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用于基因表达机制功能检测的小规模核提取物

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DOI：

10.3791/4140

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2012年6月27日

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Harvard Medical School

本文内容

摘要

本文介绍了一种制备稳定且小规模 HeLa 细胞核提取物的实验方案。该方案适用于需要使用少量细胞群体的实验，例如经药物或 RNA 干扰处理的细胞。此方法可广泛应用于多种基因表达检测以及其他细胞类型，包括患者来源的细胞。

摘要

利用基因表达研究已取得巨大进展 体外 系统。对于大多数研究，功能测定通常使用从悬浮培养的10-50升或更多体积的细胞中大量制备的提取物进行。然而，这种大规模制备方法难以快速测试 体外 由多种因素引起的效果 体内 细胞处理或条件。本文视频展示了一种制备功能性小规模核提取物的方法，以HeLa细胞为例。该方法仅需使用三块150 mm培养板的贴壁单层细胞即可完成。为说明小规模提取物的效率，我们展示了其在偶联的RNA聚合酶II转录/剪接反应中活性与大规模核提取物相当。为验证该提取方案的实用性，我们展示了用剪接抑制剂药物E7107处理的HeLa细胞所制备的提取物中剪接反应被完全抑制。该小规模提取方案应可广泛适用于任何可通过核提取物研究的生物学过程或细胞类型 体外 使用细胞提取物。这些包括仅能获得有限数量的患者细胞，或暴露于多种试剂（如药物、DNA损伤剂、RNA干扰或转染处理）的细胞，这些情况均需使用少量细胞群体。此外，某些应用中使用少量新鲜培养的细胞更为方便或必要。

方案

1. 核提取用 HeLa 细胞的培养

  1. 将HeLa细胞接种于三块150 mm培养皿中，使用添加10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，在37 °C、5% CO2的培养箱中培养，直至细胞融合度达到90%。

提示：从融合的培养板中以1:10比例传代细胞，并在传代后第3天收集细胞。

提示：如果三个培养皿中的细胞数量不足（例如，细胞融合度低于90%），可额外培养一个培养皿以备不时之需。

2. 准备并冷却核提取溶液

  1. 按照表2中所述配制新鲜溶液。
  2. 将10 ml低渗缓冲液分装至15 ml Falcon管中，将1 ml高盐缓冲液和1 ml低盐缓冲液分别分装至1.5 ml Eppendorf管中。将缓冲液置于冰上预冷。在使用前立即向每种缓冲液中加入适量体积的PMSF和DTT（见表1）。

3. 收集 HeLa 细胞用于核提取

  1. 吸去细胞培养基，每孔加入13 ml室温的1× PBS洗涤细胞一次。
  2. 吸去PBS洗涤液。

提示：先吸出大部分 PBS，然后将培养板侧放，等待数秒，再吸出剩余液体。

  1. 使用细胞刮刀将细胞刮至培养板底部边缘，然后转移至一个离心管中。避免产生气泡。刮取的3个培养板的细胞应可放入一个1.5 ml离心管中。

提示：使用Eppendorf管更易于估算细胞体积。放大实验规模时，请使用Falcon管。

  1. 在微型离心机中，于 4 °C、100 × g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。

4. 用低渗缓冲液使 HeLa 细胞膨胀

  1. 小心吸除细胞沉淀中的 PBS，并通过观察离心管上的刻度估计压积细胞体积（PCV）。三块汇合的 HeLa 细胞培养板可获得约 500 μl 的 PCV。
  2. 向细胞沉淀中加入两倍 PCV 体积的低渗缓冲液。轻轻振荡以重悬细胞。如有必要，使用 P1000 移液器通过轻柔吹打辅助重悬细胞。
  3. 在 4 °C 下，以 100 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。*此时细胞已开始肿胀，细胞体积应达到约 750 μl–1000 μl。
  4. 小心吸除低渗缓冲液，并加入新的低渗缓冲液至终体积为 1.5 ml。重悬细胞。
  5. 将重悬的肿胀细胞置于冰上孵育 10 分钟。

5. 使用Dounce匀浆器裂解细胞

  1. 使用低渗缓冲液冲洗Dounce匀浆器，然后将其置于冰上预冷。用精密擦拭纸（如Kimwipe）将研杵擦干。用1000 μl加长移液器吸头吸除Dounce匀浆器中残留的缓冲液。
  2. 将膨胀的细胞转移至Dounce匀浆器中。缓慢上下移动Dounce的紧密研杵5次以裂解细胞，注意避免产生气泡。
  3. 取5 μl来自Dounce匀浆器的细胞样品进行细胞裂解检测。将样品加入Eppendorf管中，加入等体积的台盼蓝染液。将混合液滴加至载玻片上，用光学显微镜观察细胞。裂解细胞的细胞核呈蓝色。理想裂解率约为90%。

提示——使用Dounce匀浆器研磨细胞的次数取决于Dounce的松紧程度。首次进行本实验时，应在每次研磨后执行步骤5.3，以确定所需的研磨次数。切勿过度研磨，过度研磨会破坏细胞核。

  1. 将裂解后的细胞转移至预冷的离心管中，在4 °C下以1500 × g离心5分钟。沉淀物含有细胞核。小心地将上清液转移至新管中，避免扰动细胞核。上清液含有细胞质。

提示：细胞质可直接使用，或通过与制备粗提物相同的高速离心进一步处理成S100（参见1了解如何从粗提物制备具有活性的S100）。

6. 用盐提取细胞核

  1. 通过观察管壁上的刻度估算核沉淀体积（PNV）。通常500 μl的PCV可得到400 μl的PNV。
  2. 将低盐缓冲液按½ × PNV的体积加入细胞核中，将微量移液器吸头插入管底，缓慢将缓冲液注入细胞核沉淀中，同时轻轻混匀。切勿反复吹打。轻轻弹击管壁，确保沉淀完全重悬于低盐缓冲液中后再进行后续操作。
  3. 加入½ × PNV体积的高盐缓冲液，通过倒置试管快速混匀1次。切勿振荡。在4 °C下旋转孵育30分钟。

提示：将细胞核置于高盐缓冲液中时应轻柔操作，以避免细胞核裂解。

  1. 在4 °C下，以18,000 × g离心15分钟。上清液即为高盐核提取物（HS-NE）。通常三板细胞可获得500–600 μl HS-NE。

7. 浓缩并透析核提取物

  1. 将500 μl HS-NE转移至预冷的微型离心浓缩管（Amicon）中，在4 °C下以14000 × g离心50分钟。将微型离心浓缩管（Amicon）倒置后放入新的Eppendorf管中，在4 °C下以1000 × g离心2分钟以回收HS-NE。HS-NE将被浓缩至约115 μl。
  2. 使用P200移液器将45 μl HS-NE分装至微型透析Slide-A-Lyzer中，将其置于500 ml预冷的透析缓冲液中。确保Slide-A-Lyzer底部与浮架底部对齐。在4 °C下搅拌透析1–2小时。透析后，核提取物（NE）将呈现浑浊状态。

提示：透析后若观察到浑浊沉淀，不要通过离心去除，因为离心会降低提取物的活性。

  1. 提取的核提取物可立即使用，也可进行分装。分装后应使用液氮速冻，并于 -80 °C 保存。核提取物在此条件下可保存，并可经历至少两次冻融循环而不丧失活性。

8. 代表性结果

最近，高效地 体外 开发了将RNAP II转录与剪接相偶联的系统2-5这些系统采用大量培养的HeLa细胞，因此难以快速检测特定细胞处理对多个样本的影响。基于这一需求以及小规模提取方案的通用性（见讨论部分），我们建立了一种可靠的微型核提取方法。图中展示了小规模核提取物与大量核提取物在RNAP II转录/剪接反应中的代表性数据对比 图2. 一种CMV-DNA构建体，包含CMV启动子并编码标准剪接底物（Ftz3, 图2A) 用于分析。当该构建体在大量（泳道 1-3）或小规模（泳道 4-6）提取物中孵育时，在 5 分钟时间点合成了相似水平的新生前体 mRNA（图2，第1和第4泳道）。加入α-鹅膏蕈碱以阻断进一步转录后，两类提取物中剪接中间产物和剪接完成产物随时间积累的动力学过程相似图2，泳道2、3、5、6）。这些代表性结果表明，偶联的RNAP II转录/剪接系统在大量和小规模核提取物中的效率相似。

为了验证小规模提取方法的实用性，制备了经剪接抑制剂 E7107 或阴性对照化合物 pladienolide F6,7 处理的 HeLa 细胞的提取物，并进行了偶联的 RNAP II 转录/剪接实验。如图3所示，在来自 pladienolide F 和 E7107 处理细胞的提取物中，RNAP II 均能有效进行转录（10 分钟时间点）。相比之下，来自 pladienolide F 处理细胞的提取物中剪接正常进行，而来自 E7107 处理细胞的提取物中剪接则完全被抑制（图3，20–60 分钟时间点）。这些数据证明了使用小规模核提取物在小规模条件下对细胞进行特殊处理的可行性。

小规模核提取流程图。步骤：细胞收获、离心、提取、透析、RNA分析结果。
图1. 小规模提取方案示意图。 步骤P1：细胞以单层形式培养，使用细胞刮刀从培养板上收获，并通过加入低渗缓冲液使其膨胀。步骤P2：使用Dounce匀浆器裂解细胞，并通过离心沉淀细胞核。步骤P3：将细胞核与细胞质分离，随后进行盐提取。步骤P4：对核提取物进行浓缩和透析。步骤P5：获得结果显示核提取物具有功能活性（详见图2以获取更多细节）。

RNA电泳结果；前体mRNA剪接分析；大量与小规模，时间点，条带。

图2. 小规模核提取物在偶联的RNAP II转录/剪接实验中具有较强活性。 A. 用于偶联RNAP II转录/剪接的CMV-Ftz DNA模板示意图。图中显示了CMV启动子以及外显子和内含子的大小。B. 使用大量核提取物或小规模核提取物进行偶联RNAP II转录/剪接实验的比较。在转录5分钟后加入α-鹅膏蕈碱，随后允许剪接反应进行30分钟和60分钟。提取RNA后，在5%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，并通过磷屏成像仪检测。图中标注了剪接中间产物和最终产物。提取物中存在的内源性U6 snRNA和tRNA在孵育过程中被32P标记，也已在图中标出。有关偶联RNAP II转录/剪接系统的详细方案，请参见文献3。

前体mRNA剪接凝胶电泳结果；使用Pladienolide F和E7107的时间过程分析。
图3. 用剪接抑制剂药物E7107处理的HeLa细胞制备的小规模核提取物存在剪接缺陷。细胞用3 μM Pladienolide F或E7107处理，方法如文献6所述，随后用于制备小规模核提取物。采用与图2相同的转录/剪接实验体系进行时间过程分析。图中标明了剪接中间产物、剪接终产物、U6 snRNA和tRNA。

讨论

我们建立了一种快速且可重复的方法，用于从小量单层培养的HeLa细胞中制备核提取物。我们通过证明在小规模和大规模核提取物中，RNAP II转录/剪接实验的动力学和效率相似，验证了这些提取物的可靠性。我们进一步通过实验证明，从经剪接抑制剂药物处理的细胞中制备的提取物仍具有转录活性，但在剪接功能上存在缺陷，从而展示了该提取物的实用性。

我们制备小规模核提取物的方法，是通过整合并优化先前已建立的两种方法而实现的：一种是用于大规模悬浮培养HeLa细胞提取物的方法1,8，另一种是小规模提取物制备方法9。我们建立本实验方案的原因在于，此前的小规模提取物在某些检测中不具备功能活性，例如偶联转录/剪接检测。我们当前的方案与先前小规模方案9之间的一个重要区别在于，我们优化了使用微型Dounce匀浆器裂解细胞的条件，而先前的方案则是通过将细胞推过细径针头来实现裂解9。针头裂解容易产生气泡，这可能解释了为何此前的提取物在某些检测中无活性或难以重复。此外，我们在方案中增加了一个浓缩步骤。该步骤可提高提取物的活性（提取物对浓度极为敏感），同时减少小规模制备固有的提取物间差异性。最终，我们的制备过程通常仅需三个150 mm的单层细胞培养板，与大规模提取物相比，其活性未受显著影响。因此，该方法特别适用于需要昂贵试剂或细胞来源有限的小规模制备。例如，我们已从RNA干扰（RNAi）敲低细胞以及慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者细胞中成功制备了小规模提取物，并将其用于功能或生化检测（EGF, JLH, TY 和 RR，未发表）。我们发现，这些提取物在RNAi处理后进行特定生化检测（如免疫共沉淀、Western印迹和银染）方面具有重要价值。在确认特定蛋白敲低的有效性后，可通过构建稳定敲低细胞系进行更深入的研究，从而以较低成本制备更多提取物。对这些敲低细胞系来源的免疫沉淀物中的蛋白质进行质谱分析，也将是本方法的一项重要应用。除了本方案描述中作为示例的偶联转录/剪接检测外，这些小规模提取物应普遍适用于多种功能和生化检测，例如基因表达各阶段的相关检测（如加帽、剪接、转录、多聚腺苷酸化、microRNA加工等）。该方案还可适用于可悬浮获取（如CLL细胞）或体外培养（如患者成纤维细胞）的各类患者来源细胞。最后，本实验过程中获得的细胞质组分，也应适用于需要细胞质组分的各类功能与生化检测。

披露

本文的制作和免费获取由 Abcam, Plc 赞助。

致谢

我们感谢 M. Winkelbauer-Hurt、E. Ibrahim、P. Valencia、K. Dufu 和 H. Cheng 有益的讨论。HeLa 细胞来自国家细胞培养中心（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。我们还感谢卫材有限公司（Eisai Co., Ltd）提供 E7107，以及哈佛医学院尼康影像中心在光学显微镜方面的帮助。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助 GM043375（资助对象为 RR 和 EGF）以及 NRSA 奖学金（资助对象为 JLH）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HEPES4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸SigmaH3375-500G
MgCl₂2.6H2O六水合氯化镁SigmaM2670-500G
KCl氯化钾FisherP335-212
PMSF苯甲基磺酰氟SigmaP7626-100G
DTT二硫苏糖醇美国 BioanalyticalAB00490-5G
EDTA乙二胺四乙酸二钠二水合物美国 BioanalyticalAB00500-01000
甘油MP Biomedicals800689
DMEM杜尔贝科’最小必需培养基Invitrogen11995-073
FBS胎牛血清Gibco16140
青霉素/链霉素Gibco15070
PBS磷酸盐缓冲液Cellgro21-040-CV
0.4% 台盼蓝染色液Gibco15250
细胞刮刀康宁29442-200
150 mm 培养皿VWR353025
延长型微量移液器吸头丹维尔P1126
Dounce匀浆器，1 ml，配紧密研杵Wheaton357538
Slidealyzers，截留分子量 10 kDa赛默飞世尔科技69572
Mini-Centricons，截留分子量 3 kDa默克密理博（Amicon）UFC500396
<强>表1. 特定试剂与设备。
低渗10 mM HEPES，pH 7.91 M HEPES，pH 7.95 ml
1.5 mM MgCl21M MgCl₂2750 μl
10 mM KCl3M KCl1.67 ml
0.2 mM PMSF200 mM PMSF500 μl
0.5 mM DTT2M DTT125 μl
<强>加水至 500 ml
低盐20 mM HEPES，pH 7.91 M HEPES，pH 7.92 ml
1.5 mM MgCl21M MgCl₂2150 μl
20 mM KCl3M KCl667 μl
0.2 mM EDTA0.5 M EDTA40 μl
25% 甘油甘油25 ml
0.2 mM PMSF200 mM PMSF100 μl
0.5 mM DTT2M DTT25 μl
<强>加水至 100 ml
高盐20 mM HEPES，pH 7.91 M HEPES，pH 7.92 ml
1.5 mM MgCl21M MgCl₂2150 μl
1.4 M KCl3M KCl48 ml
0.2 mM EDTA0.5 M EDTA40 μl
25% 甘油甘油25 ml
0.2 mM PMSF200 mM PMSF100 μl
0.5 mM DTT2M DTT25 μl
<强>加水至 100 ml
透析20 mM HEPES，pH 7.91 M HEPES，pH 7.910 ml
100 mM KCl3M KCl16.625 ml
0.2 mM EDTA0.5 M EDTA200 μl
20% 甘油甘油100 ml
0.2 mM PMSF200 mM PMSF500 μl
0.5 mM DTT2M DTT125 μl
<强>加水至 500 ml
<强>表2. 核提取物制备用溶液

参考文献

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  3. Das, R. Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly. Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).
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  5. Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. A model in vitro system for co-transcriptional splicing. Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).
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  8. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
  9. Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing. Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).

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