一种低死亡率的大鼠模型用于评估实验性蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛

摘要

动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）是指动脉瘤破裂后血液流入蛛网膜下腔所引起的出血。尽管由于治疗手段的不断改进，该疾病的发病率和死亡率已呈下降趋势，但蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的风险仍与数年前持平。自1979年Barry et al. 首次在实验性脑血管痉挛模型中使用大鼠以来，建立一种全面且可重复的动物模型以识别脑血管痉挛的启动事件，一直是研究的重点。早期在大鼠中的研究表明，向小脑延髓池单次注射自体血可导致急性（数分钟内发生）但不会引起迟发性脑血管痉挛^{3, 6, 14}。本文中，我们描述了一种低死亡率的SAH大鼠模型，该模型可产生可重复的迟发性脑血管痉挛。

摘要

目的：建立并表征一种可重复的大鼠动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）后迟发性脑血管痉挛模型，以识别其起始事件、病理生理变化及潜在的治疗靶点。

方法：将28只雄性Sprague-Dawley大鼠（250–300 g）随机分为两组——蛛网膜下腔出血组（SAH组）或生理盐水对照组。SAH组（n=15）通过向枕大池内间隔48小时两次注射自体血来诱导蛛网膜下腔出血。同样，生理盐水对照组（n=13）大鼠则向枕大池注射等量生理盐水。在第二次注射血液后的第5天处死大鼠，取出脑组织用于组织学分析。使用NIH Image-J软件测量基底动脉横切面的管腔内截面积，以评估血管痉挛程度。统计学显著性采用Tukey/Kramer检验进行分析。

结果：组织学切片分析显示，SAH组的基底动脉管腔横截面积小于生理盐水组，符合前者存在脑血管痉挛的表现。在SAH组中，第二次注血后第5天（即首次注血后第7天）的基底动脉内径面积（0.056 μm ± 3）显著小于生理盐水对照组的内径面积（0.069 ± 3；p=0.004）。未发生因脑血管痉挛导致的死亡病例。

结论：大鼠双次蛛网膜下腔出血模型可诱导出轻度且可存活的基底动脉血管痉挛，可用于在小型动物模型中研究脑血管痉挛的病理生理机制。低且可接受的死亡率是理想蛛网膜下腔出血动物模型的重要标准，以确保能够阐明血管痉挛的机制^{7, 8}。该模型可进一步改进，以调节血管痉挛的严重程度和神经学检查指标。

方案

1. 向大鼠注射0.15 ml自体动脉血以建立蛛网膜下腔出血模型的手术操作

1. 使用0.1 mg/kg的氯胺酮/赛拉嗪啮齿类动物混合麻醉剂对大鼠进行麻醉，并静置5分钟。
2. 通过观察后肢反射减弱确认麻醉效果充分。
3. 使用电动剃毛器剃除枕下区域从颈部至鼻部周围的毛发。
4. 将动物仰卧位固定于手术台上，并用聚维酮碘擦拭尾巴，以确保切口无菌。
5. 在尾巴腹侧做一条1 cm长的正中直线切口。
6. 继续解剖直至识别并分离尾动脉。
7. 使用无菌的26号导管穿刺尾动脉，并从动脉中抽取0.15 ml血液至注射器中。
8. 在使用兽用粘合剂封闭切口前，用无菌纱布包裹切口以确保止血。
9. 将大鼠翻转为俯卧位，用聚维酮碘擦拭枕下区域已剃毛的部位。
10. 通过一条垂直正中切口进入小脑延髓池。
11. 一旦定位准确，将25号针头插入小脑延髓池，并抽取0.15 ml脑脊液至注射器中，以避免注入自体血量时颅内压升高。
12. 随后，将从尾动脉抽取的0.15 ml血液缓慢注入小脑延髓池。
13. 针头留置30秒，以确保血液在蛛网膜下腔形成凝块，然后小心拔出。
14. 确认止血完全后，使用缝合钉合器关闭切口。
15. 将动物置于俯卧位，在加热板上保持头部向下倾斜20°体位20分钟，以促进基底动脉周围脑池内血液凝固。
16. 在第二次手术中，间隔48小时，重复步骤1.1至1.15。

2. 注射0.15 ml生理盐水的大鼠SAH模型手术

1. 使用 0.1 mg/kg 的氯胺酮/赛拉嗪啮齿类动物混合制剂对大鼠进行麻醉，并静置 5 分钟。
2. 通过观察后肢反射减弱确认麻醉效果充分。
3. 使用电动剃须刀剃除枕下区域从颈部至鼻部周围的一片毛发。
4. 将动物仰卧位固定于手术台上，并用聚维酮碘擦拭尾部，以确保切口无菌。
5. 在尾部腹侧做一条 1 cm 长的正中直线切口。
6. 逐层分离组织，直至识别并游离出尾动脉。
7. 使用无菌的 26 号导管穿刺尾动脉，并用注射器抽取 0.15 ml 动脉血。
8. 在使用兽用粘合剂封闭切口前，用无菌纱布包裹切口以确保止血完全。
9. 将大鼠翻转为俯卧位，并用聚维酮碘涂抹枕下区域已剃毛的部位。
10. 采用垂直正中切口，暴露小脑延髓池。
11. 一旦定位成功，将 25 号针头插入小脑延髓池，用注射器缓慢抽取 0.15 ml 脑脊液，并妥善保存样本。
12. 随后，将 0.15 ml 的生理盐水（37 °C）缓慢注入小脑延髓池。
13. 针头留置 30 秒后，小心拔出。
14. 确认止血完全后，使用缝合钉合器关闭切口。
15. 将动物置于加热板上，保持俯卧位及头部向下倾斜 20°，持续 20 分钟。
16. 在第二次手术中，于 48 小时后重复步骤 2.1 至 2.15。

3. 大鼠处死

1. 第二次手术后的第5天，通过心脏灌注处死大鼠。
2. 给予大鼠致死剂量的Fatal Plus（VORTECH PHARMACEUTICALS LTD., DEARBORN, MI），剂量为0.2 ml/kg。
3. 作垂直正中切口进入腹腔，并打开腹膜。
4. 行前侧开胸术，暴露心脏。
5. 使用连接磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，37 °C）的26号导管，先将动物血液排空，随后用4%多聚甲醛进行灌注。
6. 确认灌注充分后，停止灌注，将大鼠转移至断头台。
7. 断头后，使用骨钳去除颅骨以取出脑组织。
8. 小心取出脑和脑干，放入4%多聚甲醛溶液中，在4 °C下固定48小时。

4. 制备切片以评估血管痉挛

1. 已浸入30%蔗糖溶液中4天的大鼠脑组织被移至冰冻切片机进行切片。
2. 经冷冻保护后，使用冰冻切片机切出12 μM厚的切片，以小脑前下动脉（AICA）作为起始点，以确保不同个体间的切片位置一致。
3. 每只动物制备20个切片，至小脑上动脉（SCA）处结束。
4. 将切片置于玻璃载片上，采用组织学方法评估血管痉挛情况。

结果

在上述方案中，我们发现若干步骤需要对模型进行比以往文献所描述更为详尽的表征。本文重点阐述为建立可重复、低死亡率的脑血管痉挛小型动物模型所必需的关键步骤，并避免因操作不当而可能导致的该模型相关潜在问题。

1. 从尾动脉采集自体血：

在模型中，将套管针准确置入尾动脉是至关重要的第一步。图-1显示了在大鼠尾动脉中置入26号套管针的位置。此位置示例表明操作创伤小、失血量少。通过良好的回血情况可确认套管针位置正确。

2. 自体血液注入大池：

深入分离枕下区域，直至观察到枕寰膜呈现为一层有光泽的白色膜状结构（图-2）。通过使用25号针头穿刺该膜，进入小脑延髓池。拔出针头后，应观察是否有血液积聚，以确保足量的自体血保留在小脑延髓池的蛛网膜下腔内。血液在枕寰膜外表面过度积聚是不可取的，因为本模型使用的自体血量相对较少（0.15 ml），相较于现有模型，若血液外渗则可能导致进入蛛...

讨论

灵长类动物的基因组成和解剖特征与人类更为相似，相较于啮齿类动物，能更真实地模拟迟发性脑血管痉挛的发生过程，并且更容易进行无创影像学检查（如磁共振成像和血管造影）以监测动脉变化⁸。然而，灵长类动物模型成本高昂，且在饲养管理和伦理方面面临更为复杂的问题，相比小型动物模型更具挑战性。以往建立的小型动物蛛网膜下腔出血（SAH）模型主要采用三种诱导方法：1）经血管内穿刺颅内动脉，使血液流入蛛网膜下腔并在受损动脉周围积聚；2）手术暴露动脉后局部注射自体血凝块；3）将血液（自体或供体）直接注入蛛网膜下腔⁸。每种模型各有优缺点。例如，血管内穿刺模型最接近动脉瘤破裂的自然过程，但伴随极高的死亡率和早期血管痉挛；而手术暴露法具有人为干预成分，无法真实再现人类动脉瘤性SAH的典型发病过程。我们在此描述的直接注射模型相比血管内穿刺模型具有较低的死亡率，且比开放手术模型更接近人类SAH的病理状态。尽管此前已有类似模型的报道，但我们在SAH模型构建过程中经历了较长的学习曲线，原因是该模型在操作细节上可能引发的并发症此前并未得到充分描述。我们的目的是更清晰地界定这些潜在的技术陷阱，以便后续研究者能够更顺利地应用这一可重复的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
雄性SD大鼠（250-300 g）	Taconic	SD-M
26 G导管	Webster	8416683
25 G针头	Buffalo	305122
1 cc注射器	Central stores	54245
氯胺酮/赛拉嗪混合液	动物护理中心（SUNY）*	-
聚维酮碘	Central stores	51458
蔗糖	Sigma	S9378-1kg
多聚甲醛	Sigma	P6148-500G
磷酸盐缓冲液	Fisher	BP-399-4
手术台	Harvard	PY2 72-2590
OCT包埋剂（冷冻保护）	VWR	25608-930
Superfrost载玻片	Fisher	12-550-15
* 由纽约州立大学上州医科大学实验动物护理部合成。将1 cc [100 mg/ml] 赛拉嗪加入10 ml [100 mg/ml] 氯胺酮中。