本方案描述了一种用于制备亚微米尺寸且高度均一的脂质体囊泡的挤出方法。该方法采用压力可控的系统，并通过控制氮气流速来制备脂质体。本文将介绍脂质体制备1,2、脂质体挤出及粒径表征方法。
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摘要
摘要
脂质体是由天然和合成磷脂人工制备的囊泡，被广泛用作模拟细胞膜的平台，以研究蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-脂质相互作用3，监测药物递送4,5以及药物包封过程4。磷脂天然形成弯曲的脂双层结构，从而区别于胶束6。传统上，脂质体根据其大小和脂双层层数进行分类，即大单层囊泡（LUVs）、小单层囊泡（SUVs）和多层囊泡（MLVs）7。特别是，制备不同尺寸的均一脂质体对于研究膜曲率至关重要，因为膜曲率在细胞信号转导、内吞和外排作用、膜融合以及蛋白质运输过程中发挥着关键作用8。已有多个研究团队分析蛋白质如何调控涉及膜曲率的生物学过程，因此制备直径<100 - 400 nm的脂质体以研究其对细胞功能的影响3。另一些研究则聚焦于脂质体-药物的包封，将脂质体作为运载和递送目标药物的载体进行研究9。药物包封可在脂质体制备过程中实现，已有文献报道相关方法9。我们的挤出步骤不应影响已包封的药物，原因有二：（1）药物包封应在该步骤之前完成；（2）脂质体应保持其天然的生物物理稳定性，从而将药物稳定地携带于其水相核心中。这些研究目标进一步表明，亟需一种优化的方法来设计稳定的亚微米级脂质囊泡。
然而，目前的脂质体 制备技术（超声处理10、冻融10、沉降）无法高效且高度一致地制备具有高度弯曲表面（即直径 <100 nm）的脂质体10,5，这限制了膜曲率感知这一新兴领域的生物物理研究。本文中，我们提出了一种用于制备多种生物学相关脂质体的可靠方法。
使用气密注射器和聚碳酸酯膜进行手动挤出10,5是一种常见方法，但在使用孔径<100 nm时，由于手动施加压力的不一致性，常观察到样品的异质性。我们采用恒定压力控制的挤出装置制备了直径范围在30至400 nm之间的合成脂质体。如本方案所述，通过动态光散射（DLS）10、电子显微镜11和纳米颗粒追踪分析（NTA）12对脂质体尺寸进行定量表征，并以商用聚苯乙烯（PS）微球作为校准标准。实验结果显示所用膜孔径与实测脂质体尺寸之间具有接近线性的相关性，表明我们所采用的压力控制法制备脂质体具有高保真度。此外，我们还证明该脂质囊泡制备方法具有广泛的适用性，不受多种脂质体尺寸的影响。最后，通过时间过程研究，我们证实所制备的脂质体在长达16小时内保持稳定。以下展示一个典型的纳米级脂质体制备方案。
方案
1. 脂质体的制备
- 取一个带聚四氟乙烯（Teflon）衬垫瓶盖的 20 mL 玻璃小瓶。
- 使用前用氯仿清洗所有玻璃器皿和注射器，以防止污染。
- 使用 250 μL 气密玻璃注射器，将 100 μL 试剂级氯仿转移至该玻璃小瓶中。
- 使用 100 μL 气密玻璃注射器，向同一玻璃小瓶中加入 30 μL 试剂级甲醇。
- 为配制 2 mM 7:1.5:1.5 的磷脂酰胆碱（POPC）: 磷脂酰乙醇胺（POPE）: 胆固醇脂质溶液，将 216 μL 的 10 mg/mL POPC、42 μL 的 10 mg/mL POPE 和 20 μL 的 11 mg/mL 胆固醇 CHCl3 溶液转移至 20 mL 玻璃小瓶中。
- 使用缓慢流动的氩气或氮气蒸发有机溶剂，直至在小瓶底部观察到一层脂质薄膜。
- 将未加盖的玻璃小瓶置于真空干燥器中至少 30 分钟，以去除残留溶剂。
- 将 2 mL 已通过 0.2 微米滤膜过滤的缓冲液转移至玻璃小瓶中，以水合脂质。
- 将混合物在 4 °C 下孵育过夜，并在 48 小时内使用。
2. 冻融法：仅适用于30 - 100 nm粒径的脂质体
- 将脂质体悬液在液氮中冷冻15秒。
- 将脂质体悬液置于42 °C的加热块中解冻，....
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讨论
使用 Avestin Liposofast LF-50 挤出仪，我们展示了如何通过压力控制体系制备小尺寸的合成脂质体。需要注意的是，脂质体水合后会自发形成多层囊泡，这可能导致产生更小的纳米颗粒。这些小型多层囊泡不可避免地会通过较大的聚碳酸酯膜孔径，从而导致使用大孔径滤膜制备的单层囊泡溶液出现异质性。因此，建议在使用较大孔径（例如上文所述的 400 nm 直径孔径，氮气压力为 25 psi）时降低氮气流压力，以使脂质有足够时间融合并延展成更大的囊泡，从而提高溶液的均一性。对于直径小于<100 nm 的脂质体，则需施加高压（例如上文所述的 30 nm 和 100 nm 孔径使用 400–500 psi），以实现快速挤出，提高脂质包封效率和粒径均一性。
为确保脂质体的制备准确且可重复，建议采取几个关键步骤。采用所述方法进行挤出时，最好使用至少 3.0 mL 的样品体积来制备囊泡。当脂质浓度高于 2 mM 时，若要获得直径 > 500 psi 的样品，需使用更高的氮气压力（<100 nm），但应注意，该压力已超出仪器的最高限值，操作时应格外谨慎。建议将样品反复通过挤出器滤.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到了霍华德·休斯医学研究所（HHMI）协作创新奖的支持。L. A. M. 得到了美国国立卫生研究院信号转导与细胞调控培训基金（T32 GM008759）以及 NIH 露丝·L·柯什斯坦博士前研究员基金（CA165349-01）的支持。我们谨向 Michael Stowell 教授（科罗拉多大学博尔德分校）、Douglas Rees 教授和 Rob Phillips 教授（加州理工学院）致以诚挚感谢，感谢他们提供的宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% 稳定剂 |
| 高纯度甲醇 | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 挤出仪 | Avestin, Inc. | ||
| 磷脂 | Avanti Polar Lipids | ||
| 聚碳酸酯滤膜孔 | Avestin, Inc. | 25 mm 直径 | |
| 排水盘 PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm 直径 |
参考文献
- Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H.
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