鸡胚HH10期在卵电穿孔实验

摘要

鸡胚体内电穿孔是一种能够对禽类胚胎进行遗传操作的技术。该技术的常见应用包括基因及假定增强子元件的功能分析。本视频展示了在HH 10期鸡胚中进行神经管电穿孔的操作过程，并讲解了注射技术以及正确的鸡蛋处理方法。

摘要

鸡胚体积较大且为体外发育，长期以来一直是发育生物学研究中的重要工具。随着分子生物学技术的发展，鸡胚已成为研究基因调控与功能的有用体系。通过将DNA或RNA构建体电穿孔导入发育中的鸡胚，可实现基因的过表达或敲低，从而在活体条件下分析基因功能。同样，报告基因构建体可用于细胞命运图谱的绘制，或用于检测推测的基因调控元件。与小鼠中的类似实验相比，鸡胚电穿孔具有快速、简便且成本低廉的优势。本视频首先演示如何在蛋壳上开窗以操作胚胎；随后，通过向胚胎下方注射稀释的印度墨水溶液使胚胎可视化；接着，使用玻璃针和移液器将DNA与快绿染料注入正在发育的神经管中，再将铂电极平行置于胚胎两侧，并利用脉冲发生器施加短暂电脉冲；最后，用封口胶带封闭蛋壳并将其放回培养箱中继续发育。此外，视频还展示了鸡蛋的正确储存与操作方法，并讨论了电穿孔后胚胎死亡的可能原因。 关键词：鸡胚，发育生物学，电穿孔，基因功能，基因调控，报告基因，神经管，印度墨水，DNA注射，胚胎操作

方案

卵的处理

1. 卵可在孵化前于13°C下保存长达一周，而不会显著降低存活率（小型葡萄酒冷藏柜非常适合此用途）。
2. 孵化前，将卵升温至室温，然后放入设定为37.8°C（100°F）的加湿鸡胚孵化箱中。
3. 我们通常在孵化开始后约48小时进行电穿孔，此时胚胎已达到Hamburger和Hamilton 10期。
4. 孵化时间可根据所需Hamburger和Hamilton期进行调整。温度至关重要，偏离最佳孵化温度将改变孵化时间并降低胚胎存活率。
5. 孵化期间，卵应侧放，以确保胚胎在电穿孔时处于正确位置。胚胎会漂浮在卵黄上方，因此在开窗前用铅笔标记卵的顶部位置有助于确定切割位置。

准备

1. 将 Leibovitz L-15 培养基预热至 37°C。将玻璃毛细管拉制成针状。放置电极和显微操作器，并将电极连接至脉冲发生器。

窗宽窗位调节

1. 使用带有粗针头的注射器，从鸡蛋的小端刺穿蛋壳。
2. 小心将针头朝下，避免破坏蛋黄，抽出约 5ml 蛋白。
3. 用一小块胶带封住穿刺孔。
4. 用另一块胶带（约 4×4 cm）覆盖蛋的顶部。
5. 使用弯头剪刀，小心操作以免损伤胚胎，剪出一个刚好足够大的开口，形成可供操作的窗口。

可选：为了观察神经管，可用26号针头将墨水溶液注射到胚胎下方（从血环外侧将针头插入胚胎下方）。印度墨水应使用Hanks液或类似的无菌缓冲液按1:5比例稀释。

注射与电穿孔

1. 使用镊子将毛细管尖端折断至所需直径。
2. 使用口吸移液器将质粒/Fast Green 染料吸入毛细管中。
3. 将胚胎头部朝向操作者放置，以较小角度将针头插入神经管。
4. 将质粒溶液注入神经管腔内，直至染料充满整个腔室。

注意：切勿使针尖直径大于神经管直径。通常情况下，可通过吸取液体时的难易程度来判断针尖是否达到理想大小。如果阻力极大，说明开口可能过小，应再次在较高位置折断针尖；如果阻力很小或几乎没有阻力，说明开口过大，应更换新的针头。

1. 在胚胎上滴加一至两滴无菌 L-15 培养基。
2. 立即将电极置于胚胎两侧，与神经管平行，以 10–24 伏电压进行 5 次脉冲，每次持续 50 毫秒，间隔 1 秒。若操作成功，可在电极附近观察到气泡产生。
3. 小心移除电极，向胚胎上方滴加 5 滴 L-15 培养基，并用胶带密封蛋壳。务必确保蛋壳密封良好，因为干燥是电穿孔后胚胎丢失的主要原因。
4. 将蛋放回孵育箱中，窗口朝上，继续孵育至达到所需的 H&H 发育阶段。

讨论

本方案提供了对HH10期鸡胚进行神经管电穿孔的逐步操作指南。除了展示该技术外，还提供了鸡蛋的储存与操作规范。该技术在基因分析方面具有广泛的应用，其实验操作简便且成本低廉，适合众多实验室开展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鸡胚孵育器			加湿型，设定为 37.80°C (100F)。
脉冲发生器	Genetronics	BTX T820	方波发生器或性能相当的设备
电极			我们的电极由直径 0.25 mm 的铂丝制成，长度为 5 mm，间距为 1 mm
连接电缆
显微操作仪
解剖显微镜			具有较大工作距离
玻璃毛细管			及拉针仪或商用玻璃针
Leibovitz’s L-15 培养基
鸡胚蛋			受精蛋
弯头剪刀
10 ml 注射器
粗孔针头			16–18G
口吸移液管
印度墨汁
胰岛素注射器/注射器
质粒 DNA			≥ 1μg/μl，溶于含 0.05% 快绿染料的无菌 TE 缓冲液或 1X PBS 中