C. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

摘要

突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C. elegans）中荧光标记的神经递质受体进行三维定量，从而在单个样品中快速表征数百个突触，且避免了z平面投影所引入的畸变。

摘要

突触强度是指突触前神经递质释放事件在突触后膜上引发的突触后反应的幅度，对整个神经环路功能具有重要影响。突触强度在很大程度上取决于突触后膜突触部位聚集的神经递质受体的数量。受体水平在发育过程中建立，并可通过定位于细胞表面、突触下区及细胞内储存池之间的受体转运进行调节，这是突触可塑性和神经调制的重要机制。严格量化突触局部神经递质受体丰度的方法对于研究突触发育和可塑性至关重要。荧光显微镜是一种理想的方法，因为它能够保留空间信息，区分突触与非突触区域的受体池，并可分辨定位于不同类型突触的受体群体。遗传模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）特别适用于此类研究，因其神经系统体积小、结构相对简单，且具有通透性，加之拥有强大的遗传操作技术，可在完整动物体内研究天然突触。

本文介绍一种用于定量分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）中荧光标记的突触神经递质受体的方法。该方法的核心特点是对多平面共聚焦显微镜输出文件中的单个突触进行三维自动化识别与分析，为每个突触分别统计其位置、体积、荧光强度以及总荧光量。与对手动分析共聚焦数据z平面投影的方法相比，本方法具有两个主要优势：第一，由于包含了共聚焦数据集的每一个成像平面，避免了基于像素强度平均值或最大值的z平面投影所导致的数据丢失；第二，突触的识别过程实现了自动化，同时实验人员可在数据分析过程中随时检查识别结果，从而实现从大量突触中快速而准确地提取数据。每份样本可轻松获得数百至数千个突触的数据，生成大规模数据集以最大限度提高统计效能。本文还讨论了在制备用于分析的 C. elegans 样本以及进行共聚焦成像时需注意的因素，以尽量减少同一处理组内个体之间的变异。尽管该方法最初用于分析 C. elegans 的突触后受体，但它普遍适用于任何定位于突触部位的蛋白质，或实际上任何定位于离散簇状结构、点状结构或细胞器中的荧光信号。

该实验分为三个步骤进行：1）样品制备，2）共聚焦成像，3）图像分析。步骤1和2针对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的具体操作，而步骤3可普遍适用于共聚焦显微图像中任何点状荧光信号的分析。

方案

1. 成像用线虫的制备

本实验方案的这一部分基于已发表的 C. elegans 培养技术^1,2，并在图1中进行了概述。

1. 在接种了NA22的大肽蛋白胨NGM琼脂平板（10 cm）上培养线虫 E. coli 细菌直至几乎耗尽。若进行免疫染色，一个培养板通常可提供足够用于单次染色的线虫数量，此估算已考虑操作过程中的损失以及为成像而筛选线虫所采用的严格标准（见第2部分）。
2. 通过倒入几毫升 ddH₂O 收集线虫₂0 接种至平板，轻轻旋转混匀，将液体倒入 15 ml 圆锥形离心管中（必要时重复操作，以转移大部分线虫）。在临床离心机中以 1000 × g 离心 3 分钟，收集沉淀。用 ddH₂O 洗涤沉淀 1–3 次。₂O，直至上清液澄清，以去除残留的细菌。使用聚丙烯移液管移除上清液，因为线虫会黏附在玻璃表面（从这一步开始，必须尽量减少各步骤之间的时间，以避免卵活力下降）。
3. 最后一次洗涤后，将线虫沉淀重悬于5 ml碱性次氯酸盐溶液中，以裂解线虫并释放虫卵。轻轻摇动，并每隔约1分钟在解剖显微镜下观察试管。当约50%的线虫被裂解（表现为弯曲且破裂打开）时，立即用卵缓冲液（Egg Buffer）加满试管，反复倒置数次，于1000×g离心3分钟，终止裂解反应。裂解时间不得超过5分钟。
4. 用移液管吸除上清液，并用卵缓冲液将沉淀洗涤3次。
5. 为了将卵与碎屑分离，将其在30%蔗糖溶液（ddH₂O配制）的密度垫上漂浮₂O：步骤1.4最后一次洗涤后，小心移除上清液，并将沉淀重悬于5 ml ddH₂O中。₂0. 加入5 ml无菌60%蔗糖溶液至ddH₂O中₂O，并充分混匀。在临床离心机中以1000×g离心6分钟。虫卵将聚集在液面弯月面处（呈浑浊外观），而碎片则形成沉淀。
6. 使用塑料移液管吸取最小体积的卵，并转移至未接种的NGM琼脂平板上。试管壁上附着的卵可轻轻用液体冲洗下来并一同转移。每种分析的品系使用一个10 cm的未接种平板即可。
7. 将未接种的培养板与卵在20 °C下孵育过夜（约16小时）。孵育初期将培养板盖略微打开数小时以通风干燥，但需确保过夜时盖好盖子。
8. 孵化后，将L1幼虫转移至含有S Basal的15 ml锥形管中（向培养板中加入几毫升S Basal，轻轻旋转混匀，然后倒入管中）。在临床离心机中离心成团（3分钟，1000×g），用少量S Basal重悬，转移至接种了NA22细菌的10 cm NGM琼脂平板。步骤1.1中的每块原始平板对应使用此处的2块平板。培养至线虫达到所需年龄。
9. 每天观察培养物一至两次。若发现线虫有饥饿风险，应转移至新鲜的NA22平板。对于野生型N2线虫，饥饿发生前会出现线虫排成一行或呈波浪状移动的现象，这是群体从食物耗尽区域集体迁移所致。一旦出现此现象，数小时内食物将被完全耗尽。
10. 线虫现已准备好进行免疫染色或活体成像。在悬浮状态下对线虫进行固定和染色是最佳方法，因为可轻松地对大量完整的线虫进行成像。染色步骤基于Finney和Ruvkun实验方案。^3-6 优于冷冻裂解法，因为成像需要大量线虫。

2. 共聚焦成像

1. 将线虫固定在载玻片上进行共聚焦成像。调整线虫密度至每微升数百条。在S-basal溶液中制备2%琼脂糖垫，并在其周围用细圈凡士林密封（使用装有剪断的25号针头的3 ml注射器涂抹），以防止成像过程中蒸发。取数微升线虫悬液滴加到盖玻片上（若对活体线虫成像，需加入麻醉剂），然后将琼脂糖垫轻轻覆盖在盖玻片上，使线虫在垫上均匀分散。
2. 选择用于成像的线虫。应挑选目标突触朝向物镜方向、径向偏移角度不超过±45°的个体（0°表示完全正对物镜）。评估过程应迅速完成（数秒内），以避免光漂白。初始培养规模已优化，以确保有足够数量的线虫满足此类几何条件。
3. 完成样本的共聚焦成像。对于较为扁平的样本，若其厚度可被约14层、每层0.4 μm的光学切片覆盖，则可获得最佳成像效果。高速、低分辨率图像（512 × 512像素）已足以实现快速而准确的数据采集。应避免因信号过强导致探测器饱和，否则将低估荧光信号强度。

3. 突触簇的自动识别与分析

1. 使用 Volocity 4.0（或更高版本）软件（PerkinElmer）打开共聚焦显微镜的多通道 TIF 输出文件。
2. 裁剪掉图像中不包含目标结构的区域（图像 -> 扩展焦面 -> 使用“自由手选区”工具选择感兴趣区域 -> 操作 -> 裁剪至选区；图 2A）。注意：扩展焦面功能会在计算机屏幕上生成一个 z 平面投影以辅助分析，但不会影响底层数据；亮度和对比度的调整（如有必要）也是如此。
3. 使用线条工具测量所分析区域的长度。线条的长度将被自动计算并添加到数据表中（图 2B）。
4. 使用“基于强度的对象”滤波器（测量模式）识别对象。设定阈值，使突触簇被高亮显示，而非突触背景不被包含（图 2C）。若使用另一种颜色标记的独立突触标志物，可能有助于明确识别突触。典型的突触大小范围为几个至几百个体素。应首先使用对照样本设定一次阈值，并在所有后续样本中保持一致。不得对每个样本单独进行阈值设定，以免引入实验者偏差。对象将被自动选中并列入表格（图 2D）。
5. 整理并导出数据。剔除体积为 2 个体素或更少的对象，因其通常为背景噪点。这些对象可通过进一步滤波或在后续分析中去除。为便于下游处理时清除，可按“对象大小”对数据文件重新排序，使这些小对象集中在一起。将数据导出为 CSV 格式，可用 Microsoft Excel 或其他电子表格程序打开。每幅图像生成一个输出文件。
6. 若无法使用 Volocity 软件，也可采用其他方法分析共聚焦数据的 z 平面投影（例如参考文献 ⁷，或使用 ImageJ 进行手动分析），但会丢失三维信息（见讨论部分）。

4. 代表性结果

所介绍的定量方法应能够区分不同亮度和不同体积的簇状群体。图3中展示的代表性图像及相应的定量数据，说明了基于这些参数进行区分的示例。通常情况下，结果应与肉眼观察到的现象一致。以秀丽隐杆线虫（C. elegans）腹神经索中UNC-49 GABA受体免疫染色为例，所有个体通常在大小和成熟度上非常相似，对五条线虫群体的总突触荧光值（归一化至所分析神经索的长度）进行统计，其标准误约为均值的10%⁴。基因突变及其他实验处理（如药物暴露）不仅可能改变突触簇的体积和强度值及其频率分布，还可能影响线虫的发育时间进程和同步性，从而导致变异性升高。然而，定量结果应始终反映肉眼可识别的观察结果；若不一致，则应通过检查图像以及Volocity软件识别出的对象，定位错误来源，并采取相应的纠正措施，例如重新设定阈值或剔除人为假象对象。

图1. 同步化制备 秀丽隐杆线虫 培养物。 通过该程序可获得同步培养的细胞，因为 秀丽隐杆线虫 在缺乏食物的情况下，发育会停滞在L1幼虫阶段，当提供食物后发育恢复。

图 2. 突触斑点的定量分析。

1. 裁剪图像的无关区域以减小文件大小并提高特异性。左侧面板显示起始图像，中间面板显示选定区域，右侧面板显示裁剪后的图像。红色信号为UNC-49 GABA受体免疫荧光信号，绿色信号为在突触前GABA神经元中表达的突触小泡相关蛋白GFP（突触前标志物）⁴。 点击此处查看大图。
2. 沿待分析的神经索片段长度绘制一条线，其长度将自动记录在结果表中。该信息对于标准化突触数据至关重要，因为可分析神经索的长度在染色过程中若线虫发生断裂可能会有数倍差异。 点击此处查看大图。
3. 应用阈值以识别单个突触簇。左侧面板显示阈值处理前的图像；不同阈值水平的示例分别显示在不同面板中（绿色信号已省略）。每个被识别的对象在图像上以彩色区域标出。请注意最左侧面板中肉眼可见的突触簇与最右侧面板中彩色区域之间的一致性。 点击此处查看大图。
4. 每个被识别的对象在结果表中单独列出。可根据需要选择并高亮显示图像中的各个对象以便检查。请注意表格中包含红色（“罗丹明”）和绿色（“EGFP”）通道的信息；但由于对象仅基于红色荧光识别，绿色通道的信息可能具有误导性。该分析也可在单色图像上进行。 点击此处查看大图。

图 3. 代表性结果。 野生型 C. elegans 在使用蝇蕈醇（一种GABA受体激动剂）处理前（A）和处理后（B）的UNC-49 GABA受体染色代表性显微图像。长时间暴露于该激动剂会导致受体下调。图中显示的是在阈值化处理及去除微小背景斑点前后裁剪过的图像（左：处理前，右：处理后）。（C）对应于（A）和（B）样本的定量突触参数图：归一化至神经索长度的总荧光强度（左），单个突触荧光含量的累积概率直方图（中）以及突触体积的累积概率直方图（右），显示激动剂暴露引起突触含量和体积的统计学显著降低（未处理组 n = 60 个突触，蝇蕈醇处理组 n = 115 个突触；p < 0.001，Kolmogorov-Smirnov 检验 http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html）。

讨论

本文所述方法旨在从秀丽隐杆线虫（C. elegans）的大群体突触中提取定量的多参数数据，同时最大限度地提高处理组内的实验一致性。该目标的实现依赖于三个关键特征。首先，免疫染色在同步发育的线虫群体中进行，以确保所有个体处于相同的发育年龄。这一步骤至关重要，因为发育过程中表达水平的调控可能会掩盖实验处理的实际效应（例如，UNC-49 GABA受体的免疫荧光信号在发育过程中可变化数倍（K. Davis 等，正在准备中））。此外，固定和通透处理的效果可能存在高度变异性，从而影响定量比较的可靠性。使用同步培养的线虫可显著降低这种固有的变异性，提高技术的可重复性。其他应对该变异性的方法包括使用针对无关靶标的第二抗体作为独立可视化的内部对照，以评估通透效率，或在活体线虫中成像GFP标记的蛋白，从而完全避免通透步骤。然而，后一种方法会引入新的问题，因为不再直接测量内源性蛋白，需考虑由转基因表达水平或拷贝数不一致、GFP融合导致的结构改变，或非生理性的转基因表达水平所引起的潜在假象。目前尚无任何单一方法是完美的；理想情况下，应通过多种方法获得相互支持的数据。在本实验方案中，起始培养物的规模已优化，以获得足够数量的固定...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Volocity v4.0 或更高版本	PerkinElmer/Improvision		请查询您所在单位的影像核心设施是否提供该软件。PerkinElmer 官网提供演示版软件。本方法仅需使用 Volocity 的定量分析模块。
表 2. 特异性试剂与设备
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卵缓冲液	NaCl KCl CaCl2 MgCl2 HEPES （调节 pH 至 7.3）	118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM
碱性次氯酸盐（5 ml）	新鲜家用漂白剂（开瓶后30天内使用，过期丢弃） 10 N NaOH ddH₂O2O	1.0 ml 0.25 ml 3.75 ml