本文描述了一种利用培养的成年小鼠背根神经节神经元进行轴突再生遗传学研究的体外模型。该方法包括重新悬浮和再接种步骤，以允许经历遗传操作的神经元重新生长轴突。该策略对于利用基于RNA干扰的蛋白敲低技术进行轴突再生的缺失功能研究尤为有用。
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摘要
摘要
众所周知，中枢神经系统（CNS）中的成熟神经元在损伤后无法再生其轴突，这是由于其支持轴突生长的内在能力减弱，以及成熟中枢神经系统中存在的抑制性环境所致1,2。相比之下，周围神经系统（PNS）中的成熟神经元在损伤后能够有效再生3。成年背根神经节（DRG）神经元在周围神经损伤后能够 robustly 再生轴突，这一特性已被广泛认知。每个 DRG 神经元从胞体发出一条轴突，该轴突随后分为两个分支：一个周围分支支配外周靶组织，另一个中枢分支延伸至脊髓。DRG 周围轴突的损伤可引发显著的轴突再生，而其在脊髓内的中枢分支在损伤后再生能力则非常有限。然而，如果在脊髓损伤之前先发生周围轴突损伤（这一过程称为“预处理损伤”），则中枢轴突的再生能力将显著增强4。此外，DRG 神经元的中枢轴突与脊髓中下行的皮质脊髓轴突处于相同的抑制性环境中。因此，研究者推测，调控成年 DRG 神经元轴突再生的分子机制有望被用于促进中枢神经系统轴突的再生。正因如此，成年 DRG 神经元现已被广泛用作研究轴突再生生长的模型系统5-7。
本文介绍了一种可用于轴突再生遗传学研究的成年大鼠背根神经节（DRG）神经元培养方法 体外在此模型中，成年背根神经节神经元通过电穿孔介导的基因转染进行遗传学操作6,8通过将DNA质粒或si/shRNA转染至神经元，该方法可实现基因功能获得与功能缺失实验，以研究任何目的基因在成年DRG神经元轴突生长中的作用。当神经元被转染si/shRNA后，靶向的内源性蛋白通常在培养3-4天后才被耗竭，而在此期间强烈的轴突生长已经发生，导致功能缺失研究效果降低。为解决这一问题，本文所述方法在转染后增加了重新悬浮和再接种步骤，使轴突能够在缺乏靶蛋白的条件下重新生长。最后，我们提供了一个应用此方法的示例 体外 研究轴突再生相关基因 c-Jun 在介导成年背根神经节神经元轴突生长中作用的模型9.
方案
1. 盖玻片、培养基和消化酶的准备
- 神经元培养使用12 mm圆形#1玻璃盖玻片。盖玻片用10%盐酸浸泡过夜，然后用蒸馏去离子水超声清洗3次（每次20分钟）。清洗后的盖玻片保存在70%乙醇中以备后续使用。每次实验前，将盖玻片自然晾干并放入培养板中。
- 为包被干燥的盖玻片，每张盖玻片上加入100 μl包被液，包被液包含100 μg/ml多聚-L-赖氨酸和10 μg/ml层粘连蛋白工作液，然后将培养板放入37 °C培养箱中。1–2小时后，移除包被液，并用无菌1×PBS洗涤盖玻片3次。
- 配制培养基时，将最低必需培养基（MEM）补充5%胎牛血清（FBS）、1×青霉素-链霉素溶液（含500单位青霉素和500 μg链霉素）、1×GlutaMAX-I添加剂，以及含20 μM 5-氟-2-脱氧尿苷和20 μM尿苷（FDU/R）的抗有丝分裂试剂。对于无血清培养基，用B27添加剂替代FBS。
- 胶原酶A溶液通过将胶原酶A粉末溶于MEM中配制成1 mg/ml的工作浓度。胰蛋白酶使用1×TrypLE Express。
2. 成年小鼠背根神经节神经元的解剖与收获
- 处死6至10周龄的成年小鼠后，剥离背部皮肤并取出整个脊柱。用1 × PBS清洗取出的脊柱2-3次。
- 将取出的脊柱腹侧朝上固定在解剖板上，在解剖显微镜下小心去除肌肉以暴露感觉神经。腰段水平与背根神经节（DRG）相连的神经最粗且易于定位。因此，大多数实验仅采集腰段DRG。
- 用小剪刀沿中线逐一切开每个椎骨，并小心去除椎间盘。用镊子撑开每个椎骨以暴露脊髓。
- 为分离腰段DRG，用镊子提起每条腰神经并向脊髓方向追踪，以定位相应的腰段DRG（从L1到L6）。
- 用弹簧剪刀将每个DRG从其相连的外周神经、背根和腹根上剪下，并将其置于含有MEM培养基并置于冰上的微量离心管中保存。必要时，可采用类似方法分离其他脊髓节段的DRG（例如胸段DRG）。
3. 成年小鼠背根神经节神经元的消化与解离
- 收集所有分离的背根神经节（DRG）后，将MEM培养基替换为1 ml胶原酶A溶液，将微量离心管置于37 °C孵育90分钟。
- 用500 μl 1× TrypLE Express溶液替换胶原酶A溶液，于37 °C孵育15–20分钟。
- 移除TrypLE Express溶液，用1 ml预先配制的含5% FBS的培养基清洗DRG三次。
- 加入600 μl培养基，使用1 ml蓝色带刻度移液枪头，轻柔吹打组织20–30次以进行机械解离。
- 解离后，让未完全分散的组织沉降到微量离心管底部，将细胞悬液转移至10 ml无菌管中。再加入600 μl培养基，重复吹打解离步骤，直至大部分组织被解离。所得细胞悬液包含神经元和非神经元细胞。通常情况下，每6个DRG（约5 × 104）的细胞用于一次电穿孔反应。
4. 通过电穿孔对神经元进行遗传操作
- 通过将小鼠神经元 Amaxa 核转染溶液与 DNA 质粒（约 10 μg）或 siRNA 寡核苷酸（约 0.2 nmol）混合，配制转染溶液，每次转染终体积为 100 μl。
- 在室温下以 680 rpm 离心解离后的细胞 7 分钟，尽可能弃去上清液。加入已配制的转染溶液，使用 200 μl 吸头轻柔吹打 3–4 次，重新悬浮细胞。
- 将含有转染溶液的细胞悬液转移至电穿孔比色皿中，并使用 Amaxa Nucleofector 系统的 G-013 程序进行电穿孔。
- 电穿孔后，立即向比色皿中加入 500 μl 预热（37 °C）并含有 FBS 的培养基，将全部溶液（约 600 μl）转移至包被好的培养板中，按所需细胞密度进行接种。对于需要重悬和再接种的实验，神经元直接以高密度（10000–20000 个细胞/孔）培养于塑料培养皿中；对于直接观察轴突生长的实验，神经元以较低密度（3000–5000 个细胞/孔）接种于包被的玻璃盖玻片上。将培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2）中培养。
- 接种后 4 小时，待神经元贴附于基质后，轻柔地将含有 Amaxa 核转染溶液的培养基更换为 500 μl 新鲜且预热的培养基，并将培养板放回培养箱继续培养（37 °C，5% CO2）。此步骤可使用含 FBS 的培养基或无血清培养基。
5. 用于轴突生长分析的成年DRG神经元培养
- 对于转染了DNA质粒的神经元，目的基因的表达（例如 EGFP）在电穿孔后数小时内即可观察到。对于转染了siRNA的神经元，我们通常等待3-4天，以确保内源性蛋白被充分耗竭。培养的神经元可在不同时间点（电穿孔后1-4天）直接固定，用于轴突生长分析；也可重新悬浮并重新接种，以分析轴突再生（见下文）。
- 对于RNAi介导的功能缺失研究，可将培养的神经元重新悬浮并再次接种，以允许靶蛋白已被耗竭的神经元重新生长轴突。具体操作如下：将高密度培养神经元的旧培养基更换为1 ml预热的新鲜培养基，轻轻吹打6–10次，使贴壁的神经元重新悬浮。由于非神经元细胞（例如 由于施万细胞（Schwann cells）与培养皿的贴附程度远高于神经元，重悬后的细胞主要为神经元。
- 将重悬的神经元转移至微量离心管中，轻轻吹打10-15次，以将细胞团块重新解离为单细胞悬液。
- 将重新解离的神经元以低密度（3000–5000 个细胞/孔）接种至新制备的盖玻片上，培养过夜（16–24 小时）。
6. 固定、免疫染色和荧光成像
- 吸去培养基，加入4%多聚甲醛（PFA）（每孔200 μl），在室温下固定细胞15-20分钟。随后用1X PBS洗涤固定后的细胞3次。
- 吸去PBS，加入封闭液（含1%牛血清白蛋白、0.1% Triton X-100和2.0%正常山羊血清的1X PBS溶液），在室温下封闭固定神经元60分钟。
- 为标记轴突，使用抗神经丝蛋白抗体或抗-βIII微管蛋白抗体对神经元进行免疫染色。具体操作：在Parafilm上为每张盖玻片滴加30 μl一抗溶液（βIII微管蛋白抗体按1:1200稀释），将盖玻片倒置并置于一抗液滴上，在室温下孵育60分钟。
- 将盖玻片放回原培养板中，用1X PBS洗涤3次。
- 对二抗重复相同的孵育步骤。
- 用蒸馏水洗涤盖玻片3次，然后将盖玻片用封片剂（e.g. ProLong Gold Antifade）封固于载玻片上。
- 染色后的神经元可在配备数字相机的任意荧光显微镜系统上成像，轴突长度使用图像分析软件进行测量与分析。
7. 典型结果
在未添加任何外源性细胞外生长因子的情况下，成年DRG神经元通常在初次铺板后48小时开始生长轴突。这些轴突常呈现分支状形态（图1）。相比之下，重铺板的神经元在铺板后数小时内即开始延伸轴突，且轴突伸长过程中分支显著减少（图2）。这些结果提示，重铺板的神经元具有与经“条件性损伤”处理的神经元相似的特性。利用该方法，我们近期开展了功能缺失研究，以探讨轴突再生相关转录因子c-Jun在成年DRG神经元体外轴突生长中的作用。体外实验结果显示，转染针对c-Jun不同区域的4种不同siRNA（ON-TARGETplus）后3天，成年DRG神经元中c-Jun蛋白水平显著降低（图3）9。当神经元重铺板并培养过夜后，c-Jun敲低组神经元的轴突生长显著减少（对照组：348.37±16.21 μm；si-c-Jun组：262.32±15.69 μm，图3）9。这些结果表明，培养的成年DRG神经元为研究成年神经元轴突生长提供了一个有效的模型系统。
图 1. 成年小鼠背根神经节（DRG）神经元低密度培养 3 天。神经元经抗-βIII 微管蛋白抗体染色。请注意，大多数轴突呈现分支形态。比例尺：125 μm。
图 2. 成年小鼠背根神经节（DRG）神经元培养3天后的重新接种。（A）培养3天的高密度成年DRG神经元。（B）重新接种的成年DRG神经元在低密度条件下培养过夜。注意大多数轴突呈现伸长形态，轴突分支较少。比例尺：A中为250 μm，B中为125 μm。
图3. c-Jun在成年DRG神经元轴突生长中的作用 体外（A）成年小鼠DRG神经元在转染c-Jun siRNA后，通过Western印迹分析检测c-Jun的表达水平。结果显示c-Jun的表达量显著降低。（B）转染EGFP的对照组神经元在重新铺板并培养过夜后，长出较长的轴突。（C）共转染c-Jun siRNA与EGFP的成年DRG神经元在重新铺板并培养过夜后，轴突生长受到抑制。红色：Tuj-1染色；绿色：EGFP。比例尺： 125 μm这些结果已发表在Saijilafu等人的研究中。9.
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讨论
成年DRG神经元在周围神经损伤后能 robustly 再生其轴突 体内 和 体外从而为研究成年动物的轴突再生提供了一个有用的系统。 体外 成年DRG神经元的培养正成为研究轴突再生调控分子机制的常用方法。 体外 此处介绍的成年小鼠背根神经节（DRG）神经元培养方法，可实现对再生性轴突生长的快速而有效的遗传学研究。重新悬浮与再接种培养的DRG神经元特别适用于功能缺失型研究，因为它允许在目标蛋白已被耗竭的神经元中重新启动轴突生长。此外，再接种培养的DRG神经元模拟了损伤后的神经元再生过程，为研究轴突再生机制提供了一个可靠的体外模型。 体内 条件性损伤效应，从而为研究轴突再生提供一种更具生理相关性的方法 体外.
采用所述电穿孔方法转染成年DRG神经元时，DNA质粒的转染效率约为20-50%，具体取决于构建体的大小，该效率足以进行轴突生长的形态学分析。与电穿孔相比，病毒介导的基因转移效率更高，适用于利用DRG神经元进行生物化学分析。然而，针对每个目的基因构建和制备病毒需要更多的劳动投入...
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致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号R01NS064288）和克雷格·H·尼尔森基金会对F. Z.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| 层粘连蛋白 | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-氟-2-脱氧尿苷 | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| 尿苷 | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| 胶原酶A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10270-098 | |
| 青霉素-链霉素（100倍浓度） | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I（100倍浓度） | Invitrogen | 35050-038 | |
| 玻璃盖玻片（#1） | Electron Microscopy Sciences | 72196-12 | |
| 24孔细胞培养板 | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1倍PBS缓冲液 | Mediatech | 21-040-CV | |
| 无菌去离子蒸馏水 | Mediatech | 25-055-CV | |
| 小鼠神经元用Nucleofector电穿孔试剂盒 | Lonza | VPG-1001 | |
| 靶向c-Jun的ON-TARGETplus siRNA | Dharmacon | L-043776 | |
| 抗-βIII微管蛋白抗体（Tuj-1） | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold抗荧光淬灭封片液 | Invitrogen | P36930 |
参考文献
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- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
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- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
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- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
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