RPMI 1640 用磁铁在最大50下溶解 °C. 过滤除菌后于 -20 ℃ 保存 °C，分装保存。 |
| Amberlite | Sigma | A5710-110G | 用于使甲酰胺脱离子的树脂。 |
| 抗生物素山羊多克隆抗体过氧化物酶偶联物 | Calbiochem | 203206 | |
| 抗-地高辛抗体 | Novus Biologicals | NB100-41330 | |
| 含DAPI的抗荧光淬灭剂 | Invitrogen | P36931 | 封片介质需固化24小时后，方可完全密封载玻片。 |
| 生物素 RNA 标记混合物 | 罗氏 | 11685597910 | |
| 数码相机 | 尼康数码显像 DC-F11 | ||
| 盖玻片 | 门泽尔-格拉泽 | 631-1570 | |
| 25 cm 培养瓶2 Nunclon 表面 | Nunc | 156340 | |
| DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC 加入 1000 ml 去离子水中。加入搅拌子，搅拌 12 小时。高压灭菌 30 分钟。 |
| 数码相机 | 尼康数码显视 DC-F11 | ||
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| DynaMaq-15 磁力架 | Invitrogen | 123-01D | |
| 甲酰胺 bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | 去离子甲酰胺：每100 ml甲酰胺中加入5 g离子交换树脂，搅拌30分钟，经Whatman滤纸过滤。 |
| 明胶 0.75% 溶液： 明胶 | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 克明胶溶于 500 毫升 RPMI 1640 培养基中，加热至 56 ℃ °C以溶解。56℃时过滤除菌 °C. 储存于 -20 °C，分装保存。 |
| 明胶 0.75% 溶液： RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 克明胶溶于 500 毫升 RPMI 1640 培养基中，加热至 56 °C 以溶解。56℃时过滤除菌 °C. 储存于 -20 °C 分装。 |
| 谷氨酰胺溶液： L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L-谷氨酰胺溶于500 ml 0.9% NaCl中。溶解后过滤除菌，-20℃保存 °C 分装。 |
| 谷氨酰胺溶液： HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L-谷氨酰胺溶于 500 ml 0.9 % NaCl 中。溶解后过滤除菌，-20 ℃保存 °C，分装保存。 |
| 杂交溶液： 甲酰胺 Bio ultra 99% SSC 20× | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | 总共 20 ml，于 -20℃ 保存冷冻 °分装于 C 中 10 ml 去离子甲酰胺 |
| 杂交溶液： Denhardt's 50倍浓缩液 | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
| 杂交溶液： 酵母tRNARoche封闭试剂 | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt溶液 250 μl 20 mg/ml 酵母 tRNA |
| 杂交溶液： 鲑鱼精子DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g 罗氏封闭试剂 1 ml 10 mg/ml 鲑鱼精子DNA（关键步骤：在96℃下变性鲑鱼精子DNA） °5 分钟，然后加入杂交溶液 |
| Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | 可用杂交炉和经DEPC水浸润的无RNase杂交 chamber 替代。 |
| 紫外透明无荧光浸油 | Sigma | 10976-1EA | |
| 免疫荧光或共聚焦显微镜 | 尼康 D-Eclipse TE2000C | ||
| 指甲油 | 任何药店均有售 | ||
| PBS 20x：NaCl KCl Na2人类表型本体4 x 2H2O KH2PO4 DEPC 去离子水2O | 调节 pH 至 7.4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l | ||
| 4 % 甲醛 | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA 溶于 80 ml PBS/DEPC 中，加热至 65 °C，直至PFA溶解。加入20 ml PBS，使溶液冷却。调节pH至7.4。过滤。分装后于-20℃保存。 °C. |
| 4% 甲醛 / 5% 乙酸 | 950 μl 甲醛 + 50 μ乙酸 | ||
| 胃蛋白酶 | Sigma/Aldrich | P7000 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白 | Calbiochem | 203206 | |
| 红细胞洗涤培养基： RPMI 1640 谷氨酰胺溶液 | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml 谷氨酰胺溶液 |
| 红细胞洗涤培养基： 硫酸庆大霉素 | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml 硫酸庆大霉素 |
| RNase | Sigma/Aldrich | 配制10 mg/ml的储存液。 | |
| 无RNase的1.5 ml离心管 | Ambion | AM12450 | |
| RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
| 4孔玻片，每孔11毫米 | 赛默飞世尔科技 | MENZXER306W | |
| SSC 20x： NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl（175 g/L）0.3 M Na3 柠檬酸 x H2O（88 g/L），用 1 M HCl 调至 pH 7.0 |
| SSC 20x： 柠檬酸钠二水合物 | Sigma-Aldrich | W302600 | 3 M NaCl（175 g/L）0.3 M Na3 柠檬酸 x H2O（88 g/l），用1 M HCl调节pH至7.0 |
| SSPE 20×： NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
| SSPE 20x： NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
| SSPE 20倍浓缩液：4 EDTA 粉末 | 9.4 g EDTA 粉末 加入DEPC水，调节pH至7.4，121℃高压灭菌20分钟 | ||
| TNB缓冲液： TNT缓冲液 | 10 ml TNT缓冲液 | ||
| TNB缓冲液： 封闭试剂 | 0.05 g 封闭剂 为溶解封闭试剂，将溶液加热至 60 °C，持续搅拌一小时。于 -20 保存 °C.（源自 Perkin Elmer TSA 方案。） | ||
| TNT缓冲液： Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1 M Tris/HCl，pH 8.0 |
| TNT缓冲液： NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
| TNT缓冲液： Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC 处理的去离子水2O 869 Ml 将pH值在室温下调节至7.5。（源自Perkin Elmer TSA实验方案。） |
| TSA Plus 花青素3/荧光素系统 | Perkin Elmer | NEL753000IKT | 在开始实验前，请仔细阅读TSA Plus Fluorescence Palette System的说明书。 |
| 14 ml 无菌管 | Almeco - CM LAB Aps | 91016 |
参考文献
- Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).
- Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
- Cheeseborough, M. District Laboratory Practice in Tropical Countries. , Cambridge University Press. Cambridge. (2006).
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