从神经管中分离胚胎神经嵴有助于利用 体外 研究神经嵴细胞迁移、自我更新及多能性的方法
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摘要
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胚胎神经嵴（NC）是一类多能祖细胞群体，起源于神经管背侧，经历上皮-间质转化（EMT）后在胚胎内广泛迁移，最终分化为多种细胞类型 1-3NC还具有独特的能力，可影响靶器官的分化与成熟4-6当移出时 体外神经嵴前体细胞进行自我更新，迁移并分化为多种组织类型，包括神经元、胶质细胞、平滑肌细胞、软骨和骨。
神经嵴多能性最初是从禽类神经管的外植体中描述的7-9。体外分离神经嵴细胞有助于研究神经嵴的动态过程，包括增殖、迁移和多能性。在禽类和大鼠系统中的进一步研究表明，将外植的神经嵴细胞重新移植回胚胎后，这些细胞仍能保持其神经嵴潜能10-13。由于这些固有的细胞特性在外植的神经嵴前体细胞中得以保留，神经管外植体实验为在体外研究神经嵴提供了一个理想的选择。
为了更深入地理解哺乳动物神经嵴（NC），研究人员已采用多种方法来分离神经嵴细胞群体。可以在胚胎和成体的迁移后部位培养出神经嵴来源的前体细胞，以研究迁移后神经嵴前体细胞的动态特性11,14-20。然而，在神经嵴前体细胞从神经管迁移出来时对其进行分离，能够更理想地保留神经嵴细胞的发育潜能和迁移特性13,21,22。一些实验方案采用荧光激活细胞分选（FACS）技术来富集特定类型的神经嵴前体细胞群体11,13,14,17。但是，当起始材料为早期胚胎时，通过FACS难以获得足够用于分析的细胞数量，这使得从单个胚胎中分离早期神经嵴细胞群体变得复杂。本文中，我们描述了一种不依赖FACS的方法，该方法基于Wnt1-Cre激活的谱系报告系统，可获得纯度约为96%的神经嵴细胞群体23。
本文所述方法改编自优化后的大鼠神经嵴细胞培养方案11,13。与以往方法相比，本方案的优势在于：1）细胞无需在饲养层上培养；2）无需使用荧光激活细胞分选（FACS）即可获得相对纯的神经嵴细胞群体；3）可分离出迁移前的神经嵴细胞；4）实验结果易于量化。此外，该方案可用于从任何基因突变小鼠模型中分离神经嵴细胞，有助于研究不同遗传操作条件下神经嵴细胞的特性。该方法的局限性在于，神经嵴细胞被脱离了胚胎环境，而胚胎环境已被证实会影响神经嵴细胞的存活、迁移和分化2,24-28。
方案
1. 准备培养皿
- 始终使用无菌操作技术。
- 将100 μL人血浆纤连蛋白（FN）储备液用杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS）稀释至终体积3.3 mL，配制纤连蛋白（FN）溶液。终浓度为30 μg/mL，可在4 °C保存1周。
- 用FN溶液覆盖无菌组织培养四孔板中每个孔的底部，静置15分钟，确保整个表面均被覆盖。在此期间配制培养基（见步骤2和3）。
- 移除FN溶液，让培养板自然干燥。用500 μL DMEM轻柔冲洗各孔，移除DMEM后，每孔加入500 μL自我更新（SR）培养基（见下文）。置于含5% CO2的湿润化培养箱中，37 °C孵育。此步骤应在解剖前约一小时完成，以确保培养板在使用前完全干燥。
2. 准备SR培养基
- 为了培养十只胚胎（根据小鼠品系不同，约相当于一窝）的迷走神经嵴和躯干神经嵴细胞，请准备 25 mL SR 培养基。将 12.5 mL 低糖 DMEM、7.5 mL Neurobasal 培养基、25 μL 视黄酸（终浓度 117 μM）和 25 μL 2-巯基乙醇（终浓度 50 mM）混合。充分混匀。
- 加入 3.75 mL 鸡胚提取物、250 μL N2 盐补充剂、500 μL B27 补充剂以及 250 μL 青霉素-链霉素（终浓度 1%）。用 0.22 μm 滤器过滤培养基。
- 加入 10 μL 无菌 IGF1（终浓度 20 μg/mL）和 20 μL 无菌 bFGF（终浓度 20 μg/mL）。通过倒置混匀。4 °C 保存。
3. 准备洗涤液
- 准备约10个胚胎所需的50 mL洗涤培养基。将50 mg BSA与35 mL低糖DMEM、15 mL Neurobasal培养基以及500 μL青霉素-链霉素（终浓度1%）混合。用0.22 μm滤器进行无菌过滤。
4. 准备胶原酶/分散酶
- 向 5 mL dPBS 中加入 50 μL 的 100 mg/mL 胶原酶/分散酶溶液，充分混匀。
- 使用 0.2 μm 滤器进行注射器过滤，并将 1.5 mL 消化液分装至十二孔板中的三个孔中。在其余孔中各加入约 1 mL 洗涤液。将整块培养板置于冰上保存，待解剖组织准备好后用于消化。
- 使用无菌剃刀片剪去 p20 和 p1000 移液器滤芯吸头的尖端，剪切位置位于吸头斜面边缘下方。剪去尖端的 p1000 吸头用于转移完整胚胎，而剪去尖端的 p20 吸头用于转移分离的组织小块。
5. 分离9.5天胚胎的迷走神经和躯干神经管
- 对于定时妊娠实验，观察到阴道栓的当天中午记为0.5天（dpc）；于9.5 dpc处死动物并取出子宫。
- 从子宫中去除蜕膜，并轻轻将胚胎从蜕膜中分离。熟练掌握本方案后，可一次性在无菌 dPBS 中分离 3–4 个 9.5 dpc 胚胎。操作过程中须采用无菌技术及无菌解剖器械。器械可通过高压灭菌、干热灭菌或乙醇孵育方式进行灭菌。
- 对于前部迷走神经嵴：使用胰岛素针头，在耳囊原基中部横切神经管，再于第4体节后缘处再次横切。th 体节。修剪神经管腹侧的组织，以去除咽弓和心脏。
- 对于躯干神经嵴：使用胰岛素针头，切除体节16-22之间（或若胚胎发育早于22个体节阶段，则切除最后一个体节）的神经管部分。
- 保留卵黄囊及任何残留的胚胎组织用于基因分型。
6. 去除外胚层非神经组织和中胚层
- 将含有体节的神经管放入胶原酶/分散酶中，在室温下孵育 10 分钟。立即用洗涤液清洗组织。
- 将组织转移回无菌 dPBS 中。使用无菌胰岛素针头，轻轻去除组织中的非神经外胚层，并将体节与神经管分离。可通过用剪去尖端的 p20 枪头轻轻吹打，去除体节组织中残留的中胚层部分。注意避免损伤神经管。吹打过程中需密切观察。
- 将分离得到的神经管在洗涤液中再进行第二和第三次洗涤，每次 30 秒。
- 用 SR 培养基洗涤一次，然后将分离的神经管置于先前准备好的纤连蛋白（FN）包被孔板的中央（步骤 1.3）。在低氧培养箱中放置一皿无菌水以保持湿度。将培养皿放入低氧培养箱中，并用混合气体冲洗培养箱至 3% O2（使用含有 1% O2、6% CO2、93% N2 的气瓶）。
- 操作培养箱时务必格外小心，确保组织外植块不受扰动，并保持在孔的中央位置。
- 在 37 °C 下孵育。步骤 5–6 的概要如 图 1 所示。
7. 神经管的去除
- 培养 24 小时后，使用无菌胰岛素针轻轻剥离神经管边缘与迁移细胞之间的连接，移除神经管。使用无菌剪切的 p20 枪头（如步骤 6.2 所述）将神经管从培养基中取出并弃去，随后更换为新鲜的 SR 培养基（图 2）。此操作在倒置显微镜下进行最为方便。
8. 代表性结果
在37 °C、低氧条件下培养24小时后，神经嵴细胞已从神经管迁移而出，形成近乎纯一的细胞群体（图3a）。有时，培养条件不够理想会导致细胞迁移不充分。例如，24小时后神经管可能发生卷曲，导致神经嵴细胞无法从神经管迁移出去（图3b）。偶尔，神经管也无法贴附于纤维连接蛋白包被的培养板上。
根据我们的经验，神经嵴细胞迁移不佳或神经管附着问题可能分别受到常氧条件或纤连蛋白浓度的不利影响。胶原酶/分散酶的酶活性因批次略有差异，因此消化时间必须相应调整，但切勿将组织消化超过十五分钟。使用胶原酶/分散酶对含有神经管的组织过度消化，也会导致生长不良。若在胶原酶/分散酶孵育后体节组织仍难以从神经管上分离，可将神经管孵育时间延长至超过十分钟。有时神经管无法附着于基质，若出现此情况，请重新检查纤连蛋白浓度及低氧条件。
虽然常氧条件可用于培养野生型神经嵴细胞（NC），但低氧条件更能模拟体内环境29,30。根据我们的经验，在培养突变型神经嵴细胞时，低氧条件变得尤为关键。例如，当Foxd3突变型神经嵴细胞在常氧条件下培养时，其躯干神经嵴细胞的迁移出脂数量显著少于对照组。而当外植体在低氧条件下培养时，这种迁移规模的差异则消失（图4）。此外，当野生型神经管外植体在常氧条件下培养时，caspase阳性细胞的数量高于在低氧条件下培养的相似外植体（数据未显示）。通过在低氧条件下维持所有神经嵴细胞的培养，可更方便地比较对照组与突变组培养体系中细胞动态的差异。
图 1. 神经嵴细胞分离的整体示意图。A) 从胚胎中解剖出目标区域。B) 用胶原酶/中性蛋白酶消化神经管十分钟（不得超过十五分钟）。C) 用洗涤液清洗。D) 解剖去除非神经外胚层和中胚层组织。E-F) 用洗涤液清洗两次。G) 接种于自我更新培养基中。在 37 °C、3% O2 的低氧条件下培养。
图2. 从外植体中逐步去除神经管。必须在24-48小时后去除神经管，以防止非神经嵴细胞的污染。A) 注意观察神经管与神经嵴细胞迁出区域之间的边界（实线）。B) 使用胰岛素针沿神经管边缘进行切割。C) 弃去神经管，并更换为新鲜的自我更新培养基。虚线表示细胞迁出的范围。缩写：NT，神经管。
图3. 典型结果示例。A) 在低氧条件下，神经嵴组织外植体在自我更新培养基中孵育24小时后的典型外延生长（虚线表示外延生长范围）。B) 神经嵴外植体在培养48小时后的放大图像。C) 生长效果较差的培养样本，外延生长产量较低。A和C在相同条件下培养。图像展示了培养体系中生长强度的自然差异，这种差异可能受到神经管分离效率、纤连蛋白（FN）浓度、低氧条件以及胶原酶/分散酶消化时间的影响。
图4. 体外培养条件下神经嵴组织块在正常氧与低氧环境中的分析。对照（野生型）神经嵴细胞在正常氧培养条件下培养48小时后从神经管组织块迁移而出。相比之下，Foxd3突变型神经嵴细胞在正常氧条件下的细胞迁移显著减少（红色轮廓标记神经嵴迁移区域的边缘）。当相似的组织块在低氧条件下培养时，Foxd3突变型神经嵴组织块的生长情况与对照组相当，从而允许进行后续分析。需注意，该行为与Foxd3突变型神经嵴在体内行为高度一致。
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讨论
应仔细关注胚胎的发育阶段，以确保本方法的成功。对早期小鼠胚胎的体节进行计数，对于同窝胚胎间的发育阶段匹配以及确定神经管分离的正确区域均至关重要。胚胎间体节数目相差一至两个，在发育时间上属于合理范围，具体取决于实验所需的精度。在9至9.5天的胚胎中，体节数目介于17到25个之间。若胚胎体节数超过25个，则神经嵴（NC）的发育进程已更进一步，其在体外培养中的迁移出芽能力将减弱。根据体节数目对胚胎进行分期，有助于提高实验的精确性，因为胚胎的发育阶段（从而神经嵴的发育状态）可能影响实验结果。在9.5天的胚胎中，迷走神经嵴从背侧神经管以明确的前后界限迁移：从前耳囊中点至第7个体节。类似地，躯干神经嵴从第8至第24体节水平的神经管迁移。为了如本方案所述分离不同群体的神经嵴前体细胞，需分别从上述区域中获取特定的亚区。所用神经管区域的选择取决于实验设计以及所研究的神经嵴前后位置。
上述培养条件，包括培养基和孵育条件，是专门为培养小鼠神经嵴细胞（NC）而优化的。类似的SR培养基最初用于大鼠NC的培养11。在我们的实验中，该大鼠培养基添加Neurobasal培养基后，可有效促进小...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
我们感谢Marc Wozniak在视频制作方面的协助。我们还要感谢德克萨斯大学西南医学中心的Sean Morrison提供了培养大鼠神经嵴细胞的原始实验方案。本研究工作得到了范德堡大学医学中心学术项目支持，以及美国国立卫生研究院（NIH）基金（HD36720 和 HD036720-11S109）和美国心脏协会（AHA 11GRNT7690040）对PAL的资助，NAM获得了美国心脏协会（0615209B）和美国国立卫生研究院（NS065604）的博士前奖学金，ERP则得到了美国国立卫生研究院T32HD007502培训基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM（低糖） | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| Neurobasal 培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 21103 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912-10G | |
| dPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | 以 50 μg/mL 分装保存 |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | 以 25 μg/mL 分装保存 |
| 纤连蛋白（Fibronectin） | GIBCO, by Life Technologies | 33016-015 | 以 1 mg/mL 分装保存 |
| 维甲酸（Retinoic Acid） | Sigma-Aldrich | R2625 | 用乙醇溶解后，配制成 35 μg/mL 分装液 |
| 2-巯基乙醇（2-mercapt–thanol） | Sigma-Aldrich | D-5637 | |
| N2 添加剂 | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 添加剂 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Steriflip 0.22 μm 滤器 | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 青霉素/链霉素（Penicillin/streptomycin） | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 μm 滤器 | Corning | 431219 | |
| 注射器（用于过滤） | BD Biosciences | 301604 | |
| 四孔板 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| 胶原酶/分散酶（Collagenase/Dispase） | Roche Group | 269 638 | 活性因批次而异，以 100 mg/mL 分装保存 |
| 胰岛素注射针头（29 ½ 号） | BD Biosciences | 309306 | |
| 低氧培养舱（Hypoxia Chamber） | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| 氧气分析仪（Oxygen Analyzer） | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| 5 号镊子（Forceps #5） | Fine Science Tools | 用于取出子宫和蜕膜 |
参考文献
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