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1。核提取HeLa细胞成长
- 3 150 mm中厚板板的HeLa细胞DMEM培养基辅以10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素。增长5％的CO 2在37℃孵化，直到细胞90％汇合。
提示细胞分裂从合流板和收获后第3天分裂1:10。
提示额外的板可以种植的情况下，有没有足够的细胞（例如，如果细胞小于90％的合流）三大板块。
2。准备和冷藏核提取物解
- 准备好新鲜的解决方案，如表2所列。
- 分装10毫升到15毫升猎鹰管低渗缓冲。等分高盐缓冲和低盐缓冲液1毫升1毫升到1.5毫升的Eppendorf管。冷藏冰的缓冲区。每个缓冲区加入PMSF和DTT的相应卷前使用（见
3。收获HeLa细胞的核提取
- 从细胞吸媒体和室温1X PBS每盘13毫升的洗细胞一次。
- 吸出PBS洗涤。
第一吸气式提示，吸尽可能多的PBS，站在其侧面板，然后等待几秒钟，吸气其余。
- 使用手机起苗，刮去电池板的底边，然后将其转移到Eppendorf管中的细胞。避免气泡。 3板刮下细胞放入一个1.5毫升的Eppendorf管。
提示这是比较容易估计细胞的数量，如果用于Eppendorf管。为规模，使用猎鹰管。
- 在4°C离心5分钟100 XG颗粒细胞离心。
4。膨胀HeLa细胞在低渗缓冲
小心吸PBS和细胞沉淀在管上的层次看，红细胞压积（PCV）的估计。 HeLa细胞融合板产量约500μL的PCV。 加入2倍的圆环低渗缓冲细胞沉淀。摇轻轻地悬浮细胞。使用P1000的Pipetman轻轻悬浮细胞吹打起来，如果有必要的。 在4°C离心5分钟100 XG颗粒细胞离心。 *细胞就会开始膨胀，这个时候，细胞体积约750微升1000微升现在应该。 小心吸低渗缓冲到最终体积为1.5毫升，并添加新的低渗缓冲。悬浮细胞。 再悬浮冰肿细胞孵育10分钟。 5。裂解细胞，用Dounce均质
- 使用低渗缓冲，冲洗dounce和然后冰上冷却。请用杵干微妙任务制品的呃如Kimwipe。从使用1000μl的扩展微量尖dounce删除剩余的缓冲区。
- 转移到dounce肿细胞。紧杵慢慢移动的dounce的5倍，裂解细胞，小心避免气泡。
- 使用5μL等份从的dounce细胞的细胞裂解法。放置在一个Eppendorf管中的等份，并加入等量的台盼蓝。放在幻灯片的混合物，并用光学显微镜检查细胞。溶解细胞的细胞核会出现蓝色。约90％的溶解是理想的。
提示细胞应dounced倍的数量会有所不同，取决于，dounce的密封性。首次开展此协议时，确定的次数以dounce后每个的dounce的中风进行步骤5.3。不要过dounce，过度douncing会破坏细胞核。
- 溶解细胞转移前，chilleðEppendorf管中，并在4℃离心5分钟1500×Ğ自旋。颗粒包含的原子核。小心将上清转移到一个新的管而不破坏细胞核。上清液中含有细胞质。
提示细胞质可以用作是进一步处理到9000使用相同的高速旋转，用于批量提取（见活跃S100的批量提取准备从1）。
6。盐提取细胞核
- 由在管上的层次看，估计可携带核卷（PNV）。通常产生一个圆环的500μL400μLPNV。
- 添加半低盐缓冲X PNV细胞核插入微管尖管底部，缓慢而轻轻搅拌核喷射进缓冲区。不要吸管上升和下降。轻轻一抖管，以确保颗粒完全悬浮在低盐缓冲，然后再继续。
<李>添加8.5×高盐缓冲液，并迅速搅拌1次由反相管PNV。不要动摇。在4°C旋转30分钟。
提示当他们在高盐缓冲液，以避免溶解它们与原子核的温柔。
- 在4°C，18,000 xĞ15分钟离心旋转。上清高盐核提取物（HS-NE）的。三板的细胞，通常会产生500-600μLHS-NE的。
7。集中和透析的核提取物
- 转移到500μL的HS-NE冰鲜小centricons的（Amicon）和自旋为50分钟在4°C，在离心14000 xĞ。反转迷你centricon的（Amicon），并将其放置在一个新的Eppendorf管。在4°C 2分钟旋转1000 XG恢复的HS-NE。该HS-NE将集中约115μL。
- 使用P200的Pipetman，转移到微型透析幻灯片-A Lyzers的HS-NE的45μL等份，他们将在500毫升冰鲜透析液。确保一个幻灯片仪的底部是浮动的底部对齐。搅拌1-2小时，在4°C东北透析后会出现混浊。
提示不要离心除去混浊沉淀，透析后观察，离心，因为这降低了提取物的活性。
- NE可以立即使用或分装。等份应该闪光冻结在液氮中，并储存在-80°C。 NE可以存储和接受至少两个冻融而不失去活性。
8。代表结果
最近， 在体外耦合RNA聚合酶Ⅱ转录拼接系统的高效开发2-5。这些系统采用大量种植HeLa细胞，因此不适合快速测试多个样品的特异性细胞治疗的效果。在此基础上需要ND一般一个小规模的提取协议的实用程序（见讨论），我们建立了一个强大的小规模的核提取方法。散装核提取物在小规模的核提取物的RNA聚合酶II转录/剪接反应比较有代表性的数据如图2所示。一个CMV-DNA的结构，其中包含CMV启动子和编码标准剪接基板（保 税区3， 图2A），用于分析。当这种结构在批量（1-3车道）或小规模（4-6车道）提取物孵育5分钟的时间点（ 图2，1和4车道，新生的mRNA前体的合成类似的水平）。除了α-鹅膏蕈碱，以阻止进一步的转录，剪接中间体和拼接产品随着时间的推移累计提取这两种类型（ 图2，泳道2，3，5，6）类似的动力学。这些具有代表性的结果表明，政变效率为首的RNA聚合酶II转录/拼接系统是类似的散装和小规模的核提取物。
为了证明实用的小规模的提取方法，提取准备从拼接抑制剂，E7107，或F 6,7，然后耦合RNA聚合酶II转录/拼接法进行的负控制复合pladienolide的的治疗HeLa细胞。 图3所示，由RNA聚合酶Ⅱ转录发生无论从Pladienolide F和E7107细胞治疗（10分钟时间点）准备的提取物，有效。相比之下，剪接发生通常从Pladienolide的F-处理的细胞准备的提取物，但被取消E7107处理的细胞（ 图3，20-60分钟的时间点）。这些数据提供了证明，使用小规模的核提取物对细胞的特殊待遇，在小规模的概念。
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图1。小规模提取议定书"的原理。步骤P1的。细胞生长单层，收获细胞升降板从使用和低渗缓冲此外肿。加强P2的。 Dounce匀浆用细胞被溶解，离心沉淀细胞核。加强P3的。原子核从细胞质中分离出来，并进行盐提取。加强P4的。核提取物浓缩和透析。加强小五。得到的结果，表明核提取物功能（更详细见图2）。
图2。小规模的核提取物有强劲的耦合RNA聚合酶Ⅱ转录/拼接法。用于耦合RNA聚合酶II转录/剪接的CMV-保税区DNA模板的示意图。 CMV启动子和外显子和内含子的大小表示。 B.耦合RNA聚合酶的比较二转录/剪接的检测，无论是散装的核提取物或小规模的核提取物。 α-鹅膏蕈碱增加了5分钟的转录和剪接后允许出现30和60分钟。 RNA的提取和分馏5％的变性聚丙烯酰胺凝胶检测和phosphoimager。显示拼接和中间体产品。 U6 snRNA中的内源性和tRNA中存在的提取物和32 P标记孵化期间表示。见上耦合RNA聚合酶II转录/拼接系统的详细协议。
图3。 E7107拼接抑制剂药物治疗HeLa细胞准备的小规模的核提取物在剪接缺陷。细胞治疗3微米Pladienolide F或E7107作为描述6，然后用准备小规模的核提取物。 图2使用相同的转录/拼接法进行了一个时间过程。拼接和中间体产品，和U6 snRNA和tRNA的表示。