方法文章

体外 PDZ依赖性CFTR大分子信号复合物的分析

11K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/4091

⸱

2012年8月13日

 ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University School of Medicine, 3Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

本文内容

摘要

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种上皮氯离子通道，已被报道可与多种蛋白质相互作用并调控重要的细胞过程；其中，CFTR通过其PDZ基序介导的相互作用已有充分研究。本实验方案描述了我们建立的用于组装PDZ依赖性CFTR大分子信号复合物的方法 体外.

摘要

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种主要位于上皮细胞顶膜的氯离子通道，在跨上皮液体稳态中发挥关键作用1-3CFTR 与两种主要疾病相关：囊性纤维化（CF）4 分泌性腹泻5在囊性纤维化（CF）中，CFTR Cl- 通道的合成或功能活性降低。该疾病在美国约每2,500名高加索人中影响1人。6CFTR 活性过高也与毒素诱导的分泌性腹泻病例相关。例如，由霍乱毒素和耐热肠毒素 E. coli 肠毒素，可刺激肠道内cAMP或cGMP的产生7.

越来越多的证据表明，囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）与多种其他蛋白质之间存在物理和功能上的相互作用，这些蛋白质包括转运蛋白、离子通道、受体、激酶、磷酸酶、信号分子以及细胞骨架成分。CFTR与其结合蛋白之间的这些相互作用已被证明在体外和体内均对CFTR介导的跨上皮离子转运起关键调控作用in vitro和in vivo8-19。本实验方案仅聚焦于研究CFTR羧基末端尾部（含有一个蛋白质结合基序，即PSD95/Dlg1/ZO-1（PDZ）基序）与一组含有特定结合模块（称为PDZ结构域）的支架蛋白之间相互作用的方法。迄今为止，已有多种不同的PDZ支架蛋白被报道可与CFTR的羧基末端尾部以不同亲和力结合，例如NHERF1、NHERF2、PDZK1、PDZK2、CAL（CFTR相关配体）、Shank2和GRASP20-27。CFTR中被PDZ支架蛋白识别的PDZ基序位于其C末端最后四个氨基酸（即，人CFTR中的1477-DTRL-1480）20。有趣的是，CFTR能够以不同的亲和力同时结合NHERF和PDZK1的多个PDZ结构域22。这种CFTR结合的多价性已被证明具有重要的功能意义，提示PDZ支架蛋白可能有助于在细胞内形成CFTR大分子信号复合物，从而实现特异性/选择性且高效的信号传导16-18。

已开发多种生物化学检测方法用于研究与CFTR相关的蛋白质相互作用，例如免疫共沉淀、拉下实验、成对结合实验、比色成对结合实验以及大分子复合物组装实验16-19,28,29本文重点介绍组装依赖于PDZ基序的包含CFTR的大型分子复合物的详细步骤 体外，该方法被我们实验室广泛用于研究涉及CFTR的蛋白质-蛋白质或结构域-结构域相互作用16-19,28,29.

方案

1. 在细菌中表达和纯化重组标签融合蛋白

  1. 通过PCR方法扩增CFTR、LPA2、MRP2、MRP4、β2AR和NHERFs（全长或PDZ1或PDZ2结构域）C端尾部（C末端含有PDZ基序的最后50-100个氨基酸）的特定区域。
  2. 将PCR产物克隆至pGEX4T-1载体以表达GST融合蛋白（如GST-NHERFs、GST-MRP4 CT），克隆至pMAL-C2载体以表达MBP融合蛋白（如MBP-β2AR CT、MBP-CFTR CT），以及克隆至pET30载体以表达His-S融合蛋白（如His-S-CFTR CT、His-S-PDZK1）。
  3. 将重组质粒转化至蛋白酶缺陷型E. coli菌株（BL21-DE3）中，以最大程度减少重组蛋白的降解。
  4. 在含有适当抗生素（如氨苄青霉素或卡那霉素）的LB培养基（pH 7.0）中，于37 °C过夜培养。将过夜培养物按1:10稀释后，继续在37 °C培养2小时，随后加入0.5–1 mM IPTG，在30 °C诱导表达4小时。于4 °C下以8,000 × g离心10分钟收集菌体。
  5. 使用含溶菌酶（1 mg/ml）、0.2% Triton X-100及蛋白酶抑制剂的蔗糖缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA，1 mM PMSF，10%蔗糖）裂解细胞。每升培养物所得菌体使用20 ml裂解缓冲液。
  6. 在4 °C下于旋转摇床上孵育30分钟。
  7. 在4 °C下以20,000 × g离心30分钟，收集澄清的上清液。
  8. 向澄清上清液中加入1 ml以下树脂/琼脂糖珠（50%悬浮液，以蔗糖缓冲液配制）：
    • 用于GST融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖珠。
    • 用于His-S融合蛋白的Talon珠。
    • 用于MBP融合蛋白的直链淀粉树脂。
  9. 在4 °C下于旋转摇床上孵育4小时。
  10. 用1× PBS（15 ml）重悬珠子，混匀2分钟，以800 × g离心2分钟，弃去上清液。重复此洗涤步骤共6次。
  11. 使用相应的洗脱缓冲液（每1 ml珠子使用2 ml洗脱缓冲液）从珠子上洗脱蛋白：
    • GST融合蛋白洗脱缓冲液：25 mM Tris-HCl（pH 8.0），140 mM NaCl，20 mM还原型谷胱甘肽。
    • His融合蛋白洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 8.0），500 mM NaCl，200 mM咪唑。
    • MBP融合蛋白洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 8.0），200 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT，10 mM麦芽糖。
  12. 将洗脱后的蛋白在4 °C下对2 L的1× PBS进行透析（以避免蛋白降解），每4小时更换一次PBS，共更换4次。使用Centricon滤膜（分子量截留值10,000，Millipore）浓缩蛋白，并分装后于-80 °C保存。
  13. 采用Bradford法测定蛋白浓度，以BSA为标准品通过SDS-PAGE评估蛋白质量。若蛋白完整性不理想，可采用凝胶过滤或离子交换等二次纯化步骤（e.g.，我们曾使用G-75 Sepharose柱进一步纯化GST融合蛋白）。

2. 细胞培养与细胞裂解液制备

  1. 在含有10%胎牛血清和青霉素/链霉素的Eagle最小必需培养基（MEM）中，于37 °C、5% CO2条件下，在聚苯乙烯培养瓶中培养稳定过表达CFTR-wt和CFTR-his10的幼年仓鼠肾（BHK）细胞，或瞬时过表达Flag-LPA2-wt或Flag-LPA2-ΔSTL的BHK细胞，以及稳定过表达MRP2的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞。
  2. 在添加10%胎牛血清和青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下，在聚苯乙烯培养瓶中培养稳定过表达CFTR-wt和CFTR-his10的人胚胎肾293（HEK293）细胞。
  3. 用裂解缓冲液（PBS - 0.2% Triton-X-100，加入蛋白酶抑制剂混合物，含1 mM苯甲基磺酰氟、1 μg/ml抑肽酶、1 μg/ml亮抑蛋白酶肽、1 μg/ml胃蛋白酶抑制剂）裂解细胞；每60 mm培养皿使用500 μl裂解缓冲液，每100 mm培养皿使用1000 μl裂解缓冲液。
  4. 在4 °C下振荡裂解液20分钟，然后在4 °C下以16,000 × g离心15分钟去除不溶性物质。采用Bradford法测定蛋白浓度。

3. 体外 CFTR复合物（CFTR-PDZK1-MRP4）的组装

  1. 到……中 200 μl 裂解缓冲液（PBS - 0.2% Triton-X 100 + 蛋白酶抑制剂），加入 20 μg 纯化的GST-MRP4-C端50个氨基酸（CT50）融合蛋白。
  2. 添加不同量（0-40 μg纯化后的His-S-PDZK1融合蛋白的量。
  3. 将两种蛋白质在旋转混匀仪上混合 22 °C 1-2 小时。
  4. 添加 20 μl 将谷胱甘肽琼脂糖珠（50% 悬液）加入蛋白质混合物中，继续孵育1小时。此步骤也称为成对结合。
  5. 在此期间，按照上述第2步所述方法制备过表达Flag-CFTR（wt）的HEK293细胞裂解液。
  6. 用裂解缓冲液将复合物洗涤两次，800 × g 每次洗涤1分钟，每次洗涤后小心吸除上清液。注意不要吸走底部的珠子。
  7. 将上述制备的 HEK293 细胞裂解液加入珠子中，轻轻混匀于 4 °C 3 小时（或过夜）。
  8. 按照步骤3.6所述，用裂解缓冲液将珠子充分洗涤3次。
  9. 使用洗脱液洗脱蛋白质 30 μl 上样缓冲液（5×）：0.6 M Tris-HCl（pH 6.8）、50% 甘油、2% SDS 和 0.1% 溴酚蓝；含 5% β-巯基乙醇。
  10. 孵育于 37 °C 水浴 10-15 分钟，然后在 5,000 × g 30 秒以沉淀珠子。
  11. 将所有洗脱液上样至4-15%凝胶。
  12. 运行 SDS-PAGE 约 30–40 分钟。
  13. 将蛋白质条带转移至PVDF膜上，持续1.5小时。
  14. 用含5%脱脂奶粉的TBS-Tween缓冲液封闭膜。
  15. 将膜与一抗（如抗CFTR IgG，R1104）孵育 4 °C，过夜。
  16. 用 TBS-Tween 洗涤膜，每次 5 分钟，共洗 6 次。
  17. 用二抗（如辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体）孵育膜nd 抗体）孵育 45 分钟 22 °C.
  18. 用 TBS-Tween 洗涤膜，每次 5 分钟，共洗 6 次。
  19. 通过ECL显色法观察蛋白条带。
  20. 代表性数据如图所示 图1.

4. 代表性结果

一个由CFTR组成的大型信号复合物的组装实例 体外 如图所示 图1MRP4 C端50个氨基酸（MRP4-CT50）、PDZK1和全长CFTR之间形成了一个大分子复合物图1, 底部）。复合物的形成随着中介蛋白PDZK1量的增加而呈剂量依赖性增强图1, 底部)18.

Flag-CFTR interaction; diagram and blot analysis; macromolecular complex; His-PDZK1 gradient.
图1. 大分子复合物检测实验的图示说明（顶部检测到一种大分子复合物 体外 与三种蛋白质（GST-MRP4-CT50、His-S-PDZK1 和 Flag-CFTRwt）以剂量依赖的方式结合（底部)18.

 CFTR-NHERF1-β2AR（参考文献14）CFTR-NHERF2-LPA2（参考文献15）CFTR-PDZ蛋白-MRP2（参考文献17）CFTR-PDZK1-MRP4（参考文献16）
亲和 beads淀粉树脂S-蛋白琼脂糖淀粉树脂谷胱甘肽琼脂糖
纯化蛋白-1MBP-β2AR CTHis-S-CFTR CTMBP-CFTR CTGST-MRP4 CT
纯化蛋白-2GST-NHERF1GST-NHERF2GST-PDZ蛋白His-S-PDZK1
纯化蛋白-3（或细胞裂解液）CFTR-wt 或 CFTR-his10（BHK 或 HEK 细胞裂解液）Flag-LPA2-wt 或 Flag-LPA2-ΔSTL（BHK 细胞裂解液）MRP2（MDCK 细胞裂解液）纯化的 Flag-CFTR-wt 或 CFTR-his10（或细胞裂解液）
抗体抗CFTR IgG抗Flag HRP抗MRP2 IgG抗Flag HRP

表1. 含CFTR的各种大分子复合物组装概述 体外.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在本方案中，我们展示了一种方法 体外 使用纯化的蛋白质（或蛋白质片段）和/或细胞裂解液组装并检测含有CFTR的大型信号复合物，方法如先前报道所述16-19,29,30为获得最佳结果，在制备过程中需特别关注以下关键环节：

  • 在按照步骤1)纯化GST融合蛋白时，加入还原型谷胱甘肽后，必须将洗脱缓冲液的pH值调节至8.0。加入还原型谷胱甘肽后，pH值可能低至3.0。如果在洗脱前未调节pH值，洗脱效率将显著降低。
  • 当蛋白质从珠粒中洗脱后，应立即进行透析；否则，纯化的蛋白质可能从溶液中析出。如果无法在洗脱后立即进行蛋白质透析，则不应进行洗脱，而应将蛋白质保留在琼脂糖/珠粒上。
  • 强烈建议不要将用于Western blotting的含CFTR的大分子复合物样品煮沸，因为CFTR聚集是一个常见问题。相反，样品应在上样前于37 °C加热10–15分钟。
  • 对于具有低亲和力相互作用的蛋白质复合物，可使用SuperSignal West Femto（或Pico）Maximum Sensitivity Substrate（Pierce）进...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

本研究工作得到了美国心脏协会（大东南分会）初期研究资助0765185B、Elsa U. Pardee基金会研究资助以及韦恩州立大学校内启动基金和心血管研究所Isis计划奖项的支持。体外 CFTR大分子复合物组装方法最初由A.P. Naren博士（田纳西大学健康科学中心）首创。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
pGEX4T-1 载体GE Healthcare28-9545-49曾用名 Amersham Biosciences
pMAL-C2 载体New England BioLabs
pET30 载体EMD Chemicals69077-3曾用名 Novagen
谷胱甘肽琼脂糖珠BD 生物科学554780
直链淀粉树脂New England BioLabsE8021S
Talon 珠Clontech635501
还原型谷胱甘肽BD 生物科学554782
咪唑FisherBP305-50
麦芽糖FisherBP684-500
S蛋白琼脂糖EMD Chemicals69704-3曾用名 Novagen
抗Flag HRPSigmaA8592
抗CFTR IgG定制R1104识别CFTR第722-734位氨基酸表位的单克隆抗体
抗MRP2 IgGChemicon InternationalMAB4148现为默克旗下 Millipore 的一部分

<强>表2. 特定试剂与设备

参考文献

  1. Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
  2. Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR. Cell. 68, 809-818 (1992).
  3. Quinton, P. M. Chloride impermeability in cystic fibrosis. Nature. 301, 421-422 (1983).
  4. Cheng, S. H. Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis. Cell. 63, 827-834 (1990).
  5. Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model. Science. 266, 107-109 (1994).
  6. Li, C., Naren, A. P. CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners. Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).
  7. Chao, A. C. Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase. Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).
  8. Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship. Nature. 363, 263-268 (1993).
  9. McNicholas, C. M. Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).
  10. Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells. J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).
  11. Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF. Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).
  12. Ahn, W. Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct. J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).
  13. Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates. Embo. J. 17, 898-908 (1998).
  14. Naren, A. P. Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms. Nature. 390, 302-305 (1997).
  15. Naren, A. P. Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents. J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).
  16. Naren, A. P. A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).
  17. Li, C. Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions. J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).
  18. Li, C. Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia. Cell. 131, 940-951 (2007).
  19. Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer. Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).
  20. Hall, R. A. A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).
  21. Short, D. B. An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton. J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).
  22. Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity. Cell. 103, 169-179 (2000).
  23. Sun, F. E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells. J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).
  24. Cheng, J. A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression. J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).
  25. Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor. The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).
  26. Lee, J. H. Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors. The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).
  27. Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway. Cell. 146, 746-760 (2011).
  28. Naren, A. P. Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function. Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).
  29. Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane. The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).
  30. Li, C., Naren, A. P. Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes. Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).
  31. Wu, Y. A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases. J. Biol. Chem. , (2011).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

CFTR PDZ GST His HEK 293 PDZ

相关文章