突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C. elegans）中荧光标记的神经递质受体进行三维定量，从而在单个样品中快速表征数百个突触，且避免了z平面投影所引入的畸变。
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本文内容
摘要
摘要
突触强度是指突触前神经递质释放事件在突触后膜上引发的突触后反应的幅度，对整个神经环路功能具有重要影响。突触强度在很大程度上取决于突触后膜突触部位聚集的神经递质受体的数量。受体水平在发育过程中建立，并可通过定位于细胞表面、突触下区及细胞内储存池之间的受体转运进行调节，这是突触可塑性和神经调制的重要机制。严格量化突触局部神经递质受体丰度的方法对于研究突触发育和可塑性至关重要。荧光显微镜是一种理想的方法，因为它能够保留空间信息，区分突触与非突触区域的受体池，并可分辨定位于不同类型突触的受体群体。遗传模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）特别适用于此类研究，因其神经系统体积小、结构相对简单，且具有通透性，加之拥有强大的遗传操作技术，可在完整动物体内研究天然突触。
本文介绍一种用于定量分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）中荧光标记的突触神经递质受体的方法。该方法的核心特点是对多平面共聚焦显微镜输出文件中的单个突触进行三维自动化识别与分析，为每个突触分别统计其位置、体积、荧光强度以及总荧光量。与对手动分析共聚焦数据z平面投影的方法相比，本方法具有两个主要优势：第一，由于包含了共聚焦数据集的每一个成像平面，避免了基于像素强度平均值或最大值的z平面投影所导致的数据丢失；第二，突触的识别过程实现了自动化，同时实验人员可在数据分析过程中随时检查识别结果，从而实现从大量突触中快速而准确地提取数据。每份样本可轻松获得数百至数千个突触的数据，生成大规模数据集以最大限度提高统计效能。本文还讨论了在制备用于分析的 C. elegans 样本以及进行共聚焦成像时需注意的因素，以尽量减少同一处理组内个体之间的变异。尽管该方法最初用于分析 C. elegans 的突触后受体，但它普遍适用于任何定位于突触部位的蛋白质，或实际上任何定位于离散簇状结构、点状结构或细胞器中的荧光信号。
该实验分为三个步骤进行：1）样品制备，2）共聚焦成像，3）图像分析。步骤1和2针对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的具体操作，而步骤3可普遍适用于共聚焦显微图像中任何点状荧光信号的分析。
方案
1. 成像用线虫的制备
本实验方案的这一部分基于已发表的 C. elegans 培养技术1,2，并在图1中进行了概述。
- 在接种了NA22的大肽胨NGM琼脂平板（10 cm）上培养线虫 E. coli 细菌直至几乎耗尽营养。若进行免疫染色，一个培养板通常可提供足够用于单次染色的线虫数量，此估算已考虑实验过程中的损耗以及为成像而筛选线虫所采用的严格标准（见第2部分）。
- 通过倒入几毫升 ddH₂O 收集线虫20 接种到平板上，轻轻涡旋，将液体倒入 15 ml 圆锥管中（如有必要，重复操作以转移大部分线虫）。在临床离心机中以 1000 × g 离心 3 分钟，收集沉淀。用 ddH₂O 洗涤沉淀 1–3 次2O，直至上清液澄清，以去除残留细菌。使用聚丙烯移液管移除上清液，因为线虫会黏附于玻璃表面（从这一步开始，必须尽量减少各步骤之间的时间，以避免卵活力下降）。
- 最后一次洗涤后，将线虫沉淀重悬于5 ml碱性次氯酸盐溶液中，以裂解线虫并释放虫卵。轻轻摇动，并每隔约1分钟在体视显微镜下观察试管。当约50%的线虫被裂解（表现为弯曲且破裂打开）时，立即用卵缓冲液（Egg Buffer）加满试管，反复倒置数次，于1000×g离心3分钟，终止裂解反应。裂解时间不得超过5分钟。
- 用移液....
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讨论
本文所述方法旨在从秀丽隐杆线虫（C. elegans）的大群体突触中提取定量的多参数数据，同时最大限度地提高处理组内的实验一致性。该目标的实现依赖于三个关键特征。首先，免疫染色在同步发育的线虫群体中进行，以确保所有个体处于相同的发育年龄。这一步骤至关重要，因为发育过程中表达水平的调控可能会掩盖实验处理的实际效应（例如，UNC-49 GABA受体的免疫荧光信号在发育过程中可变化数倍（K. Davis 等，正在准备中））。此外，固定和通透处理的效果可能存在高度变异性，从而影响定量比较的可靠性。使用同步培养的线虫可显著降低这种固有的变异性，提高技术的可重复性。其他应对该变异性的方法包括使用针对无关靶标的第二抗体作为独立可视化的内部对照，以评估通透效率，或在活体线虫中成像GFP标记的蛋白，从而完全避免通透步骤。然而，后一种方法会引入新的问题，因为不再直接测量内源性蛋白，需考虑由转基因表达水平或拷贝数不一致、GFP融合导致的结构改变，或非生理性的转基因表达水平所引起的潜在假象。目前尚无任何单一方法是完美的；理想情况下，应通过多种方法获得相互支持的数据。在本实验方案中，起始培养物的规模已优化，以获得足够数量的固定.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢 A. Benham 在本实验方案开发过程中的协助。本研究由 NIH 基金项目 NS06747 资助，授予 B. A. B.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Volocity v4.0 或更高版本 | PerkinElmer/Improvision | 请查询您所在单位的影像核心设施是否提供该软件。PerkinElmer 官网提供演示版软件。本方法仅需使用 Volocity 的定量分析模块。 | |
| 表 2. 特异性试剂与设备 | |||
| <表格 边框="1"> | |||
| 卵缓冲液 | NaCl KCl CaCl2 MgCl2 HEPES （调节 pH 至 7.3） | 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM | |
| 碱性次氯酸盐（5 ml） | 新鲜家用漂白剂（开瓶后30天内使用，过期丢弃） 10 N NaOH ddH₂O2O | 1.0 ml 0.25 ml 3.75 ml |
参考文献
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E.
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