本文描述了一种利用培养的成年小鼠背根神经节神经元进行轴突再生遗传学研究的体外模型。该方法包括重新悬浮和再接种步骤，以允许经历遗传操作的神经元重新生长轴突。该策略对于利用基于RNA干扰的蛋白敲低技术进行轴突再生的缺失功能研究尤为有用。
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本文内容
摘要
摘要
众所周知，中枢神经系统（CNS）中的成熟神经元在损伤后无法再生其轴突，这是由于其支持轴突生长的内在能力减弱，以及成熟中枢神经系统中存在的抑制性环境所致1,2。相比之下，周围神经系统（PNS）中的成熟神经元在损伤后能够有效再生3。成年背根神经节（DRG）神经元在周围神经损伤后能够 robustly 再生轴突，这一特性已被广泛认知。每个 DRG 神经元从胞体发出一条轴突，该轴突随后分为两个分支：一个周围分支支配外周靶组织，另一个中枢分支延伸至脊髓。DRG 周围轴突的损伤可引发显著的轴突再生，而其在脊髓内的中枢分支在损伤后再生能力则非常有限。然而，如果在脊髓损伤之前先发生周围轴突损伤（这一过程称为“预处理损伤”），则中枢轴突的再生能力将显著增强4。此外，DRG 神经元的中枢轴突与脊髓中下行的皮质脊髓轴突处于相同的抑制性环境中。因此，研究者推测，调控成年 DRG 神经元轴突再生的分子机制有望被用于促进中枢神经系统轴突的再生。正因如此，成年 DRG 神经元现已被广泛用作研究轴突再生生长的模型系统5-7。
本文介绍了一种可用于轴突再生遗传学研究的成年大鼠背根神经节（DRG）神经元培养方法 体外在此模型中，成年背根神经节神经元通过电穿孔介导的基因转染进行遗传学操作6,8通过将DNA质粒或si/shRNA转染至神经元，该方法可实现基因功能获得与功能缺失实验，以研究任何目的基因在成年DRG神经元轴突生长中的作用。当神经元被转染si/shRNA后，靶向的内源性蛋白通常在培养3-4天后才被耗竭，而在此期间强烈的轴突生长已经发生，导致功能缺失研究效果降低。为解决这一问题，本文所述方法在转染后增加了重新悬浮和再接种步骤，使轴突能够在缺乏靶蛋白的条件下重新生长。最后，我们提供了一个应用此方法的示例 体外 研究轴突再生相关基因 c-Jun 在介导成年背根神经节神经元轴突生长中作用的模型9.
方案
1. 盖玻片、培养基和消化酶的准备
- 神经元培养使用12 mm圆形#1玻璃盖玻片。盖玻片用10%盐酸浸泡过夜，然后用蒸馏去离子水超声清洗3次（每次20分钟）。清洗后的盖玻片保存在70%乙醇中以备后续使用。每次实验前，将盖玻片自然晾干并放入培养板中。
- 为包被干燥的盖玻片，每张盖玻片上加入100 μl包被液，包被液包含100 μg/ml多聚-L-赖氨酸和10 μg/ml层粘连蛋白工作液，然后将培养板放入37 °C培养箱中。1–2小时后，移除包被液，并用无菌1×PBS洗涤盖玻片3次。
- 配制培养基时，将最低必需培养基（MEM）补充5%胎牛血清（FBS）、1×青霉素-链霉素溶液（含500单位青霉素和500 μg链霉素）、1×GlutaMAX-I添加剂，以及含20 μM 5-氟-2-脱氧尿苷和20 μM尿苷（FDU/R）的抗有丝分裂试剂。对于无血清培养基，用B27添加剂替代FBS。
- 胶原酶A溶液通过将胶原酶A粉末溶于MEM中配制成1 mg/ml的工作浓度。胰蛋白酶使用1×TrypLE Express。
2. 成年小鼠背根神经节神经元的解剖与收获
- 处死6至10周龄的成年小鼠后，剥离背部皮肤并取出整个脊柱。用1 × PBS清洗取出的脊柱2-3次。
- 将取出的脊柱腹侧朝上固定在解剖板上，在解剖显微镜下小心去除肌肉以暴露感觉神经。腰段水平与背根神经节（DRG）....
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讨论
成年DRG神经元在周围神经损伤后能 robustly 再生其轴突 体内 和 体外从而为研究成年动物的轴突再生提供了一个有用的系统。 体外 成年DRG神经元的培养正成为研究轴突再生调控分子机制的常用方法。 体外 此处介绍的成年小鼠背根神经节（DRG）神经元培养方法，可实现对再生性轴突生长的快速而有效的遗传学研究。重新悬浮与再接种培养的DRG神经元特别适用于功能缺失型研究，因为它允许在目标蛋白已被耗竭的神经元中重新启动轴突生长。此外，再接种培养的DRG神经元模拟了损伤后的神经元再生过程，为研究轴突再生机制提供了一个可靠的体外模型。 体内 条件性损伤效应，从而为研究轴突再生提供一种更具生理相关性的方法 体外.
采用所述电穿孔方法转染成年DRG神经元时，DNA质粒的转染效率约为20-50%，具体取决于构建体的大小，该效率足以进行轴突生长的形态学分析。与电穿孔相比，病毒介导的基因转移效率更高，适用于利用DRG神经元进行生物化学分析。然而，针对每个目的基因构建和制备病毒需要更多的劳动投入.......
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致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号R01NS064288）和克雷格·H·尼尔森基金会对F. Z.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| 层粘连蛋白 | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-氟-2-脱氧尿苷 | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| 尿苷 | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| 胶原酶A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10270-098 | |
| 青霉素-链霉素（100倍浓度） | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I（100倍浓度） | Invitrogen | 35050-038 | |
| 玻璃盖玻片（#1） | Electron Microscopy Sciences | 72196-12 | |
| 24孔细胞培养板 | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1倍PBS缓冲液 | Mediatech | 21-040-CV | |
| 无菌去离子蒸馏水 | Mediatech | 25-055-CV | |
| 小鼠神经元用Nucleofector电穿孔试剂盒 | Lonza | VPG-1001 | |
| 靶向c-Jun的ON-TARGETplus siRNA | Dharmacon | L-043776 | |
| 抗-βIII微管蛋白抗体（Tuj-1） | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold抗荧光淬灭封片液 | Invitrogen | P36930 |
参考文献
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D.
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