RNA干扰（RNAi）相较于基因敲除具有多种优势，已被广泛用作基因功能研究的工具。基于DNA载体的RNAi技术的发明使得长期且可诱导的基因沉默成为可能，同时也提高了基因沉默的可行性。 体内.
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摘要
摘要
RNA干扰（RNAi）通过特异性降解靶标mRNA来抑制基因表达。自从在基因沉默中发现双链小干扰RNA（siRNA）以来1，RNAi已成为基因功能研究中一种强大的研究工具。与基因敲除相比，RNAi介导的基因沉默具有多种优势，例如操作简便，并适用于大多数细胞系。多项研究已证实RNAi技术在癌症研究中的应用价值。特别是基于DNA载体的技术的发展，使得在U6或H1启动子驱动下产生小发夹RNA（shRNA）成为可能，从而实现长期且可诱导的基因沉默2,3。将其与基因工程改造的病毒载体（如慢病毒）联合使用，可显著提高shRNA的递送效率和/或在基因组DNA中的整合效率，以实现稳定的shRNA表达。
我们描述了一种利用基于DNA载体的RNA干扰技术来确定基因功能的详细实验步骤，包括表达shRNA的慢病毒载体的构建、慢病毒的制备与细胞感染，以及利用小鼠异种移植模型进行的功能研究。
已有多种策略被报道用于生成shRNA载体。本文所述的方案采用PCR扩增和三片段连接法，可直接高效地构建含有shRNA的慢病毒载体，且在shRNA编码序列旁不残留任何额外核苷酸。由于通过该策略构建的shRNA表达盒可被限制性内切酶切割，因此可轻松转移至带有不同荧光标记或抗生素抗性标记的其他载体中。大多数商用转染试剂均可用于慢病毒的生产。然而，本报告提供了一种经济的方法——使用磷酸钙沉淀法，在293T细胞中可实现超过90%的转染效率。与组成型shRNA表达载体相比，诱导型shRNA系统特别适用于敲低对细胞增殖至关重要的基因。我们通过Tet-On诱导型shRNA系统实现了对乳腺癌潜在癌基因Yin Yang 1（YY1）4,5的基因沉默，并展示了其对肿瘤形成的影响。使用慢病毒的研究需经研究人员所在机构生物安全委员会对生物安全方案进行审查和批准。使用动物模型的研究需经研究人员所在机构动物护理与使用委员会（ACUC）对动物实验方案进行审查和批准。
方案
1. 生成shRNA载体
- 根据已发表的标准6确定一个siRNA靶序列（20-23个核苷酸），或使用基于网络的算法服务器，例如Ambion和GenScript提供的“siRNA Target Finder”。
- 根据图1的设计以及表1中的示例序列合成寡核苷酸。以携带U6或H1启动子的质粒为模板，使用寡核苷酸P1和P2进行PCR扩增（94 °C变性30秒、60 °C退火30秒、72 °C延伸30秒，共30个循环）。使用PCR纯化柱纯化PCR产物。用BamHI和HindIII酶切该产物，并使用PCR纯化柱纯化酶切后的DNA。将寡核苷酸P3和P4（每种2.5 pmol/μl，共100 μl，溶于50 mM Tris•HCl，pH 8.0）煮沸5分钟使其退火，然后缓慢冷却至室温。用BamHI和EcoRI酶切慢病毒载体（如图2A所述），并进行凝胶纯化。
- 将BamHI/EcoRI酶切的载体、BamHI/HindIII酶切的PCR片段以及一对已退火的寡核苷酸（在两端形成HindIII和EcoRI位点）按1:10:10的摩尔比进行三片段连接（图1）。
- 将连接产物转化至高效感受态E. coli DH5α细胞中。使用位于载体中的寡核苷酸P5和位于H1或U6启动子中的P6筛选阳性克隆7。
- 从阳性菌落中提取质粒DNA，使用商业试剂盒进行纯化，并通过BamHI/EcoRI酶切及DNA琼脂糖凝胶电泳确认插入片段的存在。使用寡核苷酸P5对包含启动子和shRNA的区域进行测序。
- 使用质粒DNA中量或大量提取试剂盒（推荐无内毒素型）制备携带shRNA表达盒的慢病毒DNA。通过测定260 nm处的吸光度确定DNA浓度。通过260 nm/280 nm吸光度比值检测DNA纯度，确保其在1.8至2.0之间。使用琼脂糖凝胶电泳检测慢病毒质粒的完整性。用于转染的DNA应为超螺旋构型。
2. 慢病毒转染
注意事项：慢病毒载体源自人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）基因组，不具备复制能力。由于其能够感染分裂和非分裂细胞，已被广泛用于基因递送。然而，使用慢病毒的研究存在两个主要风险。（1）产生具有复制能力的慢病毒的潜在风险。若采用第三代慢病毒系统，该风险可大大降低。（2）致癌的潜在风险。若所携带的插入片段具有致癌性或抑制肿瘤抑制因子，则该风险可能加剧。涉及基于HIV的慢病毒的研究活动应遵循美国国立卫生研究院（NIH）发布的《慢病毒载体研究的生物安全考虑》（http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html），并须获得研究人员所在机构生物安全委员会的批准。通常情况下，若使用慢病毒载体，实验室需采取加强的生物安全二级（BSL-2）防护措施。
- 在10 cm培养皿中接种4 × 106个HEK 293T细胞，使用完全DMEM培养基（含10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM），于37 °C、5% CO2培养箱中培养过夜。将培养基更换为5 ml预热的Opti-MEM I减血清培养基（Invitrogen）。
- 配制溶液A：10 μg含shRNA的慢病毒载体、5 μg第三代表达系统慢病毒包装质粒（高纯度制备；三种包装质粒包括VSV-G：编码包膜蛋白，pRSV-Rev：编码rev，以及pMDLg/pRRE：编码gag/pol，均为慢病毒包装所必需）、36 μl 2 M CaCl2和300 μl无菌水。
- 配制溶液B：300 μl 2× HEPES缓冲盐溶液（281 mM NaCl，100 mM HEPES，1.5 mM Na2HPO4，用0.5 N NaOH调节pH至7.12，并通过0.22 μm滤器除菌）。
- 将溶液A缓慢滴加至溶液B中，同时用移液器向溶液B中通入气泡混匀。将混合液室温静置30分钟。
- 将混合后的A/B溶液缓慢滴加至步骤2.1中准备好的HEK 293T细胞培养皿中，于37 °C、5% CO2培养箱中孵育4–6小时。
- 更换为7 ml完全DMEM培养基。24小时后，再加入5 ml完全DMEM培养基。继续培养24小时后，收集含有慢病毒的培养上清。
- 在室温下以1,500 rpm离心10分钟。用0.45 μm滤器过滤上清液，然后将含有慢病毒的滤过液在4 °C下以25,000 rpm（相当于Beckman Ultracentrifuge XL-90配备SW28摆桶转子时的125,000 ×g）超速离心90分钟。将上清液倾倒至含5%次氯酸钠（终浓度）的容器中处理。
- 用0.5–1.0 ml预冷的PBS重悬慢病毒沉淀，分装至每管50–100 μl。于-80 °C保存。
- 慢病毒滴度可通过商业试剂盒（如Cell Biolabs, Inc.的QuickTiter慢病毒定量试剂盒）、实时PCR方法8，或通过荧光显微镜或流式细胞术检测共表达的荧光标记物来测定。通常，一个10 cm培养皿可产生约0.5–1.0×108感染单位（IU）。
3. 感染及感染细胞的鉴定
- 将待感染的细胞以30-40%的融合度（约5-8 × 105个细胞，具体数量取决于细胞大小）接种于6孔板中，每孔加入2 ml完全培养基。在37 °C、5% CO2的培养箱中培养过夜。
- 更换为含8 μg/ml聚凝胺（polybrene）（Sigma，货号 H9268）或5 μg/ml鱼精蛋白（protamine）（Sigma，货号 P4020）的新鲜培养基1 ml。
- 使用带有荧光标记的慢病毒，确定特定细胞系的合适感染复数（MOI）范围9。计算或通过实验确定感染该细胞系所需的慢病毒量。将慢病毒缓慢滴加至孔板中，并轻轻摇晃10秒。
- 将孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育6小时，随后更换为正常的完全培养基。
- 感染后至少两天，使用荧光显微镜检测表达荧光标记的慢病毒感染情况和/或向培养基中加入相应的抗生素，以筛选表达抗生素抗性基因的慢病毒载体。对于可诱导型载体（如Tet-On系统）（图2），需使用不含四环素的胎牛血清（FBS）配制培养基培养细胞。感染后2-3天传代细胞，并取部分细胞进行检测：分别在含或不含1.5 μg/ml多西环素（Dox）的培养基中培养至少2天，以验证可诱导的基因敲低效果。
- 在感染后至少2天、抗生素筛选后2天，或（对于Tet-On可诱导系统）在添加Dox后至少2天，通过Western blot、实时定量PCR或免疫染色检测基因敲低效果。
- 采用多种方法（如细胞增殖实验、软琼脂培养实验、迁移实验、侵袭实验及肿瘤形成实验）评估目标基因敲低对细胞恶性表型的影响。
4. 异种移植小鼠模型研究
- 使用70%乙醇清洁用于小鼠麻醉和注射的所有表面，以防止小鼠感染。在细胞接种前10分钟，于麻醉诱导舱中使用含2%异氟烷与氧气混合气体对裸鼠（NCI-Frederick）进行麻醉。通过鼻罩以1%异氟烷与氧气混合气体维持麻醉状态。此操作应在通风良好的房间内进行，并在诱导舱上连接异氟烷废气清除过滤器。
- 扩增携带shRNA的细胞。对于Tet-On诱导型载体，使用无四环素培养基。用胰蛋白酶消化细胞后，重悬于含50% Matrigel的完全培养基中。将裸鼠置于加热垫（30 °C）上，每只小鼠选择1-2个注射位点，皮下注射200 μl细胞悬液（细胞数量为1-10 × 106，根据细胞恶性程度调整）。皮下注射使用25.5号针头的注射器，原位注射则使用28-30号针头。
- 对于组成型shRNA载体，使用两组小鼠，分别注射表达靶基因shRNA和乱序shRNA的细胞。对于Tet-On诱导型shRNA载体，使用四组小鼠，分别注射携带靶基因shRNA和乱序shRNA的细胞，并给予普通饮水或含Dox（1.5 mg/ml）的饮水（2种shRNA × 2种处理 = 4组）。每周更换含Dox的饮水两次。
- 每周或每两周使用数显游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，并按公式V = 1/2（长度 × 宽度2）10计算肿瘤体积。确保肿瘤体积不超过本机构ACUC规定的限值（例如，不超过体重的10%）。若小鼠出现广泛溃疡或坏死、明显感染、无法控制的出血或终末期疾病症状，应按照本机构ACUC批准的方案实施安乐死。
- 对于表达生物发光标记物（如萤火虫荧光素酶）的接种肿瘤细胞，可监测其肿瘤生长与转移情况11。使用70%乙醇清洁用于小鼠麻醉和成像的所有表面，以防止感染。按照步骤4.1所述方法麻醉小鼠。腹腔注射荧光素（150 mg/kg）。将小鼠放入已消毒的商用成像系统成像室中，例如IVIS成像系统（Caliper Life Sciences, Inc.）。打开麻醉开关，通过1%异氟烷与氧气混合气体维持麻醉状态。此操作应在通风良好的房间内进行。
- 首先进行5分钟曝光拍摄第一张图像，并检查其信号强度。根据需要调整曝光时间，以获得最佳信噪比的图像。成像时间需根据经验确定，皮下肿瘤通常为1-5分钟。
- 当肿瘤体积达到约1,000 mm3或符合ACUC指南规定终点时，按照本机构ACUC批准的方案对小鼠实施安乐死。切除异种移植肿瘤，称重并拍照。将肿瘤样本用于不同研究，例如病理学分析以确定肿瘤细胞形态，以及Western blot和实时PCR研究以检测基因表达水平。
5. 代表性结果
本实验方案用于研究YY1基因敲低对表达萤光素酶的MDA-MB-231细胞（人乳腺腺癌细胞；Caliper Life Sciences）在无胸腺裸鼠中异种移植瘤形成的影响。针对人YY1基因的shRNA靶序列为“GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T”。同时设计了一段错配对照（cont）shRNA序列“GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T”，该序列与已知任何转录本均无显著同源性。用于构建四环素诱导型shRNA载体的寡核苷酸序列（以YY1为例）如表1所示。由此构建了两种慢病毒载体：pLu-Puro-Indu-YY1 shRNA 和 pLu-Puro-Indu-cont shRNA，并用于产生慢病毒。我们将这些慢病毒分别感染两株同时表达四环素调控因子（tetR）和萤光素酶的MDA-MB-231细胞克隆（克隆1和克隆3）。经嘌呤霉素筛选后获得多克隆细胞群体。图3A显示，经pLu-Puro-Indu-YY1 shRNA慢病毒感染的MDA-MB-231细胞在多西环素（Dox）诱导下实现了YY1基因的敲低。随后，我们分别使用携带可诱导YY1 shRNA和对照shRNA慢病毒的克隆3多克隆细胞进行实验，结果表明YY1的缺失降低了MDA-MB-231细胞的侵袭能力（图3B）。Western blot分析证实，在携带indu-YY1 shRNA的MDA-MB-231细胞中，Dox可诱导YY1表达沉默，而携带indu-cont shRNA的细胞则未出现该效应（图3C）。接着，我们将这些细胞用于异种移植小鼠模型研究。与对照组相比，移植了携带indu-YY1 shRNA的MDA-MB-231细胞并饮用含Dox水的小鼠，其肿瘤形成显著减少，这通过生物发光成像（图4A）和肿瘤重量测定（图4B）得以证实。通过Western blot分析进一步确认了这些异种移植瘤中YY1的表达沉默，结果如图4C所示。
图1. shRNA构建体的生成及shRNA转录的示意图。 显示引物P1至P6（示例序列见表1）。Pol III：RNA聚合酶III。(d)：酶切末端。示意图未按比例绘制。 点击此处查看大图。
图 2. （A）慢病毒载体和（B）用于基因沉默的 Tet-On 诱导型 H1 启动子作用机制的示意图。该慢病毒载体基于 pLL3.714 重构而成。H1-Pr：H1 启动子；Ubc-Pr：人泛素 C 启动子；Puro：嘌呤霉素；TRE：四环素反应元件；Dox：多西环素；TetR：四环素调控蛋白。5'LTR、3'SIN-LTR 和 WRE 是慢病毒载体的关键组分14。
图3. 多西环素诱导的YY1沉默及其对MDA-MB-231细胞侵袭性的影响。A. 在不含或多西环素存在的培养条件下，由表达TetR的克隆1和克隆3感染pLu-Puro-Indu-YY1 shRNA慢病毒后获得的两个多克隆细胞群体中的YY1水平。B. 携带可诱导shRNA的MDA-MB-231细胞的Boyden小室实验。（* P < 0.05，相较于其他三组）。C. 这四个细胞群体中YY1表达的代表性蛋白质印迹结果。
图4. 诱导YY1沉默对MDA-MB-231细胞异种移植瘤形成的影响。A. 细胞移植示意图（左）及接种细胞后4周时通过IVIS成像系统捕获的代表性生物发光图像（右）。B. 异种移植瘤在4周时的重量。* P ≤ 0.05。C. 在有或无Dox存在条件下，携带indu-YY1 shRNA的MDA-MB-231细胞异种移植组织中YY1和β-actin表达的Western印迹结果。顶部标签为各小鼠的名称。
| 寡核苷酸 | 序列（5' - 3'） | 使用与位置 |
| P1 (Tet-On H1) | cagt GGATCC CGA ACG CTG ACG TCA TCA ACC C | PCR；位于H1启动子的5'端 |
| P1 (U6) | cagt GGATCC GAC GCC GCC ATC TCT AGG | PCR；在U6启动子的5'-端 |
| P2 （用于带有 Tet-On H1 的 YY1） | cagc AAGCTT GAA atc tgc acc tgc ttc tgc tcc c GGG ATC TCT ATC ACT GAT AGG GAA C | PCR；位于 Tet-On 诱导型 H1 启动子的 3'-端 |
| P2 （用于YY1与U6） | cagc AAGCTT GAA atc tgc acc tgc ttc tgc tcc c aaa caa ggc ttt tct cca agg gat a | PCR；位于U6启动子的3'端 |
| P3 （针对 YY1） | agc tt atc tgc acc tgc ttc tgc tcc c ttttt g | 与 P4 退火 |
| P4 （针对 YY1） | aattc aaaaa ggg agc aga agc agg tgc aga t a | 与 P3 退火 |
| P5 （用于 pLL3.7） | ggg tac agt gca ggg gaa aga ata g | 用于PCR筛选，与P6联用 |
| P6 （用于 Tet-On H1） | GAT TTC CCA GAA CAC ATA GCG AC | 用于PCR筛选，与P5联用 |
| P6 （用于U6） | AGG GTG AGT TTC CTT TTG TGC TG | 用于PCR筛选，与P5联用 |
表1. 用于构建shRNA载体的合成寡核苷酸。 提供了小鼠U6启动子和Tet-On诱导型人H1启动子的P1和P6序列。以人YY1为例，其shRNA靶向序列为GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T。其中特异性针对YY1的序列已标出。针对两个不同启动子，分别设计了两条YY1的P2序列。组成型U6/YY1 shRNA载体此前已有描述15，而本实验方案中使用的是Tet-On H1/YY1系统。P5为载体特异性序列，此处列出的是pLL3.714载体的对应序列。限制性内切酶识别序列以下划线标出，PCR扩增过程中与启动子配对结合的序列则以斜体表示。
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讨论
本方案描述了一种利用shRNA敲低基因并通过对肿瘤细胞在体内的生长进行生物发光成像来可视化其生物学效应的方法。in vivo。shRNA的靶位点不应包含用于亚克隆的三个限制性酶切位点（BamHI、HindIII和EcoRI）。在极少数情况下，若靶位点包含上述任一酶切位点，可选用其他限制性内切酶替代，以构建相应的载体。
本方案中有几个关键步骤可加快shRNA慢病毒载体的构建。首先，含有U6或H1启动子的PCR模板质粒，其抗生素抗性基因（如卡那霉素）可能与慢病毒载体（通常为氨苄青霉素）不同，这有助于降低由模板质粒引起的转化背景。其次，必须使用具有高效转化能力的感受态E. coli细胞。可采用基于钾离子和锰离子的方法制备转化效率极高的感受态E. coli细胞12。第三，可引入筛选标记以促进三片段亚克隆。例如，可对慢病毒载体进行改造，使其包含一个β-半乳糖苷酶（LacZ）表达盒，该表达盒将被PCR产物片段以及退火后的P3/P4寡核苷酸插入所替换。在此情况下，当存在插入片段的重组质粒在X-gal（5-溴-4-氯-3-...
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致谢
本工作部分由美国癌症协会的研究学者资助（116403-RSG-09-082-01-MGO）以及维克森林大学健康科学的内部资金支持，资助对象为 GS。DBS 由美国国家癌症研究所培训资助 5T32CA079448 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 除了用于RNA和蛋白质分析及细胞培养的常规实验设备外，本实验方案还需以下材料和试剂。 | |||
| 适用于生物安全二级防护的生物安全柜 | |||
| PCR扩增仪 | |||
| 超速离心机 | |||
| 带异氟烷废气清除系统的麻醉诱导舱 | |||
| 数字游标卡尺 | |||
| IVIS 成像系统 | |||
| 高感受态 DH5a 大肠杆菌 | |||
| EcoRI, BamHI, &和 HindIII 限制性内切酶 | |||
| T4 DNA连接酶 | |||
| 第三代慢病毒包装质粒 VSV-G、pRSV-Rev 和 pMDLg/pRRE | |||
| <强>材料清单 |
参考文献
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