本方案描述了一种用于制备亚微米尺寸且高度均一的脂质体囊泡的挤出方法。该方法采用压力可控的系统，并通过控制氮气流速来制备脂质体。本文将介绍脂质体制备1,2、脂质体挤出及粒径表征方法。
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摘要
摘要
脂质体是由天然和合成磷脂人工制备的囊泡，被广泛用作模拟细胞膜的平台，以研究蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-脂质相互作用3，监测药物递送4,5以及药物包封过程4。磷脂天然形成弯曲的脂双层结构，从而区别于胶束6。传统上，脂质体根据其大小和脂双层层数进行分类，即大单层囊泡（LUVs）、小单层囊泡（SUVs）和多层囊泡（MLVs）7。特别是，制备不同尺寸的均一脂质体对于研究膜曲率至关重要，因为膜曲率在细胞信号转导、内吞和外排作用、膜融合以及蛋白质运输过程中发挥着关键作用8。已有多个研究团队分析蛋白质如何调控涉及膜曲率的生物学过程，因此制备直径<100 - 400 nm的脂质体以研究其对细胞功能的影响3。另一些研究则聚焦于脂质体-药物的包封，将脂质体作为运载和递送目标药物的载体进行研究9。药物包封可在脂质体制备过程中实现，已有文献报道相关方法9。我们的挤出步骤不应影响已包封的药物，原因有二：（1）药物包封应在该步骤之前完成；（2）脂质体应保持其天然的生物物理稳定性，从而将药物稳定地携带于其水相核心中。这些研究目标进一步表明，亟需一种优化的方法来设计稳定的亚微米级脂质囊泡。
然而，目前的脂质体 制备技术（超声处理10、冻融10、沉降）无法高效且高度一致地制备具有高度弯曲表面（即直径 <100 nm）的脂质体10,5，这限制了膜曲率感知这一新兴领域的生物物理研究。本文中，我们提出了一种用于制备多种生物学相关脂质体的可靠方法。
使用气密注射器和聚碳酸酯膜进行手动挤出10,5是一种常见方法，但在使用孔径<100 nm时，由于手动施加压力的不一致性，常观察到样品的异质性。我们采用恒定压力控制的挤出装置制备了直径范围在30至400 nm之间的合成脂质体。如本方案所述，通过动态光散射（DLS）10、电子显微镜11和纳米颗粒追踪分析（NTA）12对脂质体尺寸进行定量表征，并以商用聚苯乙烯（PS）微球作为校准标准。实验结果显示所用膜孔径与实测脂质体尺寸之间具有接近线性的相关性，表明我们所采用的压力控制法制备脂质体具有高保真度。此外，我们还证明该脂质囊泡制备方法具有广泛的适用性，不受多种脂质体尺寸的影响。最后，通过时间过程研究，我们证实所制备的脂质体在长达16小时内保持稳定。以下展示一个典型的纳米级脂质体制备方案。
方案
1. 脂质体的制备
- 取一个带聚四氟乙烯（Teflon）衬垫瓶盖的 20 mL 玻璃小瓶。
- 使用前用氯仿清洗所有玻璃器皿和注射器，以防止污染。
- 使用 250 μL 气密玻璃注射器，将 100 μL 试剂级氯仿转移至该玻璃小瓶中。
- 使用 100 μL 气密玻璃注射器，向同一玻璃小瓶中加入 30 μL 试剂级甲醇。
- 为配制 2 mM 7:1.5:1.5 的磷脂酰胆碱（POPC）: 磷脂酰乙醇胺（POPE）: 胆固醇脂质溶液，将 216 μL 的 10 mg/mL POPC、42 μL 的 10 mg/mL POPE 和 20 μL 的 11 mg/mL 胆固醇 CHCl3 溶液转移至 20 mL 玻璃小瓶中。
- 使用缓慢流动的氩气或氮气蒸发有机溶剂，直至在小瓶底部观察到一层脂质薄膜。
- 将未加盖的玻璃小瓶置于真空干燥器中至少 30 分钟，以去除残留溶剂。
- 将 2 mL 已通过 0.2 微米滤膜过滤的缓冲液转移至玻璃小瓶中，以水合脂质。
- 将混合物在 4 °C 下孵育过夜，并在 48 小时内使用。
2. 冻融法：仅适用于30 - 100 nm粒径的脂质体
- 将脂质体悬液在液氮中冷冻15秒。
- 将脂质体悬液置于42 °C的加热块中解冻，约3分钟。
- 重复步骤2.1和2.2，共进行5个循环。
3. 挤出
按照Avestin公司的说明，使用其指南手册中的仪器示意图正确组装Liposofast LF-50挤出仪。
- 将大孔支撑筛（带圆形孔）放入支撑滤器底座中，随后依次放入圆形烧结盘（无孔）、一个排水盘（直径25 mm）和一张聚碳酸酯膜（直径25 mm）。
- 将小型黑色O型圈置于膜上，以将其固定在支撑滤器底座上。
- 通过拧紧四个对应孔中的螺丝，安装滤器上部挤压装置。
- 将滤器挤压单元组装到大尺寸挤压筒下方。将脂质体溶液加入筒状挤压筒中。随后依次将以下部件放置在挤压筒顶部：大型圆形O型圈、窄盖、大型圆形O型圈、圆形盖。
- 将气体调节器连接至挤压筒顶部，并关闭所有阀门以防止气体泄漏，包括压力释放阀。在挤压滤器单元下方放置一个20 mL玻璃小瓶或50 mL锥形瓶。调节器连接有安全阀，当压力超过600 psi时会自动释放。打开氮气并开启连接至挤压装置的气体阀门。
- 将氮气压力调节至：制备400 nm脂质体时为25 psi，制备100 nm脂质体时为125 psi，制备30 nm脂质体时为400–500 psi。
- 观察脂质体悬液在氮气推动下挤出进入容器的过程。持续通入氮气，直至不再观察到液体通过挤压滤器进入玻璃小瓶为止。
4. 动态光散射（DLS）分析
- 制备 50 μL 的 20 μM 脂质体溶液。
- 打开电源和光源。
- 启动 DynaPro 软件。
- 将软件设置为 MS/X 算法模型，用于检测 30 nm 和 100 nm 的脂质体；设置为 MS800 算法模型，用于检测 >100 nm 的脂质体。
- 连接硬件设备。
- 用移液器将 14 μL 脂质体样品加入石英比色皿中，并插入样品池架。
- 按下开始按钮。
- 在完成约 20 至 30 次采集后，按下停止按钮。
- 分析直方图中记录的平均脂质体直径峰。
5. 纳米颗粒跟踪分析（NTA）
- 制备500 μL、0.1 μM的脂质体溶液。
- 用水和乙醇冲洗样品室。
- 用无绒纸巾将样品室擦干。
- 打开激光电源和计算机。
- 向样品室中加入300 μL的0.1 μM脂质体溶液。
- 启动温度控制软件和纳米颗粒追踪分析软件。
- 按下“Capture”按钮以开启激光。
- 使用水平和垂直调节装置移动载物台，并调节显微镜焦距。
- 设定所需温度（20 °C）和记录时间（至少30秒）。
- 按下“Record”按钮，对脂质体颗粒进行指定时长的多帧图像采集。通过分析直方图中对应脂质体直径大小的峰，追踪每个颗粒的运动情况。
6. 代表性结果
展示挤出法的示意图如下所示 图1为获得最佳结果，制备直径为30 nm的脂质体时需使用约500 psi的高压，而制备直径为100 nm的脂质体时需使用125 psi的压力，以实现较快的过滤速率。对于直径为400 nm的脂质体，建议采用约25 psi的低压，以实现较慢的过滤速率，从而使囊泡伸长并形成更大且均一的脂质体。我们进行了一系列实验，以确定产生均一亚微米级囊泡尺寸的最佳压力。通过改变压力以及使用孔径分别为30 nm、100 nm和400 nm的聚碳酸酯滤膜进行多次挤出，我们确定了每种目标尺寸所需的适宜压力。对于30 nm孔径的滤膜，若压力低于500 psi，将降低流速，导致囊泡伸长，从而形成更大的囊泡尺寸。对于100 nm孔径的滤膜，在125 psi压力下可实现稳定的流动。对于400 nm孔径的滤膜，低压（25 psi）可使囊泡伸长，形成更大尺寸的囊泡。缓慢滴滤的流速最有利于生成较大的亚微米级囊泡。13.
我们采用动态光散射（DLS）技术测定通过三种不同孔径（即30、100和400 nm）挤出后的脂质体尺寸。DLS是一种成熟的方法，通过收集散射光来确定颗粒直径。我们将浓度为2 mM的水合脂质体在500 psi压力下，经聚碳酸酯30 nm膜过滤5次；在125 psi压力下，经100 nm聚碳酸酯膜过滤5次；以及在25 psi压力下，经400 nm聚碳酸酯膜过滤2次。通过DLS测得的脂质体平均直径分别为：30 nm、100 nm和400 nm孔径条件下，其尺寸分别为66 ± 28 nm、138 ± 18 nm和360 ± 25 nm（图2）。如图2所示，使用50 nm聚苯乙烯微球悬浮液作为校准标准品，测得其直径为47 ± 16 nm。多分散系数百分比显示，不同尺寸的脂质体之间无重叠。由于DLS仪器对较大颗粒存在已知的检测偏差，因此在使用DLS分析时通常观察到的直径会大于30 nm12。大颗粒与小颗粒的光散射强度由同一种检测方法同时采集，因而更难分辨悬浮液中的脂质体12。尽管存在这一仪器局限性，校准曲线仍呈现出接近线性的相关性。
NTA 是一种新技术，通过直接观察颗粒在液体介质中的扩散来测量每个颗粒的大小，且不受颗粒折射率或密度的影响。这种高分辨率技术可用于补充动态光散射法（DLS）对脂质体的测量。NTA 记录的直径分别为 95 ± 48 nm 和 356 ± 51 nm，使用了两种粒径为 100 nm 和 400 nm 的聚苯乙烯溶液进行校准。如图3所示，30 nm 和 100 nm 的脂质溶液观测到的直径与 DLS 结果更为接近，测得平均粒径分别为 29 ± 14 nm、95 ± 17 nm 和 359 ± 73 nm。由于 NTA 具有较高的灵敏度，可检测 50 - 1000 nm 的颗粒，因此可能是一种更为通用的微观颗粒定量表征技术。校准曲线显示聚碳酸酯膜的孔径与 NTA 记录的直径之间存在线性相关关系。
| 脂质体尺寸 | 检测阈值 | 预期最小颗粒尺寸 (nm) |
| 30 nm | 11 | 30 |
| 100 nm | 11 | 100 |
| 400 nm | 21 | 400 |
表1. 纳米颗粒追踪分析仪参数。
图1. 挤出法流程图，描述压力和氮气流如何控制不同直径脂质体的均一性。在脂质体水合后，不同大小的单层囊泡在不同压力下通过不同孔径的聚碳酸酯膜滤器进行挤出。
图 2. 动态光散射（DLS）数据，描述挤出后脂质体的定量尺寸。（a）柱状图显示了三种脂质体样品的直径。使用50 nm聚苯乙烯（PS）微球作为校准标准。各样品的平均脂质体直径标注在对应柱状图上方。x轴表示溶液通过的膜孔径大小，y轴表示DLS记录的直径。尽管30 nm和100 nm样品测得的尺寸高于其对应孔径，而较大的400 nm样品测得的尺寸略低，但校准曲线（b）显示出近似线性的相关性，其中x轴表示聚碳酸酯膜的孔径，y轴表示DLS测得的脂质体直径。
图3. 纳米颗粒示踪分析（NTA）数据，描述脂质体经挤出后的尺寸。（a）柱状图表示每种脂质体样品的直径。x轴表示溶液所通过的滤膜孔径大小，y轴表示NTA记录的粒径大小。每种样品的平均脂质体直径标注在对应柱状图上方。（b）NTA校准曲线相较于动态光散射（DLS）校准曲线，在滤膜孔径与记录直径之间显示出更线性的相关性。x轴表示聚碳酸酯膜的孔径大小，y轴表示NTA记录的脂质体直径。
图 4. 负染透射电子显微镜（TEM）图像，显示每种脂质体尺寸（500 μM）经挤出后的形态。在样品染色前，碳支持膜铜网预先进行负电荷处理，使用1%水合醋酸铀对样品染色，随后干燥并在34,000×倍数下成像。30 nm、100 nm 和 400 nm 的尺寸彼此之间清晰可辨。实际放大倍数设定为25,000×。比例尺代表0.5 μm。
图5. 对三种不同粒径的脂质体进行了时间过程实验。在挤出后立即测量各脂质体溶液的动态光散射（DLS）值。所有脂质体溶液在4 °C下储存过夜，随后通过DLS记录其直径。经过16小时孵育后，未观察到明显变化。
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讨论
使用 Avestin Liposofast LF-50 挤出仪，我们展示了如何通过压力控制体系制备小尺寸的合成脂质体。需要注意的是，脂质体水合后会自发形成多层囊泡，这可能导致产生更小的纳米颗粒。这些小型多层囊泡不可避免地会通过较大的聚碳酸酯膜孔径，从而导致使用大孔径滤膜制备的单层囊泡溶液出现异质性。因此，建议在使用较大孔径（例如上文所述的 400 nm 直径孔径，氮气压力为 25 psi）时降低氮气流压力，以使脂质有足够时间融合并延展成更大的囊泡，从而提高溶液的均一性。对于直径小于<100 nm 的脂质体，则需施加高压（例如上文所述的 30 nm 和 100 nm 孔径使用 400–500 psi），以实现快速挤出，提高脂质包封效率和粒径均一性。
为确保脂质体的制备准确且可重复，建议采取几个关键步骤。采用所述方法进行挤出时，最好使用至少 3.0 mL 的样品体积来制备囊泡。当脂质浓度高于 2 mM 时，若要获得直径 > 500 psi 的样品，需使用更高的氮气压力（<100 nm），但应注意，该压力已超出仪器的最高限值，操作时应格外谨慎。建议将样品反复通过挤出器滤...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到了霍华德·休斯医学研究所（HHMI）协作创新奖的支持。L. A. M. 得到了美国国立卫生研究院信号转导与细胞调控培训基金（T32 GM008759）以及 NIH 露丝·L·柯什斯坦博士前研究员基金（CA165349-01）的支持。我们谨向 Michael Stowell 教授（科罗拉多大学博尔德分校）、Douglas Rees 教授和 Rob Phillips 教授（加州理工学院）致以诚挚感谢，感谢他们提供的宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% 稳定剂 |
| 高纯度甲醇 | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 挤出仪 | Avestin, Inc. | ||
| 磷脂 | Avanti Polar Lipids | ||
| 聚碳酸酯滤膜孔 | Avestin, Inc. | 25 mm 直径 | |
| 排水盘 PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm 直径 |
参考文献
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