从神经管中分离胚胎神经嵴有助于利用 体外 研究神经嵴细胞迁移、自我更新及多能性的方法
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摘要
摘要
胚胎神经嵴（NC）是一类多能祖细胞群体，起源于神经管背侧，经历上皮-间质转化（EMT）后在胚胎内广泛迁移，最终分化为多种细胞类型 1-3NC还具有独特的能力，可影响靶器官的分化与成熟4-6当移出时 体外神经嵴前体细胞进行自我更新，迁移并分化为多种组织类型，包括神经元、胶质细胞、平滑肌细胞、软骨和骨。
神经嵴多能性最初是从禽类神经管的外植体中描述的7-9。体外分离神经嵴细胞有助于研究神经嵴的动态过程，包括增殖、迁移和多能性。在禽类和大鼠系统中的进一步研究表明，将外植的神经嵴细胞重新移植回胚胎后，这些细胞仍能保持其神经嵴潜能10-13。由于这些固有的细胞特性在外植的神经嵴前体细胞中得以保留，神经管外植体实验为在体外研究神经嵴提供了一个理想的选择。
为了更深入地理解哺乳动物神经嵴（NC），研究人员已采用多种方法来分离神经嵴细胞群体。可以在胚胎和成体的迁移后部位培养出神经嵴来源的前体细胞，以研究迁移后神经嵴前体细胞的动态特性11,14-20。然而，在神经嵴前体细胞从神经管迁移出来时对其进行分离，能够更理想地保留神经嵴细胞的发育潜能和迁移特性13,21,22。一些实验方案采用荧光激活细胞分选（FACS）技术来富集特定类型的神经嵴前体细胞群体11,13,14,17。但是，当起始材料为早期胚胎时，通过FACS难以获得足够用于分析的细胞数量，这使得从单个胚胎中分离早期神经嵴细胞群体变得复杂。本文中，我们描述了一种不依赖FACS的方法，该方法基于Wnt1-Cre激活的谱系报告系统，可获得纯度约为96%的神经嵴细胞群体23。
本文所述方法改编自优化后的大鼠神经嵴细胞培养方案11,13。与以往方法相比，本方案的优势在于：1）细胞无需在饲养层上培养；2）无需使用荧光激活细胞分选（FACS）即可获得相对纯的神经嵴细胞群体；3）可分离出迁移前的神经嵴细胞；4）实验结果易于量化。此外，该方案可用于从任何基因突变小鼠模型中分离神经嵴细胞，有助于研究不同遗传操作条件下神经嵴细胞的特性。该方法的局限性在于，神经嵴细胞被脱离了胚胎环境，而胚胎环境已被证实会影响神经嵴细胞的存活、迁移和分化2,24-28。
方案
1. 准备培养皿
- 始终使用无菌操作技术。
- 将100 μL人血浆纤连蛋白（FN）储备液用杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS）稀释至终体积3.3 mL，配制纤连蛋白（FN）溶液。终浓度为30 μg/mL，可在4 °C保存1周。
- 用FN溶液覆盖无菌组织培养四孔板中每个孔的底部，静置15分钟，确保整个表面均被覆盖。在此期间配制培养基（见步骤2和3）。
- 移除FN溶液，让培养板自然干燥。用500 μL DMEM轻柔冲洗各孔，移除DMEM后，每孔加入500 μL自我更新（SR）培养基（见下文）。置于含5% CO2的湿润化培养箱中，37 °C孵育。此步骤应在解剖前约一小时完成，以确保培养板在使用前完全干燥。
2. 准备SR培养基
- 为了培养十只胚胎（根据小鼠品系不同，约相当于一窝）的迷走神经嵴和躯干神经嵴细胞，请准备 25 mL SR 培养基。将 12.5 mL 低糖 DMEM、7.5 mL Neurobasal 培养基、25 μL 视黄酸（终浓度 117 μM）和 25 μL 2-巯基乙醇（终浓度 50 mM）混合。充分混匀。
- 加入 3.75 mL 鸡胚提取物、250 μL N2 盐补充剂、500 μL B27 补充剂以及 250 μL 青霉素-链霉素（终浓度 1%）。用 ....
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讨论
应仔细关注胚胎的发育阶段，以确保本方法的成功。对早期小鼠胚胎的体节进行计数，对于同窝胚胎间的发育阶段匹配以及确定神经管分离的正确区域均至关重要。胚胎间体节数目相差一至两个，在发育时间上属于合理范围，具体取决于实验所需的精度。在9至9.5天的胚胎中，体节数目介于17到25个之间。若胚胎体节数超过25个，则神经嵴（NC）的发育进程已更进一步，其在体外培养中的迁移出芽能力将减弱。根据体节数目对胚胎进行分期，有助于提高实验的精确性，因为胚胎的发育阶段（从而神经嵴的发育状态）可能影响实验结果。在9.5天的胚胎中，迷走神经嵴从背侧神经管以明确的前后界限迁移：从前耳囊中点至第7个体节。类似地，躯干神经嵴从第8至第24体节水平的神经管迁移。为了如本方案所述分离不同群体的神经嵴前体细胞，需分别从上述区域中获取特定的亚区。所用神经管区域的选择取决于实验设计以及所研究的神经嵴前后位置。
上述培养条件，包括培养基和孵育条件，是专门为培养小鼠神经嵴细胞（NC）而优化的。类似的SR培养基最初用于大鼠NC的培养11。在我们的实验中，该大鼠培养基添加Neurobasal培养基后，可有效促进小.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
我们感谢Marc Wozniak在视频制作方面的协助。我们还要感谢德克萨斯大学西南医学中心的Sean Morrison提供了培养大鼠神经嵴细胞的原始实验方案。本研究工作得到了范德堡大学医学中心学术项目支持，以及美国国立卫生研究院（NIH）基金（HD36720 和 HD036720-11S109）和美国心脏协会（AHA 11GRNT7690040）对PAL的资助，NAM获得了美国心脏协会（0615209B）和美国国立卫生研究院（NS065604）的博士前奖学金，ERP则得到了美国国立卫生研究院T32HD007502培训基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM（低糖） | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| Neurobasal 培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 21103 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912-10G | |
| dPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | 以 50 μg/mL 分装保存 |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | 以 25 μg/mL 分装保存 |
| 纤连蛋白（Fibronectin） | GIBCO, by Life Technologies | 33016-015 | 以 1 mg/mL 分装保存 |
| 维甲酸（Retinoic Acid） | Sigma-Aldrich | R2625 | 用乙醇溶解后，配制成 35 μg/mL 分装液 |
| 2-巯基乙醇（2-mercapt–thanol） | Sigma-Aldrich | D-5637 | |
| N2 添加剂 | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 添加剂 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Steriflip 0.22 μm 滤器 | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 青霉素/链霉素（Penicillin/streptomycin） | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 μm 滤器 | Corning | 431219 | |
| 注射器（用于过滤） | BD Biosciences | 301604 | |
| 四孔板 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| 胶原酶/分散酶（Collagenase/Dispase） | Roche Group | 269 638 | 活性因批次而异，以 100 mg/mL 分装保存 |
| 胰岛素注射针头（29 ½ 号） | BD Biosciences | 309306 | |
| 低氧培养舱（Hypoxia Chamber） | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| 氧气分析仪（Oxygen Analyzer） | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| 5 号镊子（Forceps #5） | Fine Science Tools | 用于取出子宫和蜕膜 |
参考文献
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
- Saint-Jeannet, J. -P.
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重印与许可
