本文描述了一种快速研究抗体在细胞内环境中对分子机制的相互作用及其影响的方法。该方法利用基于脂质配方的非共价复合物形成，将抗体转染至活细胞中。该技术可适用于永生化细胞系和原代细胞。
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摘要
摘要
抗体能够帮助人们深入了解生物系统中发生的各种事件。针对特定蛋白质产生高特异性抗体的能力，使得科学家能够精确地回答一系列生物学问题。尤为重要的是，抗体已被证实参与多种人类疾病的发生发展过程，包括系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）、副肿瘤综合征、多发性硬化症（MS）以及人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）相关的脊髓病/热带痉挛性截瘫（HAM/TSP）1-9。抗体如何致病是当前持续研究的领域，相关数据表明，抗体与多种细胞内分子之间的相互作用可导致炎症反应、细胞信号传导异常以及细胞凋亡10。已有研究显示，多发性硬化症（MS）和HAM/TSP患者体内可产生针对细胞内RNA结合蛋白——异质性核糖核蛋白A1（hnRNP A1）的自身抗体3, 5-7, 9, 11。近期的研究数据进一步表明，针对神经元内蛋白和细胞表面抗原的抗体均具有致病性3, 5-9, 11。因此，建立一种可用于研究细胞内抗体与蛋白质相互作用的实验方法，将有助于深入揭示这些疾病的发病机制。
基因通常可被转染到原代细胞和培养的细胞系中，然而抗体的转染却因抗体结构的改变或转染效率低下而受到阻碍12。其他转染方法包括基于阳离子脂质体（由DOTAP/DOPE组成）和聚乙烯亚胺（PEI）的抗体转染；这两种方法与对照组相比，抗体转染效率均下降了十倍12。我们研究中采用的方法类似于阳离子脂质介导的方法，利用基于脂质的机制通过静电和疏水相互作用与抗体形成非共价复合物13。我们使用了Ab-DeliverIN试剂，这是一种可通过非共价的静电和疏水相互作用捕获抗体并将其递送至细胞内的脂质制剂。因此，无需化学或基因偶联即可将功能性抗体递送至活细胞内。该方法使我们能够开展多种抗体示踪和蛋白质定位实验，以及分析细胞内抗体与蛋白质相互作用所产生的分子效应9。
在本实验方案中，我们将展示如何快速、可重复且高效地将抗体转染至神经元中。以抗-hnRNP A1 抗体和抗-IgG 抗体为例进行说明。为了便于定量转染效率，我们使用了 Atto-550-NHS 标记的抗-hnRNP A1 抗体以及 FITC 标记的 IgG 抗体。Atto550 NHS 是一种新型荧光标记物，具有高摩尔吸光系数和量子产率。Atto550 的激发光源和荧光滤光片与 Cy3（激发波长 556 nm，发射波长 578 nm）相似。此外，Atto550 具有良好的光稳定性。使用 FITC 标记的 IgG 作为对照，以证明该方法具有通用性，且不依赖于特定荧光染料。该方法及其所产生的数据将有助于理解针对细胞内靶抗原的抗体在人类疾病发病机制中可能发挥的作用。
方案
1. 抗体标记（图1）
- 配制 0.1 M NaHCO3 缓冲液：
- 8.4 g NaHCO3
- 29.2 g NaCl
- 1 升 H2O
- 用以下溶液将缓冲液调至 pH 8.4（10.6 g Na2CO3，29.2 g NaCl，1 升 H2O）。
- 在 70 μl 抗 hnRNPA1 抗体和 500 μl NaHCO3 缓冲液中加入 35 μl Atto550 NHS，室温下旋转孵育 1 小时。孵育结束后，将混合物注入透析装置，并在 2 升 PBS 中透析过夜。
- 次日，使用离心柱（Amicon Ultra 0.5）浓缩透析后的 Atto550 NHS 标记抗 hnRNPA1 抗体。
- Atto550 NHS 标记的抗 hnRNPA1 抗体浓缩后，使用 NanoDrop 测定样品浓度。
2. 抗体转染（图2）
- 转染前24小时，在8孔板中每孔接种105个细胞，加入500 μl含DMEM/F12培养基（含10% FBS和1%抗生素），细胞融合度应至少达到70%。
- 接种后24小时，将2 μl Ab-DeliverIN试剂加入一个Eppendorf管中。
- 随后，向同一Eppendorf管中加入2 μg Atto550 NHS标记的抗hnRNPA1抗体（0.5 μg/μl），室温孵育10–15分钟。
- 孵育期间，吸除细胞培养液，并向每孔加入394 μl新鲜DMEM培养基。
注意：向未处理细胞的一个孔中加入 500 μl DMEM 作为对照。
- 孵育后，向抗体混合物中加入 100 μl DMEM，用移液器吹打混匀，然后加入到含细胞的 DMEM 中，总体积为 500 μl。
- 抗体递送 48 小时后更换培养基。
注意：使用FITC标记的rIgG作为阳性对照重复该实验方案。
3. 活细胞与固定成像以确定效率
- 使用荧光显微镜上的 Cy3 滤光片在 48 小时时对转染了 Atto550 NHS 标记抗体的细胞进行活细胞成像。
- 完成活细胞成像后，吸除培养基并固定细胞。
- 吸除培养基后，用 0.4% 多聚甲醛在室温下处理细胞 15 分钟。用 PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 4 次。然后使用含 DAPI 试剂的封片液封片，并固定盖玻片。使用 Axiovision 软件测定固定细胞的转染效率。若无 Axiovision 软件，可手动统计图像中的事件数，并将结果代入 3.7 中的计算公式。或者，也可使用 ImageJ 软件进行此类计算。
- 首先，使用“Events”测量功能在 20 倍放大倍数下统计所选图像中细胞的总数。
- 接着，在同一张 20 倍放大倍数的图像中，使用“Events”测量功能统计未成功转染抗体的细胞数量。
- 要以类似 Excel 表格的格式查看测量得到的“Events”数据，请点击“Properties”，选择“Measurement”选项卡，然后点击“As Table”进行查看。
- 最后，通过比较前述两次测量得到的事件数，使用以下公式计算转染效率：((总细胞数 - 未转染细胞数) / 总细胞数) × 100 = 转染效率。
4. 代表性结果
未转染（图3A）与转染后（图3B）神经元的活体图像对比显示，抗体标记（每张图中为红色或绿色）在细胞内清晰可见（图3B、C、D）。在通过灌注并用培养基清洗以去除细胞间或附着于细胞表面的抗体后，神经元内仍可观察到标记的抗体（图3C、D）。为计算转染效率，可使用Axiovision软件统计总细胞数与未成功转染的细胞数。将这些数值代入转染效率计算公式，即可获得转染效率占总细胞数的百分比（图4）。
图 1. 使用 Atto 550 NHS 酯标记抗体的流程示意图，以及浓缩标记抗体所需的后续步骤。点击此处查看大图。
图2. 将标记抗体转染入培养中活细胞所用步骤的流程图。点击此处查看大图。
图 3. 转染后 48 小时的转染神经元的活细胞图像。
图 4. 固定并洗涤后的图像，通过计数事件以确定转染效率。
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讨论
为了验证关于特定分子及其表达的假设，通常将基因和其他载体转染到细胞中。该方法的独特之处在于能够轻松地将抗体转染入靶细胞。我们共进行了五次独立实验，每次实验均设置重复。各实验的转染效率结果相似。重要的是，该方法能够在不改变抗体结构或功能的前提下，使抗体进入细胞内部。此外，通过活神经元的荧光显微镜观察，可以确定转染效率，通常超过55%。这使得研究人员能够直接验证目标抗体与其细胞内靶点之间相互作用的相关假设。尽管本研究未涉及，但也可使用Fab片段。此外，还可设计实验来探究培养条件的改变（例如添加炎性细胞因子）是否会影响细胞内靶点的表达或定位。
抗体如何靶向细胞内抗原仍是当前研究的热点领域。主流理论认为，在细胞损伤后，细胞内抗原暴露于适应性免疫应答中，从而促使机体产生针对该抗原的抗体。系统性红斑狼疮（SLE）患者对异质性胞核核糖核蛋白（hnRNP）的抗体反应即为这一机制的例证。SLE患者可产生针对hnRNP P2的抗体；当靶细胞发生凋亡时，hnRNP P2被转运至细胞表面，从而可被免疫系统识别并引发自身免疫反应。 14这一点在神经系统疾病中也得到了证实，研究表明只有...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由退伍军人事务部研究与发展办公室医学研究服务处资助。本研究由退伍军人事务部优异奖（授予 MCL）和田纳西大学健康科学中心多发性硬化研究基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 荧光显微镜 AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision 版本 4.2 | Zeiss | ||
| 抗人 hnRNPA1 抗体 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC 标记的抗兔 IgG 抗体 | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS 酯 | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 培养基（含 10% FBS 和 1% 抗生素） | Gibco | 11320-033 | |
| 多聚-D-赖氨酸 8 孔培养载玻片 | BD | 354632 | |
| 多功能旋转仪 | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI 封片介质 | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| 透析装置 | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| 多聚甲醛（4% 溶液） | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
参考文献
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